2 Methodik

2.1 Probanden

▼ 14 

Es wurden insgesamt 42 gesunde Freiwillige (18 Männer und 24 Frauen) im Alter von 21 bis 37 Jahren (27 ± 3) und einem BMI von 19 bis 27 kg/m2 (22 ± 3) untersucht. Im Rahmen der Screeninguntersuchung wurde eine ausführliche Anamnese erhoben. Es wurden nur Nichtraucher/innen in die Studien eingeschlossen, da Rauchen die Noradrenalin-Plasmakonzentration erhöhen kann (67). Frauen wurden grundsätzlich nur in der ersten Zyklushälfte untersucht, um mögliche Effekte des Hormonspiegels auf die Lipolyse zu standardisieren (68). Die Probanden wurden ausführlich über Hintergründe und mögliche Risiken der entsprechenden Studie aufgeklärt. Alle Versuchspersonen gaben ihr schriftliches Einverständnis zur entsprechenden Studie. Alle Teilversuche wurden durch die zuständigen Ethikkommissionen genehmigt.

Die Probanden wurden gebeten, zwei Tage vor den Versuchstagen nicht intensiv Sport zu treiben und keine koffeinhaltigen Nahrungsmittel (Schokolade, Tee, Kaffee) sowie keinen Alkohol zu sich zu nehmen Alle Versuche begannen morgens zwischen 8 und 10 Uhr nach einer ca. 15-stündigen Nahrungskarenz.

2.2 Bestimmung der Hautfaltendicke

Die Variabilität in der Dicke der Hautfalte beruht hauptsächlich auf Unterschiede in der Dicke des subkutanen Fettgewebes (59). Die Hautfaltendicke der Probanden wurde in der vorliegenden Arbeit mittels Caliper-Technik bestimmt (69). Der in dieser Arbeit verwendete Caliper (Lange´s Skin Fold Caliper; Beta Technology Incorporated, Cambridge, MD, USA) hat einen Meßbereich von 0-60 mm und Ablesegenauigkeit von 1 mm. Unabhängig vom Öffnungswinkel der beiden beweglichen Meßschenkel wird ein Meßdruck von 10g/mm2 ausgeübt. Die Messung wurde an einer Hautfalte in der Mitte der Verbindungslinie Umbilicus-Crista iliaca, 5 cm vom Nabelentfernt, durchgeführt. Dazu wurde im Verlauf der genannten Linie eine doppelte Schicht aus Haut und subkutanem Fettgewebe von der Muskulatur abgehoben. Die Dicke der so entstandenen Hautfalte wurde dreimal nacheinander bestimmt und daraus der Mittelwert gebildet.

2.3 Mikrodialysetechnik

2.3.1  Aufbau des Mikrodialyse-Systems

▼ 15 

Kernstück der Methode ist eine lineare, flexible Sonde, die über eine Distanz von einigen Zentimetern semipermeabel ist. Implantiert man eine solche Sonde in ein Gewebe und perfundiert diese mit einer Trägerflüssigkeit, so können durch die semipermeable Membran verschiedene Moleküle entprechend der Richtung des jeweiligen Konzentrationsgradienten zwischen interstieller Flüssigkeit und Perfusionslösung diffundieren (passive Diffusion). In dieser Arbeit wurden doppellumige, konzentrische Mikrodialyse-Sonden (CMA/60, CMA/Microdialysis AB, Solna, Schweden) mit einer Membranlänge von 30 mm und einem Durchmesser von 0,6 mm verwendet (Abb. 4).

Abb.4: Schematische Darstellung einer doppel-lumigen Mikrodialyse-Sonde

Der molekulare „Cut-Off“ dieser Sonde beträgt 20.000 Dalton, d.h. bis zu diesem Molekulargewicht können Moleküle zwischen Perfusat und Interstitium frei hin und her diffundieren (Tab. 1). Größere Moleküle wie Proteine gelangen nicht durch die Membran, so daß die Proben nicht durch Enzyme degradiert werden können.

