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Kapitel 4. Material und Methoden

4.1. Anzucht der Wirtstiere

Um aussagekräftige Ergebnisse aus Biotests gewinnen zu können, in deren Verlauf die Wirkung pilzlicher Erreger auf vorratsschädliche Motten untersucht wird, ist die Bereitstellung einer größeren Anzahl an Wirtstieren unabdingbar.

Die Anzucht der Insekten erfordert hierfür geeignete Substrate. Für Versuche mit Larven der Mehlmotte wurde Weizen verwendet. Als Aufzuchtsubstrat für Mehlmottenimagines diente ein Gemisch aus 500 g Weizen und 100 g Weizenschrot.

Zur Bereitstellung von Dörrobstmottenlarven erfolgte die Aufzucht der Versuchstiere auf Mandelbruch. Das Aufzuchtsubstrat der Dörrobstmottenimagines bestand aus 300 g Mandelschrot und 300 g Weizenkleie mit folgender Zusammensetzung: 100 g Weizenkleie, 12 g Glucose, 20 g Hefe, 20 g Glyzerin und 5 ml Wasser. Zum Homogenisieren wurde die Kleie 3 min. im Mixer durchgeknetet.

Die Anzucht der Imagines und Larven erfolgte in 3 l bzw. 1 l Glasgefäßen bei 25°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 65 - 75% und in Dunkelheit.

4.2. Untersuchungen zur Pathogenität geeigneter Pilzstämme

Da eine Virulenz gegenüber nahe verwandten Wirten zu erwarten ist, wurden ausschließlich Pilzstämme getestet, die aus Insekten der Ordnung Lepidoptera isoliert waren.

Die Untersuchungen erfolgten mit Stämmen (Isolaten) von Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. (M.a.73 und M.a.110), Beauveria bassiana (Balsamo.) Vuill. (B.ba.56 und B.ba.112), Paecilomyces farinosus (Dicks) Brown et Smith (Paec.f.34) und Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown et Smith (Paec.f.10) (Hyphomycetales: Moniliaceae). Eine Charakterisierung der verwendeten Pilzstämme findet sich in Tabelle 2.

Sämtliche Pilze wurden vom Institut für biologischen Pflanzenschutz der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft in Darmstadt zur Verfügung gestellt.

Die Stammhaltung der Pilze am Fachgebiet Phytomedizin und angewandte Entomologie der Humboldt - Universität - Berlin erfolgte in vitro auf Biomalz Pepton Agar (MPA) bei 4°C.

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Tabelle 2: Ursprung der im Verlauf der Untersuchungen verwendeten Pilzstämme

Pilzstamm	Wirtsinsekt	Ursprungsort	Isolations- zeitpunkt
Metarhizium anisopliae 73	Lobesia botrana	Bolgna / Italien	10 / 88
Metarhizium anisopliae 110	Galleria mellonella	Muro / Mallorka	1 / 91
Beauveria bassiana 56	Carpocapsa pomonella	Wien	3 / 71
Beauveria bassiana 112	Cossus cossus	Bologna / Italien	10 / 88
Paecilomyces fumosoroseus 10	Eupithelia innotata	Helsinki	10 / 85
Paecilomyces farinosus 34	Diapausepuppen von Mamestra brassicae	Darmstadt	11 / 82

Für den Nachweis der Pathogenität wurde die von MÜLLER-KÖGLER (1965) und LAM et al. (1988) beschriebene Methode angewendet:

Zur Ermittlung der Pathogenität kamen zunächst 4 x 24 frisch geschlüpfte Falter von E. kuehn-iella und P. interpunctella für zwei Minuten auf eine sporulierende Reinkultur der Pilze. Anschließend wurden die Tiere in Petrischalen, die jeweils eine mit Gaze abgedeckte Öffnung enthielten, überführt. In jede Petrischale wurden jeweils sechs behandelte Falter gebracht.

