Ahmed Seid, Eshetu: Wirkungen des Rhizobakteriums Bacillus subtilis auf den Befall von Tomatenpflanzen durch Wurzelgallen- (Meloidogyne spp.) und Wurzelläsions-Nematoden (Pratylenchus spp.)

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Kapitel 4. Material und Methoden

4.1. Versuchsorganismen

4.1.1. Tomate

Die Tomate steht heute unter den Nahrungsmitteln der Erde sowohl im Hinblick auf die Produktion als auch auf die Anbaufläche etwa an 10. Stelle (Krug, 1991). Die Sorte ‘Harzglut’, die keine Resistenz gegen Nematoden (Meloidogyne spp. und Pratylenchus spp.) aufweist, wurde in allen Versuchen verwendet. Die Samen wurden vor der Aussaat in NaOCl-Lösung mit 2% aktivem Chlor 5 Minuten sterilisiert und anschließend dreimal mit sterilem, destillierten Wasser gewaschen. Je nach Versuchsbedingung wurden die Samen in gedämpftem Quarzsand (Körnung 0,2-0,6 mm) oder in gärtnerischem Erdsubstrat in Schalen ausgesät.

4.1.2. Nematoden

4.1.2.1. Nematodenvermehrung und Inokulumgewinnung

Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949 und Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949

Meloidogyne arenaria bzw. M. incognita wurden an den anfälligen Tomatensorten ‘Harzglut’ bzw. ‘Moneymaker’ im Gewächshaus (Temperatur von etwa 23-28 °C) in Pflanztöpfen vermehrt. Die Pflanzen wurden nach Bedarf wöchentlich mit 0,2%iger Düngerlösung ”Wopil“ gedüngt.

Verfahren -A

Die Nematoden wurden aus vergallten Tomatenwurzeln gewonnen. Die Wurzeln wurden gewaschen, mit der Schere zerkleinert und anschließend in 0,1%iger NaOCl-Lösung (Hussey & Barker, 1973) mit einem Küchenmixer (Type KM 8) 2 Minuten mazeriert. Dadurch wurden die Eiersäcke herausgelöst. Danach lagen Eier und Larven weitgehend frei in der Suspension vor. Die pflanzlichen Reste wurden mit einer Siebkombination von 100, 50 und 20 µm von Eiern und Larven getrennt. Die Eier und Larven wurden vom letzten Sieb mit ein wenig Leitungswasser abgespült und zur Inokulation verwendet.


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Verfahren -B

Die vergallten Tomatenwurzeln wurden unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Danach wurden die Wurzeln in etwa 1 cm lange Stücke geschnitten und im Mixer 30 Sekunden bei 9000 U/Minute Geschwindigkeit mazeriert. Das Wurzelmazerat wurde in eine 1-Liter-Duranflache überführt und mit einer NaOCl-Lösung auf 400 ml aufgefüllt. Die Endkonzentration betrug 1,5% aktives Chlor. Die Extraktionssuspension wurde von Hand 3 Minuten geschüttelt. Das NaOCl diente zur Auflösung der Gelatinematrix der Eiermasse, um somit die Eier freizusetzen. Der Inhalt der Flasche wurde über die Siebkombination von 300, 100, 50 und 20µm gegossen und mit reichlich Leitungswasser gewaschen. Auf dem 20µm Sieb zurückgehaltene Eier und Larven wurden zur Inokulation bzw. zur Weiterentwicklung der Eier in einer 1-Liter-Duranflache mit Druckluft bei Zimmertemperatur belüftet. Nach 12 Tagen waren die meisten Larven geschlüpft. Die Eier/Larven-Suspension wurde 2 mal auf ein 20 µm Sieb gegeben und nachfolgend jedesmal die zurückgehaltenen Nematoden auf ein Sieb mit Milchfilter überführt und anschließend die Siebschalen nach Oostenbrink (1960) mit Leitungswasser angestaut. Larven, die innerhalb von 14 h die Oostenbrink-Schalen passierten, wurden zur Inokulation verwendet. Die Inokulumdichte wurde je nach Bedarf auf die gewünschte Konzentration eingestellt.