▼ 16 

Tab. 1: Molekulargewicht ausgewählter Moleküle (in Dalton)

Ethanol

44

Noradrenalin

169

Harnstoff

60

Isoproterenol hydrochlorid

248

Lactat

90

Propranolol hydrochlorid

296

Glycerol

92

Angiotensin II

1184

Tyramin hydrochlorid

174

Lipase

47000

Glucose

180

Albumin

66248

Mit einer Mikroperfusionspumpe (CMA/102, CMA/Microdialysis AB, Solna, Schweden) wurde das Perfusat bei einer Flußrate von 2 µl/min durch die Sonde befördert. Die entstehenden Dialysate wurden in speziellen, geschlossenen Gefäßen (Microvials; CMA/Microdialysis AB, Solna, Schweden) gesammelt. Ein Beispiel für einen Versuchsaufbau eines Mikrodialyse-Versuches ist in Abb.5 dargestellt.

▼ 17 

Abb. 5: Proband mit implantierten Mikrodialysesonden im Fettgewebe

2.3.2 Implantation der Sonden

Für die Implantation der Sonde in das subkutane Fettgewebe wurde zunächst ca. 10 cm seitlich des Bauchnabels auf ein ca. 6 x 6 cm großes Hautareal ein Oberflächen-Anästhetikum (EMLA, Astra Zeneka GmbH, Wedel) mit dem Wirkstoff Lidocain aufgetragen. Die Einwirkzeit betrug ca. 30 min. Anschließend wurde das Hautareal mittels CutaseptF (Bode Chemie Hamburg, Hamburg) zweimal desinfiziert. Danach wurde eine Hautfalte gebildet und die Haut in etwa der Mitte des Areals mittels einer sterilen Nadel punktiert. Nun wurde die Führungskanüle mit der Sonde (Abb. 6A) zunächst ca. 1 cm senkrecht durch die Punktionsstelle, dann abgeflacht und parallel zur Hautoberfläche in das Fettgewebe vorgeschoben (Abb. 6B). Der Flügel der Sonde wurde senkrecht um etwa 2 mm angehoben und gleichzeitig die Führungskanüle aus dem Fettgewebe gezogen (Abb. 6C). Die Sonde konnte dann an die Mikroperfusionspumpe angeschlossen werden.

▼ 18 

Abb. 6: Implantation der Mikrodialyse-Sonde in das abdominale subkutane Fettgewebe (Erklärungen siehe Text)

Für die Implantation der Sonde in den Skelettmuskel wurde zunächst die Mitte des rechten M. quadrceps femoris, vastus lateralis lokalisiert. Dazu wurde die Distanz zwischen Spina iliaca anterior superior und oberem Rand der Patella ausgemessen und die Grenze zwischen mittlerem und unterem Drittel dieser Strecke markiert. Etwa 4-6 cm seitlich dieses Punktes wurde eine weitere Markierung gesetzt. Durch leichtes Anspannen des Muskels konnte die Lage dieses Punktes in der Mitte des Muskelbauches noch einmal verifiziert werden. Danach wurde in einem Radius von ca. 8 cm um diesen Punkt das entprechende Hautareal mittels CutaseptF (Bode Chemie Hamburg, Hamburg) zweimal desinfiziert. Dann wurden ca. 2 ml eines Lokalanästhetikums (Xylocitin 1%, Jenapharm GmbH & Co. KG, Jena, Deutschland) sowohl subkutan als auch intramuskulär injiziert. Am seitlichen Markierungspunkt wurde die Haut dann mittels einer sterilen Nadel punktiert. Anschließend wurde die Führungskanüle mit der Sonde zunächst ca. 1 cm senkrecht durch die Punktionsstelle, dann in einem Winkel von 45° zur Oberfläche in Richtung Mitte der Kniescheibe in den Muskel vorgeschoben. Der Flügel der Sonde wurde nun vorsichtig senkrecht um etwa 2 mm angehoben und gleichzeitig die Führungskanüle aus dem Muskel gezogen. Dann wurde auch diese Sonde an das Perfusionssystem angeschlossen. Nach Prüfung der Funktionstüchtigkeit der Sonden wurden diese steril abgedeckt.

2.3.3 Experimentelle Protokolle

In allen Teilstudien wurde das Gewebe zur Untersuchung des Stoffwechsels und der Durchblutung im Grundzustand zunächst mit Ringer-Lösung (Serumwerk Bernburg AG, Bernburg) unter Zusatz von 50 mM Ethanol (Alkohol-Konzentrat 95%, B. Braun Melsungen AG, Melsungen) und 5 µM Ascorbat (Cebion; Merck Selbstmedikation GmbH, Darmstadt) über 60 min perfundiert.