Da der Nachweis der Pathogenität bei möglichst hoher Luftfeuchtigkeit durchzuführen ist, wurden die Petrischalen anschließend auf vier Exsikkatoren verteilt, in denen eine Luftfeuchtigkeit von 96% herrschte. Die relative Luftfeuchtigkeit stellte sich in den geschlossenen Exsikkatoren nach drei Tagen über destilliertem Wasser ein. Zum Vergleich begleiteten Kontrollserien mit unbehandelten Tieren die Untersuchungen bei sonst gleichen Versuchsbedingungen.

Da die bei pilzlichen Insektenerkrankungen auftretenden Symptome nicht streng spezifisch sind, mußte der mikroskopische Nachweis der postinfektionell entstandenen Pilzsporen Gewißheit über die Identität der Erreger bringen. Fruktifizierten die Pilze nicht äußerlich am Insekt, wurden die abgestorbenen Imagines mit Zellstoff gesäubert, daraufhin für drei Minuten in eine Jodtinktur und anschließend in 96%-igen Alkohol getaucht. Diese Vorgehensweise sollte sicherstellen, daß äußerlich anhaftende Pilzsporen sowie andere mikrobielle Erreger, die den Pathogenitätsnachweis erschweren, entfernt werden. Abgetötete Tiere wurden in feuchte Kammern überführt. Die sich daraufhin auf den Tierkörpern bildenden Pilzsporen wurden iso

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Der Pathogenitätsnachweis erfolgte nach dem Koch’schen Postulat. Er galt als geführt, wenn die inokulierten Tiere deutlich schneller abstarben als die unbehandelten Kontrolltiere, und wenn in ersteren der Erreger nachgewiesen wurde.

4.3. Untersuchungen zur Virulenz entomopathogener Pilzstämme

Virulenz in Abhängigkeit von Pilzstamm und Wirtsart

Die Virulenz ist eine genetisch bedingte Eigenschaft insektenpathogener Pilze, die durch zahlreiche Faktoren beeinflußt wird. Nur mit Hilfe streng standardisierter Biotests ist es möglich, Virulenzunterschiede zwischen verschiedenen Pilzstämmen zu erfassen und statistisch auszuwerten (FARGUES und REMAUDIÈRE 1977; McCOY et al. 1985).

Zur Virulenztestung wurden die Pilzstämme bei frisch geschlüpften Imagines von E. kuehniella und P. interpunctella inokuliert. Zur Bestimmung der Isolat-Virulenz dienten Konidien, die von 21 Tage alten Pilzkulturen stammten. Die Pilze waren bei 25°C im Dunkeln auf Biomalz-Pepton-Agar herangezogen worden. Der Nährboden bestand aus 10 g Biomalz, 2,5 g Pepton aus Kasein, 15 g Gelrite-Agarsubstitute, 1000 ml H₂O_dest., besaß einen pH-Wert von 5,5 und war für 20 Minuten bei 120°C autoklaviert.

Unter sterilen Bedingungen wurden die Sporen unter Zusatz von 0,1%-iger Tween 80-Lösung (Polyoxyethylensorbitanmonooleat) abgeschwemmt und 30 Minuten auf einem Horizontal-schüttler homogenisiert. Die Bestimmung des Konidiengehaltes eines Inokulates erfolgte mit einer Thoma-Zählkammer und wurde anschließend durch Zugabe von sterilem entionisiertem Wasser auf den gewünschten Sporentiter eingestellt.

Zusätzlich wurde das Keimvermögen der Sporen überprüft. Dazu wurden die Keimraten der einzelnen Pilzstämme bei 25°C und 48 h Inkubation ermittelt. Die ausführliche Beschreibung des Testverfahrens wird im nachfolgenden Abschnitt zum Einfluß der Temperatur gegeben. Die Keimraten betrugen: B. bassiana 56 - 92%; M. anisopliae 110 - 98%; M. anisopliae 73 - 95%; P. fumosoroseus 10 - 95% und P. farinosus 34 - 86%.

