Aus dem Franz-Volhard-Centrum für Klinische Forschung
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Charakterisierung der
lokalen Kontrolle des Stoffwechsels
und der Durchblutung
im subkutanen Fettgewebe

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum medicarum (Dr. rer. medic.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät
der Charité – Universitätsmedizin Berlin

vorgelegt von: Frauke Adams
aus Potsdam

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Jens Jordan
2. Prof. Dr. med. Alfred Wirth
3. Prof. Dr. med. Arya M. Sharma

Eingereicht: 09.08.2005

Datum der Promotion: 24.04.2006

Zusammenfassung

Das Fettgewebe dient primär der Speicherung von Energie in Form von Triacylglyceriden, die bei Bedarf mobilisiert werden. Ein wichtiger Regulator der Lipolyse ist das sympathische Nervensystem. Während zur postsynaptischen Ebene zahlreiche Studien existieren, ist über die Bedeutung präsynaptischer Faktoren (z.B. der lokalen Noradrenalin-Freisetzung) des Fettgewebes bisher wenig bekannt. Zudem synthetisiert und sezerniert das Fettgewebe Signalmoleküle, die den Fettgewebsstoffwechsel beeinflussen können, wie das Angiotensin II. Die Lipolyse hängt außerdem von der Durchblutung und der Zellularität des Gewebes ab.

Ziele dieser Arbeit waren zu prüfen, ob (I) die lokale neuronale Noradrenalinfreisetzung den Stoffwechsel und die Durchblutung im subkutanen Fettgewebe beeinflußt und dabei geschlechtsspezifische Unterschiede vorliegen, (II) lokal appliziertes Angiotensin II die Lipolyse und die Durchblutung im subkutanen Fettgewebe inhibiert und (III) Durchblutung und Stoffwechsel bereits bei Normalgewichtigen von der Dicke der subkutanen Fettschicht abhängen.

Es wurden 42 schlanke, gesunde Nichtraucher (18 Männer, 24 Frauen) mittels Mikrodialysetechnik untersucht. Das adrenerge System wurde mit Isoproterenol (direkt wirkendes Sympathomimetikum) und Tyramin (indirekt wirkendes Sympathomimetikum) charakterisiert. Mittels Ethanol-Dilutions-Technik wurden Änderungen in der lokalen Durchblutung, über die Dialysat-Konzentration von Glycerol, Glucose bzw. Lactat Änderungen in der Lipolyse, Glycolyse bzw. Glucoseversorgung der Gewebe erfaßt. Bei einigen der Probanden wurde die Hautfaltendicke mittels Caliper-Technik bestimmt.

Niedrigere Tyramin-Dosen änderten die Durchblutung nicht, erhöhten jedoch die Lipolyse im Fettgewebe. Höhere Tyramin-Dosen verminderten die Durchblutung und senkten zusätzlich die Lipolyse unter das Ausgangsniveau. Der Anstieg der Lipolyse unter den niedrigeren Tyramin-Dosen war bei den Frauen höher als bei den Männern, fiel jedoch auch unter Isoproterenol bei den Frauen höher aus.

Angiotensin II verminderte im Fettgewebe der Frauen leicht die Durchblutung und wirkte so indirekt schwach anti-lipolytisch, bei den Männern kam es zu keinen Änderungen.

Im Fettgewebe beider Geschlechter korrelierte die Hautfaltendicke negativ linear mit der basalen Durchblutung und der Lipolyse. Dabei lagen keine geschlechtsspezifischen Unterschiede vor.

Aus den Ergebnissen der Arbeit läßt sich ableiten, daß die lokale neuronale Noradrenalinfreisetzung eine wichtige Rolle in der Regulation der Lipolyse des Fettgewebes spielt und dabei der -Adrenozeptor involviert ist. Die geschlechtsspezifischen Unterschiede sind eher auf postsynaptische Faktoren zurückzuführen. Angiotensin II spielt in der Regulation der Durchblutung und der Lipolyse im Fettgewebe eine eher geringe Rolle. Die lokale Durchblutung ist bereits bei Normalgewichtigen mit zunehmender Hautfaltendicke vermindert, wodurch sowohl nutritive Versorgung als auch der Fettstoffwechsel negativ beeinflußt werden.