▼ 19 

Tyramin, ein indirekt wirkendes Sympathomimetikum, wurde zur Charakterisierung der Funktion postganglionärer adrenerger Neurone verwendet. Es wird aktiv in die sympathischen Nervenendigungen aufgenommen und fördert die Freisetzung von Noradrenalin aus den sympathischen Neuronen (13). In einer Mikrodialysestudie an der Ratte führte der Zusatz von Tyramin in den auch in dieser Studie verwendeten Dosen zu einem 10-fachen Anstieg der interstitiellen Konzentration von Noradrenalin in Fettgewebe und Skelettmuskel (64). Dabei blieben die arteriellen Plasma-Spiegel von Noradrenalin unbeeinflußt. Die Wirkung des Tyramins wurde mit Isoproterenol, einem direkten Sympathomimetikum, das unspezifisch an β-Adrenozeptoren bindet, verglichen (16).

Die Noradrenalinfreisetzung wurde in vier einzelnen Teilstudien untersucht:

In der ersten Teilstudie wurde das Fettgewebe von 16 (8 Frauen, 8 Männer) bzw. der Skelettmuskel von 8 weiteren Probanden (8 Männer) mit steigenden Konzentrationen an Tyramin (Sonde 1) oder Isoproterenol (Sonde 2) (Tab. 2).

▼ 20 

Tab. 2: Mikrodialyseprotokoll für die erste Teilstudie

Probe

Sonde 1

Sonde 2

1 bis 3

Basallinie

Basallinie

4 bis 6

0,35 mM Tyramin

0,01 µM Isoproterenol

7 bis 9

3,5 mM Tyramin

0,1 µM Isoproterenol

10 bis 12

35 mM Tyramin

1 µM Isoproterenol

13 bis 15

350 mM Tyramin

10 µM Isoproterenol

Probe 1: Laufzeit 30 min; Probe 2 bis 15: Laufzeit 15 min

In der zweiten Teilstudie wurde das Fettgewebe von 5 Probanden (3 Frauen, 2 Männer) mit steigenden Konzentrationen an Tyramin (Sonde 1) oder zusätzlich mit dem β-Adrenozeptor-Blocker Propranolol (Sonde 2) perfundiert (Tab.3). Damit sollte geprüft werden, ob der β-Adrenozeptor in die tyramin-induzierte Lipolyse involviert ist.

▼ 21 

Tab. 3: Mikrodialyseprotokoll für die zweite Teilstudie

Probe

Sonde 1

Sonde 2

1 bis 3

Basallinie

Basallinie

4 bis 6

0,35 mM Tyramin

0,35 mM Tyramin + 100 µM Propranolol

7 bis 9

3,5 mM Tyramin

3,5 mM Tyramin + 100 µM Propranolol

10 bis 12

35 mM Tyramin

35 mM Tyramin + 100 µM Propranolol

13 bis 15

350 mM Tyramin

350 mM Tyramin + 100 µM Propranolol

Probe 1: Laufzeit 30 min; Probe 2 bis 15: Laufzeit 15 min

In der dritten Teilstudie wurde das Fettgewebe von 5 weiteren Probanden (3 Frauen, 2 Männer) mit steigenden Konzentrationen an Isoproterenol (Sonde 1) oder zusätzlich mit dem β-Adrenozeptor-Blocker Propranolol (Sonde 2) (Tab. 4). Dieser Versuch diente dazu, die Effektivität des β-Adrenozeptor-Blockers im Fettgewebe zu prüfen.