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Bei den Versuchen enthielt jede Variante 96 frisch geschlüpfte Falter. Jeweils sechs Insekten wurden für zwei Stunden zur Inokulation in eine kontaminierte Petrischale gebracht. Die Petrischalen befanden sich während der Inokulation in Exsikkatoren bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 96% und 25°C.

Nach der Inokulation wurden die Motten zur Inkubation in saubere Petrischalen überführt. Die Inkubation erfolgte in Exsikkatoren bei 96% relativer Luftfeuchtigkeit, 25°C und bei Dunkelheit. Tote Tiere wurden täglich ausgesondert und mit Jodtinktur und 96%-igem Alkohol äußerlich desinfiziert. Anschließend erfolgte in feuchter Kammern die Überprüfung von Verpilzungen an den Insektenkadavern.

Die Virulenzbestimmung erfolgte anhand der Mortalitätsraten nachweislich durch die Pilzstämme abgetöteter Imagines. Für die Bestimmung von Signifikanzen wurde der Chi²-Test (2 x 2 Kontingenztafelanalyse) durchgeführt (WEBER 1972a). Die statistische Auswertung des Datenmaterials erfolgte bei allen Versuchen mit dem Computerstatistikprogramm SPSS.

Virulenz in Abhängigkeit von Infektionsbedingungen auf seiten der Umwelt

Einfluß der Temperatur

Da die Temperatur sich hauptsächlich auf das Keimungsverhalten der Pilzsporen auswirkt und dadurch die Virulenz der Pilzstämme beeinflußt, erfolgte die Überprüfung des Umweltfaktors Temperatur in Form von Sporenkeimungsversuchen.

Für die Durchführung verschiedener in vitro Versuche zur Beobachtung und Ermittlung von Sporenkeimvorgängen wurden Sporensuspensionen verwendet, die 10⁵ Konidien /ml, 0,5% Glucose und 0,5% Pepton aus Kasein enthielten. Die Zugabe organischer Substanzen erfolgte aufgrund bereits aus der Literatur bekannter Effekte einer Stimulierung der Konidienkeimung (MÜLLER-KÖGLER 1965, Kmitowa 1978, Mühle und Wetzel 1990).

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Die Inkubation erfolgte in feuchte Kammern bei 25°C in Dunkelheit im Brutschrank. Der Keimungsverlauf wurde bei 15°C, 20°C, 25°C 30°C bestimmt. Mit der Auswahl der vier Temperaturstufen sollte den in Lägern während einer Mottenkalamität herrschenden Temperaturbereichen entsprochen werden.

Die Bonitur der Keimung wurde unter dem Lichtmikroskop alle zwei Stunden durchgeführt. Dazu wurden einhundert zufällig ausgewählte Sporen auf ihre Keimung geprüft.

Die statistische Bearbeitung der Ergebnisse erfolgte mittels linearer Regression nach MÜL-LER-Kögler und SAMSINAKOVA (1969) und WEBER (1972b). Unter Verwendung von Probittransformationen konnten die Zeiten berechnet werden, nach denen 50% der Sporen gekeimt sind (Tg₅₀). Für Aussagen über statistisch signifikante Unterschiede der berechneten Tg₅₀ werden die zugehörigen Vertrauensbereiche herangezogen.

Einfluß der relativen Luftfeuchtigkeit

Die relative Luftfeuchtigkeit ist nach bisheriger Kenntnis für die Infektiösität entomopathogener Pilze sehr bedeutend, da für die Keimung der Pilzsporen eine bestimmte Luftfeuchtigkeit erforderlich ist.

Da die auf der Insektenoberfläche herrschende Luftfeuchtigkeit sich von der des umgebenden Raumes unterscheiden kann, erfolgten die Virulenztests in vivo am Zielinsekt.