Eigene Schlagworte: Sympathisches Nervensystem, Lipolyse, adrenerge Rezeptoren, Hautfaltendicke

Abstract

The sympathetic nerve system is one important regulator of lipolysis. The regulatory role of neuronal transmitter release (e.g. of norepinephrine) and re-uptake in adipose tissue is only poorly understood. Furthermore, adipose tissue secretes hormones, e.g. angiotensin II (Ang II), which can affect adipose tissue lipolysis. Finally, lipolysis depends on blood flow and cellularity of adipose tissue.

Aims of this thesis were (I) to characterize the impact of local neuronal norepinephrine release on blood flow and metabolism in subcutaneous abdominal adipose tissue (SAT) and to assess possible gender effects, (II) to proof if Ang II inhibits lipolysis and blood flow in SAT, and (III) to test if SAT thickness is negatively correlated with blood flow and metabolism even in non-obese subjects.

42 lean subjects (18 men, 24 women) were studied using microdialysis technique. Tyramine (Tyr) and isoproterenol (Iso) were used to characterize adrenergic response of SAT. Dialysate [ethanol], [glycerol], [lactate], and [glucose] were measured to assess tissue blood flow (ethanol dilution technique), lipolysis, glycolysis, and nutritive supply. Skin fold thickness was taken to assess thickness of SAT.

During perfusion with lower Tyr doses, ethanol ratio remained unchanged, whereas lipolysis increased. The lipolytic response was higher in women vs. men, a gender difference was also observed for Iso-stimulated lipolysis. During perfusion with Ang II, blood flow and lipolysis decreased slightly at least in women. Skin fold thickness was negatively correlated with tissue perfusion and lipolysis without gender-specific differences.

Neuronal norepinephrine release plays an important role in the regulation of lipolysis of SAT. The gender difference is explained by a difference in postsynaptic adrenergic sensitivity. Ang II has a minimal effect on local blood flow and metabolism. Increased SAT thickness is associated with reduced tissue perfusion and lipid metabolism, even in lean subjects.

Keywords: sympathetic nervous system, lipolysis, adrenergic receptors , skin fold thickness