▼ 22 

Tab. 4: Mikrodialyseprotokoll für die dritte Teilstudie

Probe

Sonde 1

Sonde 2

1 bis 3

Basallinie

Basallinie

4 bis 6

0,01 µM Isoproterenol

0,01 µM Isoproterenol + 100 µM Propranolol

7 bis 9

0,1 µM Isoproterenol

0,1 µM Isoproterenol + 100 µM Propranolol

10 bis 12

1 µM Isoproterenol

1 µM Isoproterenol + 100 µM Propranolol

13 bis 15

10 µM Isoproterenol

10 µM Isoproterenol + 100 µM Propranolol

Probe 1: Laufzeit 30 min; Probe 2 bis 15: Laufzeit 15 min

In der vierten Teilstudie wurde das Fettgewebe von 5 weiteren Probanden (3 Frauen, 2 Männern) mit steigenden Konzentrationen an Dopamin (Sonde 1) oder zusätzlich mit dem β-Adrenozeptor-Blocker Propranolol (Sonde 2) perfundiert (Tab. 5). Tyramin in wässriger Lösung kann zu etwa 1% mit Dopamin kontaminiert sein (63,70,71). In der vorliegenden Arbeit wurde lyophilisiertes Tyramin verwendet und die Verdünnungslösungen wurden kurz vor Beginn jeden Versuches frisch hergestellt, um diesen Oxidationsvorgang zu vermeiden. Außerdem wurde dem Perfusat das Antioxidanz Ascorbat zugesetzt. Um tatsächlich auszuschließen, daß die Effekte des Tyramins auf eine Dopamin-Kontamination zurückzuführen sind, wurde zusätzlich die Wirkung von Dopamin im Fettgewebe geprüft. So zeigten sich in tierexperimentellen Studien Effekte von Dopamin auf Stoffwechsel und Durchblutung des Fettgewebes (72,73). Die Dopamin-Konzentrationen entsprachen in der vorliegenden Arbeit 1% der verwendeten Tyramin-Konzentrationen.

Tab. 5: Mikrodialyseprotokoll für die vierte Teilstudie

Probe

Sonde 1

Sonde 2

1 bis 3

Basallinie

Basallinie

4 bis 6

3,5 µM Dopamin

3,5 µM Dopamin + 100 µM Propranolol

7 bis 9

35 µM Dopamin

35 µM Dopamin + 100 µM Propranolol

10 bis 12

0,35 mM Dopamin

0,35 mM Dopamin + 100 µM Propranolol

13 bis 15

3,5 mM Dopamin

3,5 mM Dopamin + 100 µM Propranolol

Probe 1: Laufzeit 30 min; Probe 2 bis 15: Laufzeit 15 min

▼ 23 

Das Fettgewebe von 16 Probanden (8 Frauen, 8 Männer) bzw. der Skelettmuskel von 8 weiteren Probanden (8 Männer) wurde mit steigenden Konzentrationen an Angiotensin II perfundiert (Tab. 6).

Tab. 6: Mikrodialyseprotokoll zur Untersuchung der Wirkung von Angiotensin II

Probe

Sonde 1

1 bis 3

Basallinie

4 bis 6

0,01 µM Angiotensin II

7 bis 9

0,1 µM Angiotensin II

10 bis 12

1 µM Angiotensin II

Probe 1: Laufzeit 30 min; Probe 2 bis 12: Laufzeit 15 min

Das Fettgewebe von 16 Probanden (8 Frauen, 8 Männer) wurde mit steigenden Konzentrationen an Isoproterenol perfundiert (Tab. 7).

▼ 24 

Tab. 7: Mikrodialyseprotokoll zur Untersuchung der Rolle der Hautfaltendicke

Probe

Sonde 1

1 bis 3

Basallinie

4 bis 6

0,01 µM Isoproterenol

7 bis 9

0,1 µM Isoproterenol

10 bis 12

1 µM Isoproterenol

13 bis 15

10 µM Isoproterenol

Probe 1: Laufzeit 30 min; Probe 2 bis 12: Laufzeit 15 min

Tyramin und Angiotensin II wurden von der Firma Clinalfa AG, Läufelfingen, Deutschland; Isoproterenol (Isuprel) von Abott S.p.A., Campoverde, Italien; Dopamin (Dopamin Solvay 250 Infus C) von Solvay Arzneimittel GmbH, Hannover, Deutschland; Propranolol (Obsidan) von Alpharma-Isis GmbH & Co KG, Langenfeld, Deutschland; bezogen.