Um Rückschlüsse auf die Wirksamkeit der untersuchten Pilzstämme bei lagerähnlichen Bedingungen ziehen zu können, wurden die Untersuchungen bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75% durchgeführt. Nach SEARLE und DOBERSKI (1984) sowie ADANE et al. (1996) beträgt die Luftfeuchtigkeit in Lägern häufig zwischen 60 und 80%. Zur Ermittlung des Einflusses der relativen Luftfeuchtigkeit auf die Virulenz der Pilzstämme dienten in der vorliegenden Arbeit Vergleichstests bei 95% Luftfeuchtigkeit.

Die Untersuchungen zum Einfluß der relativen Luftfeuchtigkeit auf die Virulenz der Pilzstämme erfolgten an frisch geschlüpften Imagines von E. kuehniella und P. interpunctella. Die Pilzstämme wurden in vitro auf MPA 21 Tage bei 25°C in Dunkelheit kultiviert. Nach der Sporu

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Die Inokulation erfolgte bei ca. 75% bzw. 95% in kontaminierten Petrischalen, die jeweils eine mit Gaze bedeckte Öffnung enthielten und sich in Exsikkatoren befanden. Zur Absicherung einer konstanten Umgebungsfeuchte von 75% im geschlossenen Exsikkator, diente gesättigte NaCl-Lösung nach WINSTON und BATES (1960).

Nach der Inokulation wurden jeweils sechs Falter in saubere Petrischalen überführt, die sofort in die Exsikkatoren mit entsprechender Luftfeuchtigkeit untergebracht wurden. Pro Pilzstamm und Feuchtigkeitsstufe wurden 4 x 24 Imagines gleichen Alters getestet.

Einem Vorschlag von WEBER (1972b) folgend, wurden die Letalwerte mittels Regressions-analyse aus den Prozent - Mortalitätsprobits und den dazugehörigen logarithmischen Werten der Einwirkzeit ermittelt. Durch die Probittransformationen konnten die Zeiten berechnet werden, nach denen 50% bzw. 90% der behandelten Insekten abgestorben waren (LT₅₀ ; LT₉₀).

Virulenz in Abhängigkeit vom Ernährungszustand des Pilzes

Zur Herstellung von mikrobiellem Erregermaterial müssen entomopathogene Pilze auf adäquaten Nährböden kultiviert werden. Mitunter unterscheiden sich selbst Stämme der gleichen Pilzart erheblich in ihrem Wirtsspektrum und können auch verschiedene Anforderungen hinsichtlich der Nährbödenzusammensetzung in vitro Kultur besitzen.

Es war das Ziel der Untersuchungen, jeden Pilzstamm auf Nährböden heranzuziehen, die einerseits eine optimale Konidienproduktion gewähren und andererseits den Pilzstämmen gegenüber dem jeweiligen Zielinsekt eine hohe Virulenz verleihen. Die verwendeten Nährböden sowie deren Zusammensetzung sind in der Tabelle 3 dargestellt.

Die Auswahl der Komplexnährböden berücksichtigte bereits aus der Literatur bekannte Effekte einer Förderung der Sporulation und Virulenz bei entomopathogenen Pilzen. Teilweise erfolgte eine Modifizierung der in der Literatur empfohlenen Kohlenstoffquellen.

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Tabelle 3: Charakterisierung der in den Untersuchungen getesteten Nährböden