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Fettstoffwechsel und sympathisches Nervensystem
  • 1.2 Fettstoffwechsel und Renin-Angiotensin-System
  • 1.3 Fettstoffwechsel und Hautfaltendicke
  • 1.4 Hypothesen
• 2 Methodik
  • 2.1 Probanden
  • 2.2 Bestimmung der Hautfaltendicke
  • 2.3 Mikrodialysetechnik
    • 2.3.1  Aufbau des Mikrodialyse-Systems
    • 2.3.2 Implantation der Sonden
    • 2.3.3 Experimentelle Protokolle
    • 2.3.4 Marker für Veränderungen in Durchblutung und Stoffwechsel
      • 2.3.4.1 Durchblutung
      • 2.3.4.2 Fettstoffwechsel
      • 2.3.4.3 Kohlenhydratstoffwechsel
    • 2.3.5 Recovery der Markermetaboliten
    • 2.3.6 Probenlagerung
  • 2.4 Isolierung und Inkubation der Adipocyten
    • 2.4.1 Isolation der Adipocyten
    • 2.4.2 Inkubation der Adipocyten
  • 2.5 Probenaufbereitung
    • 2.5.1 Mikrodialysate
    • 2.5.2 Inkubationsmedien
  • 2.6 Assays
    • 2.6.1 Bestimmung der Ethanol-Konzentration
  • 2.7 Bestimmung der Metaboliten-Konzentration
  • 2.8 Statistische Analyse
• 3 Ergebnisse
  • 3.1 Validierung der Mikrodialysetechnik im subkutanen Fettgewebe
    • 3.1.1 Stabilität des Mikrodialyse-Systems
    • 3.1.2 Ethanol-Dilutions-Technik
  • 3.2 Adrenerge Regulation
    • 3.2.1 Wirkungen von Tyramin auf die Lipolyse isolierter Adipocyten
    • 3.2.2 Wirkungen von Tyramin im Fettgewebe
    • 3.2.3 Wirkungen von Isoproterenol im Fettgewebe
    • 3.2.4 Korrelation der Glycerol-Konzentrationen unter Tyramin- und Isoproterenol
    • 3.2.5  Wirkungen von Dopamin im Fettgewebe
    • 3.2.6 Wirkung von Tyramin unter β-adrenerger Blockade
    • 3.2.7 Wirkungen von Isoproterenol unter β-adrenerger Blockade
    • 3.2.8 Wirkungen von Tyramin im Skelettmuskel
    • 3.2.9 Wirkungen von Isoproterenol im Skelettmuskel
  • 3.3  Humorale Kontrolle
    • 3.3.1 Wirkungen von Angiotensin II im Fettgewebe
    • 3.3.2  Wirkungen von Angiotensin II im Skelettmuskel
  • 3.4 Einfluß der Hautfaltendicke auf Durchblutung und Stoffwechsel des subkutanen abdominalen Fettgewebes
    • 3.4.1 BMI und Hautfaltendicken der untersuchten Probanden
    • 3.4.2 Einfluß der Hautfaltendicke auf Durchblutung und Stoffwechsel unter Basalbedingungen
    • 3.4.3 Einfluß der Hautfaltendicke auf Durchblutung und Stoffwechsel unter stimulierten Bedingungen
• 4 Diskussion
  • 4.1 Neuro-hormonale Regulation
  • 4.2 Humorale Regulation
  • 4.3  Einfluß der Hautfaltendicke
  • 4.4 Diskussion der Methoden
• 5 Schlußfolgerungen und Ausblick
• 6. Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Preise
• Vorträge
• Poster
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Molekulargewicht ausgewählter Moleküle (in Dalton)
• Tab. 2: Mikrodialyseprotokoll für die erste Teilstudie
• Tab. 3: Mikrodialyseprotokoll für die zweite Teilstudie
• Tab. 4: Mikrodialyseprotokoll für die dritte Teilstudie
• Tab. 5: Mikrodialyseprotokoll für die vierte Teilstudie
• Tab. 6: Mikrodialyseprotokoll zur Untersuchung der Wirkung von Angiotensin II
• Tab. 7: Mikrodialyseprotokoll zur Untersuchung der Rolle der Hautfaltendicke
• Tab. 8: Recovery verschiedener Moleküle im Dialysat von Fettgewebe und Skelett- muskulatur ([Metabolit]_Perfusat/[Metabolit]_Interstitium)
• Tab. 9: Pipettier-Schema für die Ethanol-Standard-Reihe