2.3.4 Marker für Veränderungen in Durchblutung und Stoffwechsel

2.3.4.1 Durchblutung

Hämodynamische Änderungen im Gewebe wurden mittels Ethanol-Dilutions-Technik erfaßt (74,75). Diese Technik wurde mittels 133Xe-Washout-Methode validiert und kann Änderungen in der lokalen Durchblutung >50% erfassen (76,77). Die 133Xe-Washout-Methode ist für die Studien der vorliegenden Arbeit nicht geeignet, da sich mit dieser Methode keine Durchblutungsänderungen in unmittelbarer Umgebung der Mikrodialyse-Sonde abschätzen lassen (8). Dem Perfusat wurden 50 mM Ethanol zugesetzt. Ein Teil des Ethanols diffundiert in das Gewebe und von dort in umliegende Blutkapillaren. Je stärker die Durchblutung im Gewebe ist, je höher ist der Ethanol-Abtransport aus dem Gewebe und um so kleiner wird die Ethanol-Konzentration im Dialysat. Eine Erniedrigung des Verhältnisses [Ethanol]Dialysat/[Ethanol]Perfusat (= Ethanol Ratio) entspricht einem Anstieg, eine Erhöhung einer Verminderung der Durchblutung.

2.3.4.2 Fettstoffwechsel

▼ 25 

Die Glycerol-Konzentration im Dialysat diente als Indikator für die Lipolyse im Fettgewebe (78). Es entsteht neben den freien Fettsäuren aus der Hydrolyse von Triacylglyceriden. Aufgrund der fehlenden Glycerokinase kann Glycerol nicht mehr zurück in Glycerinaldehyd-1-phosphat umgebaut werden und eignet sich somit zur Abschätzung der Lipolyse bzw. Lipidmobilisierung im Fettgewebe (78,79).

2.3.4.3 Kohlenhydratstoffwechsel

Glucose dient im Fettgewebe hauptsächlich der Produktion von Glycerinaldehyd-3-phosphat, welches in Glycerin-1-phosphat umgebaut wird. Glycerin-1-phosphat wird für den Aufbau von Triaclyglyceriden benötigt (14). Die Glucose-Konzentration im Dialysat ist ein Indikator für die nutritive Versorgung des Fettgewebes. Außerdem ist das Fettgewebe in der Lage, Lactat aus Glucose zu bilden (80). Die Lactat-Konzentration im Dialysat wurde daher bestimmt, um die glycolytische Aktivität des Fettgewebes abzuschätzen (80).

2.3.5 Recovery der Markermetaboliten

Bei einer Flußrate des Perfusats von 2 µl/min wird kein 100%iges Equilibrium zwischen Dialysat und Interstitium erreicht, d.h. die Konzentration eines bestimmten Metaboliten ist im Dialysat stets geringer als im Interstitium. Eine Erfassung der tatsächlichen interstitiellen Konzentration eines Metaboliten ist daher bei dieser Flußrate nicht möglich. Die Recovery ([Metabolit]Perfusat/[Metabolit]Interstitium) ist abhängig von der Flußrate, der Länge der semipermeablen Membran, dem Molekulargewicht, der Chemie der Substanz sowie der Struktur des Gewebes (81). In Vorarbeiten wurden mittels der Near-Equilibrium-Methode (Flußrate 0,3 μl/min) die relativen Recoveries für Glucose, Glycerol und Lactat in Fettgewebe und Skelettmuskulatur bestimmt (Tab. 8;82,83). Werden die Perfusions- bedingungen, wie z.B. die Flußrate, nicht verändert, bleibt auch die relative Recovery in vivo konstant (62). Die Recoveries der untersuchten Moleküle sind im Fettgewebe jedoch geringer als in der Skelettmuskulatur. Daher können nur Verlaufsänderungen in der Metabolitenkonzentration verglichen werden.

▼ 26 

Tab. 8: Recovery verschiedener Moleküle im Dialysat von Fettgewebe und Skelett- muskulatur ([Metabolit]Perfusat/[Metabolit]Interstitium)

 

Fettgewebe

Skelettmuskel

Glucose

0,29 ± 0,05

0,50 ± 0,02

Lactat

0,31 ± 0,06

0,44 ± 0,07

Pyruvat

-

0,50 ± 0,04

Glycerol

0,29 ± 0,06

0,55 ± 0,11

Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM dargestellt, n = 6.

2.3.6 Probenlagerung

Die Gefäße mit den Dialysaten wurden während des Versuches bei 4 °C gelagert und nach Versuchsende bis zur Analyse bei –20 °C eingefroren. Der für die Ethanol Bestimmung benötige Teil des Dialysates (10 µl) wurde vor dem Einfrieren in Perchlorsäure gefällt und bei 4 - 8 °C in Eppendorf-Gefäßen gelagert.