Nährboden	Zusammensetzung	Autor
	10,0 g Laktose	Kmitowa (1978)
Laktose - Pepton	2,5 g Pepton aus Kasein
(LPA)	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.
Malz - Pepton	10,0 g Biomalz	Mühle und Wetzel
(MPA)	2,5 g Pepton aus Kasein	(1990)
	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.
Saccharose -	10,0 g Saccharose
Pepton (SPA)	2,5 g Pepton aus Kasein
	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.
Czapec Dox-glucose	10,0 g Glucose	Mühle und Wetzel
Glucose	2,0 g NaNO3	(1990)
(CzD Gluc)	0,5 g MgSO4
	1,0 g K2HPO4
	0,01 g FeSO4
	0,5 g KCL
	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.
Czapec Dox-	10,0 g Glycerol	Mühle und Wetzel
Glycerol	2,0 g NaNO3	(1990)
(CzD Glyc)	0,5 g MgSO4
	1,0 g K2HPO4
	0,01 g FeSO4
	0,5 g KCL
	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.
Haferflocken	30,0 g Haferflocken	Müller-Kögler
(HFA)	0,02 g FeSO4	(1965 )
	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.
Riba Glucose	10,0 g Glucose	Riba et al. (1984)
(Riba Gluc)	0,36 g KH2PO4
	1,42 g Na2HPO4
	1,0 g KCL
	0,6 g MgSO4
	0,7 g NH4NO3
	5,0 g Hefeextrakt
	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.
Riba	10,0 g Saccharose
Saccharose	0,36 g KH2PO4
(Riba Sacch)	1,42 g Na2HPO4
	1,0 g KCL
	0,6 g MgSO4
	0,7 g NH4NO3
	5,0 g Hefeextrakt
	15,0 g Gelriteagarsubstitute
	1000 ml H2Odest.

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Einfluß auf die Sporulation

Zur Ermittlung der Sporulation wurden die zu testenden Nährböden 20 min. bei 120°C autoklaviert und anschließend zu jeweils 10 ml in Petrischalen gegossen. Im Anschluß wurden aus 14 Tage alten Kulturen (9 cm Petrischale, Biomalz-Peptonagar) mittels Korkbohrer (Durch-messer: 7 mm) Agarblöcke ausgestochen und auf die Testplatten überführt. Eine anschließende Inkubation erfolgte für 21 Tage im Brutschrank bei 25°C in Dunkelheit.

Zur Bestimmung der Sporulation wurden mittels Korkbohrer je Testplatte vier Agarblöcke mit einer Größe von 10 mm² abgetrennt und jeweils in 1ml steriles entionisiertes Wasser gebracht.

Die Sporensuspensionen wurden anschließend 30 min. auf einem Horizontalschüttler homogenisiert. Die Auszählung der Konidien erfolgte mittels Thoma-Zählkammer. Der Versuch wurde 8- fach wiederholt.

Die Prüfung der Untersuchungsergebnisse auf Varianzhomogenität mittels Test von Levené ergab, daß die Werte keine Varianzhomogenität aufwiesen. Eine daraufhin durchgeführte statistische Verrechnung der Ergebnisse mittels Krustal - Wallis - Test und anschließendem Test nach Nemenyi (SACHS 1992) erbrachte keine aussagekräftige Signifikanzen. Zur Auswertung wurden deshalb die 95%- Vertrauensbereiche sowie die empirischen Verteilungen ermittelt.

Einfluß auf die Virulenz

Die Untersuchungen zum Einfluß des Ernährungszustandes entomopathogener Pilze auf die Virulenz wurden bei frisch geschlüpften Imagines von E. kuehniellaund P. interpunctelladurchgeführt. Für die Virulenztests dienten jene Nährböden, die im Verlauf der Untersuchungen zum Einfluß auf die Sporulation bei den einzelnen Pilzstämme eine gute Sporenbildung bewirkten. Die einzelnen Pilzstämme wurden auf folgenden Nährböden kultiviert (Abkür-zungen siehe Tabelle 3):

B.ba.56:	Hfa, Riba Sacch., Riba Gluc, CzD Gluc, CzD Glyc, MPA, LPA
M.a.110:	Hfa, Riba Sacch., Riba Gluc, CzD Gluc, CzD Glyc, MPA, LPA, SPA
M.a.73:	Hfa, Riba Gluc, SPA, CzD Gluc, MPA
Paec.f.10:	Hfa, Riba Sacch., Riba Gluc, CzD Gluc, CzD Glyc, MPA, LPA
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P.f.34:	Hfa, Riba Gluc, CzD Gluc, MPA.