Bilder

• Abb. 1: Regulation der Lipolyse im humanen Fettgewebe. α₂-AR: α₂-Adrenozeptor, β_1,2,3: β_1,2,3-Adrenozeptoren, G_i: inhibierendes G-Protein, G_s: stimulierendes G-Protein, cAMP: 3´, 5´-cyclo Adenosinmonophosphat, cGMP: 3´, 5´-cyclo Guanosin- monophosphat, PDE-3B: Phosphodiesterase 3B, PKA: Proteinkinase A, PKG: Proteinkinase G, FFS: freie Fettsäuren, HSL: Hormonsensitive Lipase, TG: Triacylglyceride. Modifiziert nach Stich und Berlan 2004.
• Abb. 2: : Neuronale Synthese, Freisetzung und Wiederaufnahme von Noradrenalin. DOPA: Dihydroxyphenylalanin, Dopamin: Dihydroxyphenylamin, α₁,₂: α_{1,2 -Adrenozeptor,} β_1,2: β_{1,2 -Adrenozeptor,} MAO: Monoaminoxidase (Weitere Erklärungen siehe Text).
• Abb. 3: Mögliche Signalkaskaden, über die Angiotensin II die Lipolyse im humanen Fettgewebe beeinflussen könnte. AGT: Angiotensinogen, Ang I und II: Angiotensin I und II, α₂: präsynaptischer α_{2 -Adrenozeptor,} β₁: postsynaptischer β_{1 -Adrenozeptor,} AT₁: Angiotensin II -Rezeptor Typ 1, ANP: Atriales natriuretisches Peptid, cGMP: 3´, 5´-cyclo Guanosinmonophosphat, AC: Adenylatcyclase (Weitere Erläuterungen siehe Text).
• Abb.4: Schematische Darstellung einer doppel-lumigen Mikrodialyse-Sonde
• Abb. 5: Proband mit implantierten Mikrodialysesonden im Fettgewebe
• Abb. 6: Implantation der Mikrodialyse-Sonde in das abdominale subkutane Fettgewebe (Erklärungen siehe Text)
• Abb. 7: Repräsentatives Beispiel einer Standard-Ethanol-Reihe
• Abb. 8: Basale Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat-Dialysat-Konzentration (D) im subkutanen abdominalen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (n=7) während eines ikrodialysversuchs über 4 Stunden. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. Statistische Analyse: Zeitpunkt 30 min vs. 45, 60, 180 und 240 min; One-way ANOVA und Dunett´s Multiple Comparison Test.
• Abb. 9: Zusammenhang zwischen Harnstoff- (A) sowie Glucose-Konzentration (B) im Dialysat und der Ethanol Ratio im subkutanen abdominalen Fettgewebe von Frauen (○, n=8) und Männern (●, n=8). Die Daten sind als Einzelwerte angegeben. Statistische Analyse: lineare Regressionsanalyse (Pearsson Korrelation).
• Abb. 10: Glycerol-Konzentration im Medium während der Inkubation isolierter Adipocyten basal (Kontrolle) und unter 1 µM Isoproterenol bzw. 0,035, 0,35, 3,5, 35 und 350 mM Tyramin (n = 6). Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. ***) p<0,001; *) p<0,05; Isoproterenol bzw. Tyramin vs. basal, One-way ANOVA und Dunnett's Multiple Comparison Test.
• Abb. 11: Änderungen in der Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat- (D) Konzentration im abdominalen subkutanen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=12) und Männern (●, n=14) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Tyramin. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. ***) p<0.001, *) p<0.05; Tyramin vs. basal, One-way ANOVA und Dunnett's Multiple Comparison Test.
• Abb. 12: Änderungen in der Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat- (D) Dialysat-Konzentration im abdominalen subkutanen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=8) und Männern (●, n=8) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Isoproterenol. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. *) p<0.05, ***) p<0.001; Isoproterenol vs. basal, One-way ANOVA und Dunnett's Multiple Comparison Test.
• Abb. 13: Zusammenhang zwischen den jeweiligen Dialysat-Konzentrationen an Glycerol im subkutanen abdominalen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=7) und Männern (●, n=8) nach Perfusion mit 1,0 µM Isoproterenol und 3,5 mM Tyramin. Die Daten sind als Einzelwerte angegeben. Statistische Analyse: lineare Regression (Pearson Korrelation).
• Abb. 14: Änderungen in der Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat- (D) Dialysat-Konzentration im abdominalen subkutanen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (n=4) und Männern (n=4) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Dopamin. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. *) p<0,05; ***) p<0,001; Dopamin vs. basal, One-way ANOVA und Dunnett's Multiple Comparison Test.
• Abb. 15: Änderungen in der Ethanol Ratio (A) und der Glycerol-Konzentration (B) im abdominalen subkutanen Fettgewebe von normalgewichtigen Probanden (n=5; 3 Frauen und 2 Männer) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Tyramin in An- (■) und Abwesenheit (□) von 10 µM Propranolol. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben, *) p<0.05, ***) p<0.001; Tyramin vs. basal, One-way ANOVA und Dunnett's Multiple Comparison Test. Propranolol vs. Kontrolle, Two-way ANOVA and Bonferroni’s post hoc tests.