2.4 Isolierung und Inkubation der Adipocyten

Inkubationen isolierter Adipocyten wurden seit der Einführung von Rodbell 1964 für zahlreiche metabolische und pharmakologische Untersuchungen eingesetzt (84). Die für diese Arbeit verwendeten humanen Adipocyten wurden aus subkutanem Brustfettgewebe isoliert, das von gesunden Frauen erhalten wurde, die sich einer operativen Reduktion des Brustfettgewebes unterzogen haben. Die lipolytische Antwort gegenüber Noradrenalin zwischen Adipocyten aus der Brustregion und abdominalen Adipocyten unterscheidet sich bei prämenopausalen Frauen nicht (85).

2.4.1 Isolation der Adipocyten

▼ 27 

Die Isolation wurde mittels Collagenase-Digestion modifiziert nach Janke et al. durchgeführt (86). Das Fettgewebe wurde in kleine Stücke geschnitten, in HBSS gewaschen und für 5 min bei 380 g zentrifugiert. Die Gewebeteile wurden dann in einen Isolationspuffer überführt (0,7 g Gewebe/ml HBSS), der mit 25 mM HEPES, 200 µg/ml Kanamycin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 3% BSA, 0,75 mg/ml Collagenase supplementiert wurde. Anschließend erfolgte die Inkubation bei 37 °C unter leichtem Schütteln (60 bis 80 rpm) für 60 bis 90 min. Die so entstandene Zellsuspension wurde nun durch ein Siebgewebetrichter aus Polypropylen filtriert, um sie von Bindegewebsresten zu trennen. Die Adipocyten wurden dann aliquotiert und mehrmals im Inkubationspuffer (Siehe 2.4.2) gewaschen. Die Zellzahl betrug zwischen 50.000 und 100.000 Adipocyten pro ml.

2.4.2 Inkubation der Adipocyten

Die Inkubation der humanen Adipocyten wurde nach einer von Morimoto et al. beschriebenen Methode mit einigen Modifikationen durchgeführt (87). Der Inkubationspuffer (Krebs-Ringer-Puffer, Zusammensetzung: 25 mM Hepes; 118 mM NaCl; 4,8 mM KCl; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM KH2PO4; pH 7,4; alle Merck, Darmstadt) wurde mit BSA (1%, w/v; Sigma-Aldrich), Glucose (5 mM; Merck, Darmstadt) und Ascorbat (5 µM; Merck, Darmstadt) supplementiert (88). Je 400 µl des Puffers wurden dann entweder keine Substanz (Kontrolle) oder 1 µM Isoproterenol (Sigma-Aldrich, Deisenhofen) oder 0,35; 3,5; 35 bzw. 350 mM Tyramin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen) zugesetzt. Anschließend wurden 100 µl der Adipocyten aus dem Isolationsmedium entnommen und in die vorbereiteten Eppendorf-Gefäße überführt (3- bis 4-fach-Ansätze). Durch permanentes Mischen während der Entnahme sollte erreicht werden, daß sich die Zellpopulation innerhalb der Inkubationsansätze eines Probanden gleich zusammensetzt. Die Lipolyse ist von der Adipocytengröße abhängig (89,90). Die Zellgrößen wurden nicht bestimmt, da keine interindividuellen Vergleiche durchgeführt wurden. Die Ansätze wurden im Schüttelthermostaten bei 45 rpm für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Inkubation wurde dadurch beendet, daß die Eppendorf-Gefäße auf Eis gestellt wurden. Aus dem Zellunterstand wurden 350 µl Medium entnommen.

2.5 Probenaufbereitung

2.5.1 Mikrodialysate

Die Mikrodialysate waren frei von Proteinen, da diese aufgrund ihres Molekulargewichts nicht durch die Poren der Sondenmembran gelangen. Für die Bestimmung der Metaboliten mittels Analyser mußten die Mikrodialyseproben daher nicht speziell aufgearbeitet werden. Für die Bestimmung der Ethanol-Konzentration wurden, um evtl. vorhandene Peptide auszufällen, für 10 µl Dialysat 90 µl 0,33 N Perchlorsäure (Merck KgaA, Darmstadt) in Eppendorf-Gefäßen (Sarstedt, Nümbrecht) vorgelegt. Anschließend wurde die Lösung für 1 min bei 14.000 rpm zentrifugiert (Eppendorfzentrifuge 5415C; Eppendorf Hamburg).