Die Pilze wurden zunächst auf den zu testenden Nährböden 21 Tage bei 25°C in Dunkelheit kultiviert. Die Konidien wurden mittels sterilem entionisiertem Wasser unter Zusatz von 0,1 % Tween 80 abgeschwemmt und eine Stunde auf einem Horizontalschüttler homogenisiert.

Anschließend erfolgte mittels Thoma-Zählkammer die Auszählung der Sporen und durch Hinzugabe der entsprechenden Menge an sterilem entionisiertem Wasser die Einstellung auf

10⁷ Sporen / ml. Die gewonnenen Sporensuspensionen wurden nochmals eine Stunde auf einem Horizontalschüttler homogenisiert.

Die Kontamination der Petrischalen erfolgte nach der zu Beginn des Kapitels 4.3 beschriebenen Verfahrensweise. Für die Inokulation wurden die Falter für zwei Stunden in kontaminierte Petrischalen gebracht. Die Inokulation verlief bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 76% und einer Temperatur von 25°C durchgeführt. Das Zusammentreffen zwischen Erreger und Wirts-insekt erfolgte mittels indirekter Inokulation und entsprach somit dem Kontaktmodus in der Praxis. Die Inkubation der behandelten Insekten erfolgte in sauberen Pertrischalen bei

76% Luftfeuchtigkeit, 25°C und Dunkelheit im Brutschrank. Je Versuchsvariante wurden 4 x 24 Insekten getestet.

Für die Auswertung dienten die täglichen Mortalitätsraten. Die Letalwerte wurden mittels Probitanalyse aus den Mortalitätsraten und den logarithmierten Einwirkzeiten ermittelt. Aussagen über statistisch signifikante Unterschiede der berechneten LT₅₀ und LT₉₀ - Werte können aus den zugehörigen Vertrauensbereichen entnommen werden.

4.4. Einfluß der Inokulumdichte auf die Wirksamkeit der Pilze

Als wichtiger Faktor auf seiten des Pilzes stellt sich das Inokulumpotential dar, welches maßgeblich durch die Inokulumdichte bestimmt wird. Es war das Ziel der Untersuchungen, den Einfluß unterschiedlicher Sporendosierungen auf die Wirksamkeit der Pilzstämme gegenüber Dörrobstmotten zu ermitteln.

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Zur Gewinnung von Erregermaterial wurde M. anisopliae 110 und B. bassiana 56 auf Hfa sowie von P. fumosoroseus 10 auf CzD Gluc kultiviert. Die in vitro Anzucht der Pilze erfolgte 21 Tage bei 25°C in Dunkelheit. Die Konidien wurden mit sterilem aqua dest. (0,1% Tween 80) abgeschwemmt und 30 Minuten auf dem Horizontalschüttler homogenisiert. Nachdem Auszählen mittels Thoma-Zählkammer erfolgte die Einstellung auf die gewünschten Sporenkonzentrationen (10⁵, 10⁶ bzw. 10⁷ Sporen / ml).

Pro Pilzstamm und Konzentrationsstufe wurden 4 x 24 Tiere tauchbehandelt. Nach der Inokulation wurden die Insekten bei 76% Luftfeuchtigkeit und 25°C in Petrischalen inkubiert. Die Bonituren erfolgten täglich durch Auszählen der toten und lebenden Tiere. Abgestorbene Falter wurden äußerlich mit Jodtinktur und Alkohol desinfiziert und in feuchte Kammern überführt.

Zur Auswertung der Versuchsergebnisse dienten die mittels Probitanalysen berechneten LT₅₀ und LT₉₀. Zusätzlich wurde der Anteil nachweisbar durch die Pilzstämme abgetöteter Imagines festgestellt. Für Aussagen über statistisch signifikante Unterschiede wurde der Chi²-Test (2 x 2 Kontingenztafelanalyse) durchgeführt.