Pratylenchus penetrans Filipjev, 1936

Freundlicherweise wurde eine sterile P. penetrans-Kultur von der Universität Kiel zur Verfügung gestellt. P. penetrans wurde an Senf (Sinapsis alba) in vitro vermehrt. Die Samen wurden in 2% NaOCl für 10 Minuten und danach in 96% Alkohol für etwa 2 Minuten desinfiziert. Anschließend wurden sie mit sterilem, destillierten Wasser gewaschen. Dann wurden die Samen auf Petrischalen (_=9 cm) mit 0,8%igem Wasseragar übertragen und im Brutschrank bei 25 °C im Dunkeln für vier Tage vorgekeimt. Die vorgekeimten Samen wurden in modifizierte KNOP-Agar-Petrischalen (_=20 cm) übertragen und für 14 Tage im Lichtkasten kultiviert. Danach wurden die Schalen mit P. penetrans inokuliert. Nach 2-3 Monaten Kulturzeit war eine Ernte von Nematoden möglich.


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4.1.2.2. Auswertung des Befalls von M. arenaria bzw. M. incognita und P. penetrans

Eingedrungene Larven: Zur Bestimmung der eingedrungenen Larven wurden die Tomatenwurzeln gründlich unter Leitungswasser gewaschen. Danach wurde zu den Wurzelproben Säurefuchsin-Lösung gegeben. Anschließend wurden die Proben in einem Mikrowellengerät aufgekocht. Die Proben wurden unter Zimmertemperaturbedingungen bis zur Zählung aufbewahrt. Die Wurzelproben wurden über ein 100 µm Sieb gegossen und unter fließendem Wasser gewaschen. Dann wurden sie kleingeschnitten, in Kolben (20 ml) überführt und für 10 Sekunden mazeriert. Die Larvenzahl wurde in Kunststoff-Zählkammern mit 10 ml Fassungsvolumen unter dem Binokular bestimmt.

Nematodenvermehrung: Es wurde das gesamte Wurzelsystem jeder einzelnen Pflanze zur Bestimmung der Nematodenvermehrung verwendet. Wo die Auszählung der Gallen möglich war, wurden sie, z. B. beim Kombinationseinsatz von B. subtilis und A. superba, bestimmt.

4.1.3. Arthrobotrys superba Corda 1839

Der Pilz wurde auf KDA kultiviert. Da sich Reis als Startnährsubstrat sehr eignet und im Boden besser verteilbar ist (Jawich, 1989), wurde der Pilz für die Versuche auf Reis vermehrt. Dazu wurden in Petrischalen (_=9 cm) 13 g Reis und 10 ml Aqua dest. pro Schale 30 Minuten lang autoklaviert. Später wurden die Schalen mit einem mit Myzel bewachsenen Agarstück (_=6 mm) in der Mitte beimpft. Die Schalen wurden 4 Wochen lang im Brutschrank bei 25 °C aufbewahrt, bis sie vollständig vom Pilz zugewachsen waren.

4.1.4. Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) Cohn 1872

4.1.4.1. Anzucht, Herstellung von Sporensuspensionen und Gewinnung von Sterilkulturfiltraten

Anzucht

Der Stamm FZB 24® wurde vom FZB Biotechnik, Berlin isoliert und in Submerskultur bei 25 °C in Landy-Medium (Tab. 1) kultiviert. Die Sporen wurden gewaschen und anschließend auf Quarzsand (QS) bzw. KNO3 als Trägersubstanz gesprüht und granuliert (die Dichte betrug 1x1010 cfu/g). Erfolgte die Formulierung auf KNO3-Basis, ergab sich durch die Applikation


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von B. subtilis gleichzeitig eine KNO3-Zuführung (formulierungsbedingt), die berücksichtigt wurde. KNO3 macht etwa 90% des Gesamtgewichtes des Granulates aus (Junge, 1994).

Der Stamm S18 wurde freundlicherweise vom Institut für Pflanzenkrankheiten der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn zur Verfügung gestellt. Die beiden Isolate FZB 24® und S18 wurden jeweils als Sporensuspension (Frischkultur) von der FZB Biotechnik GmbH (Berlin) geliefert.