2.5.2 Inkubationsmedien

▼ 28 

Die Inkubationsmedien enthielten im Gegensatz zu den Mikrodialysaten Protein (BSA). Die Proben wurden daher vor der Analytik mit 1 M Perchlorsäure gefällt, bei 14.000 rpm für 5 min zentrifugiert und der Überstand anschließend mit 1 M NaOH-Tris neutralisiert (pH 7,4).

2.6 Assays

2.6.1 Bestimmung der Ethanol-Konzentration

Die Ethanol-Konzentration in den Perfusaten und Dialysaten wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die Methode basiert auf einem optischen Test nach Warburg und wurde urprünglich von Bernd und Gutmann entwickelt (91). Ethanol wird durch die ADH in Anwesenheit von NAD+ zu Acetaldehyd, NADH und Protonen umgesetzt. Das Absorptionsmaximum von NADH liegt bei 340 nm, weshalb die Extinktionszunahme bei der Bildung von NADH bei dieser Wellenlänge bestimmt wurde. Die Bildung von NADH ist direkt proportional zur Ethanol-Konzentration in den Dialysaten. Das Volumen der Dialysate ist sehr klein und die Konzentration an Ethanol zudem gering, so daß die Methode entsprechend modifiziert wurde.

Für den Ethanol-Puffer wurden

▼ 29 

16,667 g tetra-Natriumdiphosphat-Decahydrat

4,167 g Semicarbacidhydrochlorid

0,833 g Glycin (alle Merck KgaA, Darmstadt)

▼ 30 

in zunächst ca. 400 ml Reinstwasser gelöst. Der pH-Wert des Puffers wurde mittels 4 M Natronlauge (Merck KgaA, Darmstadt) mit Hilfe eines pH-Meters (pH-Meter 713; Metrohm GmbH & Co, Filderstadt) auf 8,7 eingestellt. Dann wurde der Puffer mit Reinstwasser auf 500 ml aufgefüllt.

Für die NAD-Lösung wurden 50 mg NAD (Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Taufkirchen) und für die ADH-Lösung 30.000 U ADH (Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Taufkirchen) in jeweils 10 ml Reinstwasser gelöst.

Es wurden 20 µl Probe aus dem Überstand der Perchlorsäurefällung entnommen und mit 960 µl Ethanol-Puffer sowie 20 µl NAD-Lösung in ein anderes Eppendorf-Gefäß pipettiert. Um die enzymatische Reaktion zu starten, wurden 10 µl der ADH-Lösung zugegeben und die Reagenzien anschließend gut vermischt. Die Proben wurden dann in einem Schüttelthermostaten (Julabo SW-21C; Kleinfeld Labortechnik, Hannover) bei 25 °C für 70 min inkubiert. Nach der Inkubation wurde die NADH-Konzentration der Proben in einer Acrylküvette (Sarstedt, Nümbrecht) bei 340 nm photometrisch bestimmt (UV/VIS Spectrometer Lambda 2S; Perkin Elmer GmbH, Berlin). Die Ethanol-Konzentrationen der Dialysate wurde über eine Standardreihe bestimmt. Diese ging von einer Stammlösung (1000 mM) aus 59 µl absoluten 99,8%igen und 942 µl Ringer-Lösung aus (Tab. 9). Die Lösungen wurden jeweils aus den nächst höheren Konzentrationen verdünnt.

▼ 31 

Tab. 9: Pipettier-Schema für die Ethanol-Standard-Reihe

Ringer-Lösung (µl)

Vorhergehende Lösung (µl)

Konzentration (mM)

  

1000

900

100

100

500

500

50

200

800

40

250

750

30

333

667

20

500

500

10

500

500

5

500

500

2,5

500

500

1,25

500

500

0,625

500

0

0

Die Standardlösungen (je 10 µl) mit der Konzentration von 0 bis 50 mM Ethanol wurden ebenfalls mit 0,33 N Perchlorsäure gefällt und die Extinktion photometrisch bestimmt. Die Extinktionen der Proben wurden gegen die Extinktionen der Standardreihe graphisch aufgetragen und die Gleichung der Regressionsgraden ermittelt (Abb.7). Vorausgesetzt wurde ein Korrelationskoeffizient von r2 > 0,99.