4.5. Untersuchungen zur Wirksamkeit entomopathogener Pilze auf Eier sowie Larvenstadien von P. interpunctella

Kenntnisse über die Infektionsbedingungen auf seiten der Zielinsekten sind für die Entwicklung einer Anwendungsstrategie ebenso wichtig wie Informationen zur Isolatvirulenz und zum Einfluß der Umweltfaktoren. Bei einer Inokulation anfälliger Wirtstiere mehrerer Stadien lassen sich die Erreger leichter in der Wirtspopulation etablieren, wodurch die Erfolgsaussichten der Bekämpfungsmaßnahme erheblich erhöht werden.

Anfälligkeit der Eier

Die Bestimmung der Wirksamkeit auf die Eier der Dörrobstmotte erfolgte mit Konidien von M.a.110, B.ba.56 und Paec.f.10. Für die Untersuchungen wurden M.a.110 und B.ba.56 auf Hfa und Paec.f.10 auf CzD Gluc bei 25°C im Brutschrank kultiviert. Nach erfolgter Sporulation wurden die Konidien mit sterilem aqua dest. (+ 0,1% Tween 80) abgeschwemmt.

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Der Versuch zur Eimortalität nach unterschiedlicher Pilzbehandlung wurde in Petrischalen angesetzt, die analog der im Abschnitt 4.3 beschriebenen Verfahrensweise präpariert waren. Die Sporendosierungen wurden so gewählt, daß die Applikation von 1 ml Sporensuspension pro Petrischale eine Applikationsdosis von 2 x10⁵ / cm², 2 x 10⁶ / cm² und 2 x 10⁷ / cm² ergab.

Die Auswahl von drei Konzentrationsstufen sollte Hinweise auf die Anfälligkeit der Dörr-obstmotten-Eier bei unterschiedlicher Konzentration des Inokulums erbringen, welche Rückschlüsse auf eine praktische Bekämpfungsmöglichkeit von Eiern zulassen.

Zur Inokulation wurden die Eier mit einem Pinsel in die Schalen gebracht. Genutzt wurden ausschließlich 24 h alte Eier. Die Inkubation erfolgte im Exsikkator bei 76% r.F. und in Abhängigkeit von der Temperatur. Als Inkubationstemperatur wurden 20 und 25°C gewählt. Pro Variante erfolgten vier Wiederholungen mit je 20 Eiern.

Zur Auswertung wurde die Anzahl schlüpfender Eilarven ermittelt. Die Prüfung der Untersuchungsergebnisse auf Normalverteilung mittels K-S-Lillefors-Test zeigte, daß die Werte nicht normal verteilt waren. Für die statistische Verrechnung wurden deshalb die Daten zunächst umgeformt ($

Altersbedingte Sensitivität der Larvenstadien

Es war das Ziel der Untersuchungen, Aussagen über die Anfälligkeit verschiedener Larvenstadien von P. interpunctella gegenüber virulenten Pilzstämmen zu treffen. In Laborversuchen wurden die ersten vier Larvenstadien der Dörrobstmotte getestet. Um Rückschlüsse über eine praktische Bekämpfbarkeit der Schädlinge ziehen zu können, erfolgten die Untersuchungen unter lagerähnlichen Bedingungen bei 76% Luftfeuchtigkeit, 25°C und in Dunkelheit.

Gegenüber den verschiedenen Larvenstadien der Dörrobstmotte wurden jene Pilzstämme getestet, die sich im Verlauf der vorherigen Untersuchungen zur Virulenz als wirksam erwiesen hatten. Basierend auf den Ergebnissen des Kapitels 5.2.3 erfolgte die Anzucht der virulenten Pilzstämme auf den entsprechenden Nährböden.

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Da selbst innerhalb eines Larvenstadiums die Resistenz gegenüber einem Pilzstamm bei steigendem Alter zunehmen kann, erfolgten die Untersuchungen an Larven, welche innerhalb der letzten 24 Stunden geschlüpft waren, bzw. sich gehäutet hatten.