Tabelle 1 Zusammensetzung des Landy-Mediums für 1 Liter nach Landy et al., 1948

Substanz

Menge

Substanz

Menge

Glucose

20 g

KH2PO4

500 mg

L-Glutaminsäure

5 g

Fe(SO4)3 . 6H2O

150 µg

MgSO4

250 mg

MnSO4 . H2O

5 mg

KCl

250 mg

CuSO4 . 5H2O

160 µg

Der pH-Wert wurde auf 7 mit 1 N KOH eingestellt

Sporensuspension

B. subtilis FZB 24®, als Granulatpräparat, gebunden auf KNO3 bzw. auf Quarzsand (QS), wurde mit sterilem Leitungswasser aufgeschwemmt und entsprechende Konzentrationen (109, 107 und 105 cfu/ml) hergestellt. Die Sporensuspension wurde einer Wärmebehandlung bei 60 °C für 30 Minuten unterzogen, um die Sporen zur Keimung anzuregen, bzw. zu aktivieren.

Sterilkulturfiltrate

Die B. subtilis-Isolate wurden in Landy-Medium als Schüttelkultur vermehrt. Es wurden 3 Sterilkulturfiltrate (log. Phase = 8 h, Übergangsphase = 14 h und st. Phase = 72 h Kulturzeit) gewonnen. Die Kulturfiltrate wurden vor der Lieferung auf ihre Keim- bzw. Sporenfreiheit geprüft (Tab. 2).


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Tabelle 2 Merkmale verschiedener Kulturfiltrate von B. subtlis-Stamm FZB 24® im Landy-Medium (nach Beckmann 1995+ und FZB Biotechnik GmbH 1995)

Merkmale

log.-Phase 8 h

üb.-Phase 14 h

st.-Phase 72 h

pH-Wert

5,97

6,61

7,44

+Osmotischer Druck

(mM/Kg)

207

136

105

Glutaminsäure (mg/ml)

3,27

3,09

0,012

Glucose (g/l)

14,5

13,29

4,2

NH-4 (µg/ml)

9,962

6,217

1,162

Protease (Tecas*/ml)

0,0012

0,009

0,005

Zyklische Lipopeptide

(g/l)

0,025

0,0293

0,242

*Eine Tyrosin-Einheit ist die Enzymmenge, die aus einer Caseinlösung unter definierten Bedingungen soviel in Trichloressigsäure lösliche Substratbruchstücke pro Minute freigesetzt werden, deren Absorption der eines µmol Tyrosin entspricht.

G3-Fraktion und Bion®

G3 ist eine physiologisch aktive HPLC-Fraktion aus dem Kulturfiltrat der Übergangsphase des B. subtilis Stammes FZB 14, die aktive Protein(e) als Stoffwechselprodukte des Bakteriums enthält (Fischer, 1997). Für den genauen Ablauf der Trennung siehe Alemayehu (1997).

Bion® (CIBA) ist der derzeit einzige käuflich erwerbbare chemische Pflanzenaktivator. Bion® aktiviert die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanzen gegen Krankheitserreger. Bion® ist als wasserdispergierbares Granulat formuliert. Dieses Produkt wird über die Wurzel und Blätter schnell aufgenommen und in der gesamten Pflanze (akropetal und basipetal) verteilt. Das Produkt besitzt keine direkte Wirkung auf Pilze und Bakterien. Die Wirksubstanz von Bion® ist Benzo (1,2,3) thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methylester.

4.2. Substrate

Es kamen hauptsächlich gärtnerische Erdsubstrate (Typ I und II), Pflanzerde und Quarzsand (Körnung 0,2-0,6 mm) bei der Kultivierung der Testpflanzen zur Anwendung. Die Bodenanalysewerte sind in Tab. 3 und 4 dargestellt.


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Tabelle 3 Laboranalyseergebnisse des gärtnerischen Erdsubstrates Typ I

Untersuchungsparameter

Dimension

Typ I

Typ I
B. subtilis
x 107 cfu/ml

Typ I
B. subtilis
x 109 cfu/ml

Nitrat-Stickstoff

mg NO3-N/l FM

<10

<10

288

Ammonium-Stickstoff

mg NH4-N/l FM

10

<10

<10

Phosphor

mg P/l FM

105

95

95

Kalium

mg K/l FM

132

138

676

Magnesium

mg Mg/l FM

160

152

146

pH-Wert (0,1 n KCl)

Meßtemp.:21 °C

6,5

6,4

6,4

Trockenraummasse

g TM/l Boden

420

430

470

Salzkonzentration

als g KCl/l FM Meßtemp.: 25 °C

1,6

1,4

3,4

Tabelle 4 Laboruntersuchungsergebnisse des Erdsubstrates Typ II

Untersuchungsparameter

Dimension

Typ II

Nitrat-Stickstoff

mg NO3-N/l FM

168

Ammonium-Stickstoff

mg NH4-N/l FM

31

Phosphor

mg P/l FM

425

Kalium

mg K/l FM

1644

Magnesium

mg Mg/l FM

324

pH-Wert (0,1 n KCl)