▼ 32 

Abb. 7: Repräsentatives Beispiel einer Standard-Ethanol-Reihe

2.7 Bestimmung der Metaboliten-Konzentration

Der CMA 600 Mikrodialyse Analyser wurde speziell für die kleinen Volumina der Dialysate entwickelt. Die Messung mit dem Analyser (CMA Microdialysis AB, Solna, Schweden) erfordert nur 1/10 des von herkömmlichen Analysatoren benötigten Probevolumens. Sie erfolgte colourimetrisch unter Verwendung entsprechender Enzym-Reagenzien und eines Calibrators (alle CMA Microdialysis AB, Solna, Schweden) nach folgenden Prinzipien:

Glucose wird mittels Glucoseoxidase zu Gluconolactone und Wasser- stoffperoxid umgesetzt. Wasserstoffperoxid reagiert mit 4-Amino-Antipyrin und Phenol über die Peroxidase zu einem rot-violetten Farbstoff, dem Quinonimin.

▼ 33 

Lactat wird mittels Lactatoxidase zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid umgebaut. Letzteres reagiert mit 4-Amino-Antipyrin und Chlorophenol über die Peroxidase zu Quinonimin.

Glycerol wird unter Verbrauch von ATP mittels Glycerokinase zu Glycerol-3-Phosphat phosphorylisiert, welches dann in Anwesenheit der Glycerol-3-Phosphat-Oxidase oxidiert wird. Das dabei gebildete Wasserstoffperoxid reagiert in einer Peroxidase-Reaktion mit DCHBS und 4-Amino-Antipyrin zu Quinonimin.

Die Bildungsrate des Quinonimins wurde jeweils bei 546 nm bestimmt und ist proportional zur Glucose-, Lactat- bzw. Glycerolkonzentration.

▼ 34 

Harnstoff wird mittels Urease zu Ammoniumionen und CO2 hydrolisiert. Die Ammoniumionen reagieren mit 2-Oxoglutarat in Anwesenheit der GlDH und NADH zu Glutamat und NAD+ + H+. Die Bildungsrate von NADH wurde photometrisch bei 365 nm gemessen und ist proportional zur Harnstoffkonzentration.

Vor und nach jedem Probelauf wurde eine Messung mit einer Testprobe (Kalibrator:Reinstwasser, 1:5) durchgeführt, um eventuelle Abweichungen festzustellen. Die Gefäße mit den Dialysaten wurden unmittelbar vor der Messung für einige Sekunden bei ca. 4.000 rpm zentrifugiert (Eppendorfzentrifuge 5415C; Eppendorf, Hamburg), da entstehende Gasbläschen zu größeren Abweichungen führen.

2.8 Statistische Analyse

Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte dargestellt. Für die Korrelationen mit der Hautfaltendicke wurden die Daten als individuelle Einzelwerte angegeben.

▼ 35 

Intraindividuelle Unterschiede wurden mittels One-Way ANOVA für wiederholte Messungen mit anschließendem Dunnett´s Multiplen Vergleichstest verglichen. Multiple Vergleiche (Kontrolle vs. Adrenozeptor-Blockade) wurden mittels Two-way ANOVA für wiederholte Messungen mit anschließendem Bonferroni Posttest auf signifikante Unterschiede untersucht. Die Abhängigkeit der Metaboliten und der Ethanol Ratio von der Hautfaltendicke sowie der Metabolite von der Ethanol Ratio wurden mittels linearer Regressionsanalyse ermittelt (Pearson Korrelation). Für den Vergleich der Mittelwerte der Hautfaltendicke wurde der ungepaarte T-Test verwendet.

Statistische Signifikanz wurde bei einem p-Wert unter 0,05 angenommen. In den Abbildungen steht * für p<0,05; ** für p<0,01 und *** für p<0,001. Zur statistischen Auswertung und zur Erstellung der graphischen Darstellungen wurde das Statistikprogramm InStat, Version 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) benutzt.


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20.07.2006