• Abb. 16: Änderungen in der Ethanol Ratio (A) und der Glycerol-Konzentration (B) im abdominalen subkutanen Fettgewebe von normalgewichtigen Probanden (n=5; 3 Frauen und 2 Männern während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Isoproterenol in An- (■) und Abwesenheit (□) von 10 µM Propranolol. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben, ***) p<0,001; Isoproterenol vs. basal, One-way ANOVA und Dunnett's Multiple Comparison Test. Propranolol vs. Kontrolle, Two-way ANOVA and Bonferroni’s post hoc tests.
• Abb. 17: Änderungen in der Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat- (D) Dialysat-Konzentrationen im Skelettmuskel von normalgewichtigen Männern (n=8) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Tyramin. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben, *) p<0,05; ***) p<0,001; Tyramin vs. basal, One-way ANOVA and Dunnett's Multiple Comparison Test.
• Abb. 18: Änderungen in der Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat- (D) Dialysat-Konzentration im Skelettmuskel von normalgewichtigen Männern (n=8) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Isoproterenol. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben., *) p<0,05, ***) p<0,001; Isoproterenol vs. basal, One-way ANOVA und Dunnett's Multiple Comparison Test.
• Abb. 19: Änderungen in der Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat- (D) Dialysat-Konzentrationen im abdominalen subkutanen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=8) und Männern (●, n=8) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Angiotensin II. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. *) p<0.05; Angiotensin II vs. basal, .
• Abb. 20: Änderungen in der Ethanol Ratio (A), Glycerol- (B), Glucose- (C) und Lactat- (D) Dialysat-Konzentration im Skelettmuskel von normalgewichtigen Männern (n=8) während der Perfusion mit steigenden Konzentrationen an Angiotensin II. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben. *) p<0,05; Angiotensin II vs. basal,
• Abb. 21: Hautfaltendicken der untersuchten Frauen (A) und Männer (B). Die Daten sind als Einzelwerte (F1 bis F8 und M1 bis M8) bzw. als Mittelwerte (∅) ± SEM dargestellt. Frauen vs. Männer, Student'schen t-Tests für ungepaarte Stichproben.
• Abb. 22: Zusammenhang zwischen Ethanol Ratio (A) sowie der Harnstoff-Konzentration (B) im Dialysat und der Hautfaltendicke im subkutanen abdominalen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=8) und Männern (●, n=8). Die Daten sind als Einzelwerte angegeben. Statistische Analyse: lineare Regression (Pearson Korrelation).
• Abb. 23: Zusammenhang zwischen der Glycerol-Dialysat-Konzentration und der Hautfaltendicke im subkutanen abdominalen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=8) und Männern (●, n=8). Statistische Analyse: lineare Regression (Pearson Korrelation).
• Abb. 24: Zusammenhang zwischen Glucose- (A) und Lactat- (B) Dialysat-Konzentration und der Hautfaltendicke im subkutanen abdominalen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=8) und Männern (●, n=8). Statistische Analyse: lineare Regression (Pearson Korrelation).
• Abb. 25: Zusammenhang zwischen der Ethanol Ratio (A) sowie der Glucose-Konzentration im Dialysat (B) und der Hautfaltendicke im subkutanen abdominalen Fettgewebe von normalgewichtigen Frauen (○, n=7) und Männern (●, n=8) während der Perfusion mit 1,0 µM Isoproterenol. Statistische Analyse: lineare Regression (Pearson Korrelation).
• Abb. 26: Relative Genexpression der Dopamin-Rezeptoren des Typ 1 (D1 und D5) während der Adipogenese im subkutanen Brustfettgewebe von Frauen (n=5) untersucht mittels RT-PCR. Die relative Genexpression der Präadipocyten wurde „1“ gesetzt. Statistische Analyse: Wilcoxon-Test.
• Abb. 27: Regulation der Lipolyse im humanen Fettgewebe. α₂-AR: α₂-Adrenozeptor, β_1,2,3: β_1,2,3-Adrenozeptoren, G_i: inhibierendes G-Protein, G_s: stimulierendes G-Protein, cAMP: 3´,5´-cyclo Adenosinmonophosphat, cGMP: 3´,5´-cyclo Guanosin- monophosphat, PDE-3B: Phosphodiesterase 3B, PKA: Proteinkinase A, PKG: Proteinkinase G, FFS: freie Fettsäuren, HSL: Hormonsensitive Lipase, TG: Triacylglyceride. NET: Noradrenalin-Transporter. Modifiziert nach Stich/Berlan 2004.