Meßtemp.:22 °C

6,8

Trockenraummasse

g TM/l Boden

450

Salzkonzentration

als g KCl/l FM Meßtemp.: 25 °C

3,1

4.3. Methoden

4.3.1. Untersuchungen zum Einfluß von B. subtilis auf das Pflanzenwachstum und den M. arenaria-Befall

Der Einfluß von B. subtilis auf das Pflanzenwachstum und den Befall von M. arenaria an Tomate wurde in Gefäßversuchen im Gewächshaus untersucht. Es wurden B. subtilis-Granulate, die auf KNO3- oder QS-Basis formuliert waren, verwendet. Zur Anwendung kamen Bakterien-Suspensionen mit Titern von 105 (BS1), 107 (BS2), und 109 cfu/ml (BS3). Von den jeweiligen Suspensionen wurden 20 ml je Gefäß und Pflanze appliziert. Wenn Präparate auf KNO3-Basis eingesetzt wurden, waren mit der Granulatauflösung gleichzeitige


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KNO3-Zuführungen verbunden, die bei den Stufen 105 cfu/ml mit 0,18 und 107 cfu/ml mit 18 mg zwar zu vernachlässigen waren, die jedoch bei der höchsten Bakterienapplikation mit 109 cfu/ml 1,8 g KNO3 pro Pflanze bedeuteten. Die Wasserbehandlung diente als Kontrolle (BS0). Es wurden 5 Wiederholungen angelegt. Eine Woche nach Bakterien-Applikation wurden drei Wochen alte Tomatensämlinge eingesetzt. Eine Woche danach wurden die Testpflanzen mit M. arenaria (M1) durch Einbringen von 7000 Eiern/Larven, in 5 Gießlöchern um den Wurzelhals verteilt, inokuliert. Die behandelten Pflanzen wuchsen 6 Wochen. Anschließend wurde jede Variante in ihrer Biomasseentwicklung (Sproßhöhe, Sproßfrisch- und -trockenmasse sowie Wurzelfrischmasse) und hinsichtlich des Nematodenbefalls - Wurzelvergallung, Eier/Larven pro Wurzelsystem und g Wurzel - bonitiert.

4.3.2. Untersuchungen zum Einfluß von B. subtilis-Kulturfiltraten (KF) auf das Pflanzenwachstum und den M. arenaria-Befall

Es wurden Gefäßversuche mit standardisierten Kulturfiltraten von B. subtilis im Klimaschrank (Tagtemperatur 23 °C, rel. Luftfeucht. 65%, Nachttemperatur 19 °C und rel. Luftfeucht. 70%) durchgeführt. Die Plastiktöpfe wurden zuvor mit einer Wofasept-Lösung desinfiziert und anschließend gründlich mit Leitungswasser gespült. Ein eine Woche alter Tomatensämling wurde je Gefäß pikiert. Die Testpflanzen wurden im 2-Blattstadium mit 50%igen Kulturfiltraten (KF) aus den verschiedenen Fermentationsphasen (siehe 4.1.4.1.) durch Angießen von 5 ml pro Topf und Pflanze am Wurzelhals behandelt. Eine Wasserbehandlung diente als Kontrolle. Eine Woche danach wurden die Pflanzen mit M. arenaria-Larven (2000 L2) inokuliert. Sterilisiertes Erdsubstrat (eine Mischung aus gärtnerischem Substrat und Quarzsand im Verhältnis von 1:1) oder reiner Quarzsand wurden als Substrat (200 ml bzw. 300 g pro Topf) verwendet. Es wurden fünf Wiederholungen je Variante angelegt. Die Testpflanzen wurden nach Bedarf wöchentlich mit 0,2%iger Düngerlösung ”Wopil“ gedüngt und täglich nach Gewicht gegossen. Vier Wochen nach der Inokulation wurden die Biomasseentwicklung (Sproßfrisch-,
-trockenmasse, Wurzelfrischmasse der Pflanzen) und die Anzahl der Eier/Larven ermittelt.

G3-Fraktion und Bion®

Eine 20%ige Konzentration (bezogen auf das Ausgangs-KF) von G3 und die 2 Konzentrationen 10-5 und 10-4 M Bion® kamen zum Einsatz. Die Kontrollpflanzen wurden mit


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Wasser behandelt. Es wurden jeweils 20 ml Lösung pro Gefäß und Pflanze appliziert. Es wurden die gleichen Wachstums- und Befallsparameter wie oben erfaßt.

4.3.3. Untersuchungen zur Wanderung und Invasion von M. incognita bzw. M. arenaria nach B. subtilis- bzw. KF-Behandlung

B. subtilis als Sporensuspension: Der Einfluß von B. subtilis FZB 24® auf die Wanderung und Invasion von M. incognita wurde im modifizierten Sandblockversuch nach Kerstan & Röpke (1977) an Tomate untersucht.

Ein Plexiglasrahmen von 7 x 2,5 x 1,5 cm auf einem Objektträger wurde mit 30 g Sterilsand (fein) gefüllt. Auf der einen Seite des Sandblocks wurde ein eine Woche alter Tomatenkeimling, der vorher in entsprechenden Varianten für 25 Minuten lang behandelt wurde, eingesetzt (Abb. 1). Als Varianten wurden gewählt:

1) H2O 2) BS2-QS 107 cfu/ml B. subtilis 3) BS3-QS 109 cfu/ml B. subtilis 4) KNO3
5) BS3-KNO3 109 cfu/ml B. subtilis

Vier Tage danach wurden die M. incognita-Larven (2045) auf die entgegengesetzte Seite inokuliert. 10 Tage nach der Inokulation wurde der Sandblock in 3 gleich große Abschnitte (vom Inokulationsort A, B und C) geteilt. Es wurden die Larven in den Sandblockteilen und im Wurzelsystem gezählt. Der Versuch wurde im Klimaschrank mit 9 Wiederholungen durchgeführt.

Abbildung 1 Aufbau des Sandblockversuches


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Kulturfiltrate: Ähnliche Versuche wurden mit B. subtilis-KF durchgeführt. Es wurden 2000 M. arenaria-Larven (L2) inokuliert.

Ermittlung der Mortalität von M. arenaria-Larven (L2): Der direkte Einfluß der KF von B. subtilis wurde gegen Meloidogyne-Larven in vitro getestet. Die KF wurden zu 3 verschiedenen Zeitpunkten des Fermentationsprozesses gewonnen. Als Kontrolle dienten Wasser und Landy-Medium. Es kamen 50%-, 10%- und 1%ige Kulturfiltrat-Konzentrationen zur Anwendung.

In 100-ml-Kunststoffgefäße wurden 24 ml des jeweiligen Kulturfiltrates und 1 ml Meloidogyne-Larven-Suspension (9000 L2/ml) gegeben. Die Gefäße wurden bei Zimmertemperatur auf einem Schüttler (200 U/Minute) aufbewahrt. Jede Variante hatte 4 Wiederholungen. Jeden Tag wurde die Anzahl der lebenden und toten Larven bestimmt.

4.3.4. Untersuchungen zur systemischen Wirkung von B. subtilis auf den Pflanzenbefall durch M. incognita

Es wurde ein Sterilerdsubstratgemisch im Verhältnis von 2:1 aus Pflanzerde und Sand zur Befüllung der Versuchsgefäße (200 ml) verwendet. Zwei Wochen alte Tomatensämlinge wurden in einen oberen Topf gepflanzt, der wiederum auf 2 getrennte Töpfe plaziert wurde (Abb. 2 und 3). Das Wurzelsystem jeder Testpflanze wuchs in die 2 Töpfe (je 200 ml) hinein. Das Erdsubstrat, in das eine Wurzelhälfte hineinwuchs, wurde eine Woche nach dem Einpflanzen der Sämlinge mit 5 ml pro Topf und Pflanze Bakteriensuspension von B. subtilis (BS-KNO3- und BS-QS-Formulierungen) 109 cfu/ml behandelt. Eine KNO3- und Wasserbehandlung dienten als Kontrolle.

Die unbehandelte Wurzelhälfte wurde mit 2000 L2 inokuliert (Abb. 2) oder beide Wurzelhälften jeweils mit 2000 L2 (Abb. 3).


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Abbildung 2 Aufbau des ”Split-root-system“-Versuches (einseitige Nematoden-inokulation)

Je Variante wurden 10 Wiederholungen angelegt. Die Hälfte der Pflanzen diente zur Bestimmung der Frühinfektion (10 Tage nach Inokulation). Die andere Hälfte wurde drei Wochen später geerntet. Der Versuch wurde an der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn im Gewächshaus durchgeführt.

Abbildung 3 Aufbau des ”Split-root-system“-Versuches (zweiseitige Nematoden-inokulation)


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4.3.5. Untersuchungen zum Einfluß einer kombinierten Applikation von B. subtilis und A. superba auf den M. arenaria-Befall

Der Pilz wurde auf Reiskornmedium für vier Wochen bei 25 °C im Brutschrank kultiviert und zwei Wochen vor dem Einpflanzen der Tomatensämlinge in natürliches, ungedämpftes Erdsubstrat eingearbeitet. In jedes Gefäß wurde ½ -Schaleninhalt (mit Pilz bewachsener Reis) bzw. reiner Reis (6,5 g/Topf) gegeben. Die Kontrolle wurde ohne Reis angesetzt. Eine Woche danach wurde B. subtilis in die Gefäße (mit A. superba) eingearbeitet. Es wurden jeweils 20 ml Sporensuspension/Topf (109 cfu/ml) appliziert. Die Inokulation der Pflanzen mit M. arenaria erfolgte einen Tag nach dem Einpflanzen. Nach 6 Wochen Kulturdauer im Gewächshaus wurde der Versuch abbonitiert. Hierbei wurden Sproßhöhe (SH), Sproßfrisch- (SFM), -trockenmasse (STM) und Wurzelfrischmasse (WFM) sowie die Gallen pro Wurzelsystem erfaßt. Das Gießen und Düngen erfolgte einheitlich nach Bedarf.

4.3.6. Untersuchungen zum Einfluß der B. subtilis Stämme FZB 24® und S18 auf den Befall des Wurzelläsionsnematoden Pratylenchus penetrans

Der Einfluß von B. subtilis FZB 24® wurde unter Gewächshausbedingungen in gedämpftem Erdsubstrat (Mischung von gärtnerischem Erdsubstrat (Typ II) und Quarzsand im Verhältnis von 2:1) durchgeführt. Die Sporensuspensionen (109 cfu/ml) wurden zuvor 30 Minuten bei 60 °C wärmebehandelt. Es wurden 20 ml/Topf appliziert. Als Kontrolle diente eine Wasserbehandlung. Es wurden sowohl mit Nematoden inokulierte (1500 Nematoden/Gefäß und Pflanze) als auch uninokulierte Varianten angelegt. Jede Variante wurde 5mal wiederholt. Das Düngen und Bewässern erfolgte nach Bedarf. Nach 6 Wochen Kulturdauer wurde der Versuch beendet. Die unter 4.3.5. genannten Wachstumsparameter und die Gesamtzahl der Nematoden in der Wurzel wurden erfaßt.

Die B. subtilis-Stämme FZB 24® und S18 kamen mit gleichen Konzentrationen (109 cfu/ml) und Aufwandmengen an Sporensuspension auch zur Anwendung in ungedämpftem Erdsubstrat (Mischung aus gärtnerischem Substrat und Quarzsand im Verhältnis von 1:1).


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4.3.7. Untersuchungen zum Einfluß von B. subtilis auf die pflanzlichen Enzymaktivitäten

Sieben Wochen nach Bakterienapplikation bzw. sechs Wochen nach Meloidogyne-Inokulation wurden die Tomatenpflanzen geerntet. Sproßproben (Stengel und Blätter) wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zermörsert. Das Pulver wurde in 50-ml-Glasröhrchen bis zur weiteren Aufarbeitung bei -20 °C gelagert.

Das pulverisierte Pflanzenmaterial wurde modifiziert nach Mauch et al. (1988) extrahiert. Hierzu wurden je g Frischmasse 4 ml kalte 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) verwendet. Das Extraktionsmittel enthielt zusätzlich den Proteasehemmer Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Merck Nr. 7349) in einer Konzentration von 1 mM. Die Proben wurden 30 Minuten bei 4 °C auf einem Schüttler extrahiert und anschließend das unlösliche Material durch Filteration abgetrennt.

Bestimmung des Proteingehaltes: Der Pflanzenextrakt wurde zentrifugiert und der Proteingehalt nach Bradford (1976) bestimmt. In ein Reagenzröhrchen wurden 100µl der Proteinlösung und 5 ml der Bradford-Reagenz pipettiert. Das Gemisch wurde kurz mit einem Vortex-Mixer geschüttelt und nach 5 Minuten Reaktionszeit die Extinktion bei lambda=595nm (Mikrotiterplatten-Photometer Dynatech MR 5000) gemessen. Der Probenleerwert enthielt 100 µl 10 mM Tris-HCl Puffer und 5 ml Bradford-Reagenz. Anhand einer Eichkurve mit Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Nr. B-4287) wurde die Proteinkonzentration bestimmt.

Bestimmung der Peroxidase: Die Ermittlung der Peroxidase-Aktivität erfolgte nach Abeles (1970).

Zusammensetzung der Guaiacollösung:

In Reagenzröhrchen wurden jeweils 100 µl der Proteinlösung mit 4 ml der Guaiacollösung vermischt und nach 1 Minute Reaktionszeit die Extinktion von Tetraguaiacol bei lambda=470 nm bestimmt. Die Reaktion fand bei Zimmertemperatur statt.


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Bestimmung der Chitinase: Die Chitinase-Aktivität der Proben wurde nach Wirth & Wolf (1990) bestimmt. Als Substrat diente CM-Chitin-RBV (Prof. Wolf, Univ. Göttingen) in wäßriger Lösung (2 mg/ml). In einem Eppendorfgefäß wurden 100 µl dieser Lösung, 100 µl 0,2 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,0) und 200 µl Proteinlösung für 1 h bei 26 °C in einem Wasserbad inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 100 µl 1 N HCl und Abkühlung des Ansatzes auf Eis für 10 Minuten. Das präzipitierte, nicht umgesetzte Substrat wurde durch Zentrifugation (14.900 x g, 4 °C, 5 Minuten) gesammelt. Der Überstand wurde auf Mikrotiterplatten aufgetragen (200 µl/Cup) und die Extinktion bei lambda=550 nm bestimmt. Die Zusammensetzung des Probenleerwetes war analog, aber ohne die entsprechende Enzymlösung. Als Positivkontrolle wurde Chitinase (Sigma Nr. C-6137) verwendet.

4.3.8. Untersuchungen zum Einfluß synthetischer Phytohormone bzw. Vorstufen auf das Pflanzenwachstum und den M. arenaria-Befall

Es wurde angenommen, daß B. subtilis und andere Mikroorganismen Phytohormone bzw. Stoffwechselprodukte, die eine phytohormonähnliche Wirkung haben, produzieren. Deshalb wurden Versuche unternommen, um den Phytohormonhaushalt der Testpflanzen durch Zugabe synthetischer Phytohormone bzw. Vorstufen zu beeinflussen. Es kamen folgende Phytohormone und Vorstufen zum Einsatz: a) Indol-3-ylessigsäure (IAA) 10-6 M; b) Kinetin 10-6 M; c) Indol-3-ylpyruvatsäure 10-6 M (IPyA). Es wurden 40 ml pro Topf und Pflanze appliziert. Die Testpflanzen wurden nach Bedarf, wöchentlich mit 0,2%iger Düngerlösung ”Wopil“ gedüngt und täglich nach Gewicht gegossen. Der Versuch wurde sowohl im Klimaschrank als auch im Gewächshaus durchgeführt.

Mortalität der Meloidogyne-Larven (L2) in vitro: In 100-ml-Kunststoffgefäßen wurden 24 ml der jeweiligen Vorstufen- bzw. Phytohormonlösungen und 1 ml Meloidogyne-Larven-Suspension gegeben. Die Plastikbecher wurden unter Zimmertemperaturbedingungen aufbewahrt. Jede Variante hatte 4 Wiederholungen. Zum Zeitpunkt des Versuchsansatzes und nach 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 Tagen wurden jeweils 2 ml des Gemisches entnommen, um die Mortalität der Nematoden zu bestimmen.


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4.4. Statistische Auswertung der Versuche

Die statistische Auswertung wurde nach Weber (1980) mittels der Software SPSS für Windows durchgeführt. Die Meßdaten wurden einfaktoriell varianzanalytisch mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% verrechnet. Der Mittelwertvergleich erfolgte bis zu 4 Varianten mit dem t-Test (LSD0,05) und bei mehr als 4 Varianten mit dem Tukey-Test (HSD0,05).


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