Zur Inokulation wurden die Testlarven für 25 Minuten in kontaminierte Petrischalen gebracht. Die Sporenapplikation und die Inkubation entsprachen der bei der Virulenztestung im Kapitel 4.3 beschriebenen Verfahrensweise. Für jedes Larvenstadium wurden pro Pilzstamm 96 Insekten getestet. Zum Vergleich begleitete eine unbehandelte Kontrollvariante den Versuch.

Die abgestorbenen Larven wurden täglich ausgesondert und mit 96%-igem Alkohol sowie einer Jodtinktur äußerlich desinfiziert. Zum Nachweis der Infektion wurden die Insektenkadaver anschließend in feuchte Kammern überführt. Die Erfolgsbonitur wurde sieben Tage nach der Inokulation vorgenommen.

Um die Sterblichkeit der unbehandelten Kontrolltiere berücksichtigen zu können, wurde zur Auswertung der Versuchsergebnisse der Wirkungsgrad für die verschiedenen Pilzstämme nach SCHNEIDER - ORELLI errechnet (FRÖHLICH 1979). Der Vergleich der Varianten erfolgte anhand des angenähertem 95%-Vertrauensbereiches (SACHS 1992).

4.6. Einfluß der Sporenformulierung auf die Wirksamkeit der Pilze

Einfluß auf die Infektiosität der Pilze

Um die Wirksamkeit unterschiedlich formulierter Konidienpräparate zu testen, wurden 24 h alte L₁, L₅ sowie Imagines von P. interpunctella behandelt. Die Untersuchungen erfolgten mit den virulenteren Pilzstämmen M.a.110 und B.ba.56.

Die Sporen wurden nach der in Kapitel 4.3 beschriebenen Verfahrensweise gewonnen. Für jedes Pilzisolat wurden drei verschiedene Formulierungen zubereitet. Als Wassersuspension

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Des weiteren wurde jeder Pilzstamm in Form einer ölhaltigen Konidiensuspension sowie als Sporenstaub getestet. Für die Zubereitung der ölhaltigen Konidiensuspension wurde der aus aqua dest + 0.1 Tween 80 bestehenden Sporensuspension eine entsprechende Menge der Rapsölformulierung Telmion (Firma Temmen Hattersheim) beigefügt. Telmion ist ein nicht giftiges biologisches Pflazenschutzmittel und besteht zu 85% aus Rapsöl und aus 15% Emulgator. Die Wasser-Ölformulierungen wurden mit einem Shaker homogenisiert. Der Telmion Anteil der Suspension betrug 10%. Die Einstellung auf die gewünschte Konidienkonzentration erfolgte nach Auszählen der Sporen durch Hinzugabe der entsprechenden Menge an aqua dest. und Telmion.

Für die Herstellung der Sporenstäube diente Laktose. Zunächst wurden die Konidien vorsichtig abgepinselt und bei 30°C im Trockenschrank getrocknet. Den Konidien wurde anschließend eine abgemessene Menge an Laktose beigemischt. Das Homogenisieren erfolgte durch vorsichtiges Vermischen im Mörser. Zur Einstellung der Dosierung wurde 0,01 g des gewonnenen Sporenstaubes in 1 ml sterilem entionisiertem Wasser suspendiert. Nach Auszählung der Konidien mittels Thoma-Zählkammer wurde die zur Einstellung der gewünschten Sporendosierung notwendige Menge an Laktose errechnet und dem Sporenstaub zugegeben. Nach dem Homogenisieren erfolgte erneut eine Sporenzählung. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis der Konidienstaub 1 x 10⁸ Sp. / g Laktose enthielt.

Zur Inokulation der Larven und Imagines wurden die für die beiden Pilzstämme zubereiteten Konidienformulierungen auf Hartpappe appliziert, welche auf der Innenseite von Petrischalen klebte. Die Konidiensuspensionen wurden mittels DC-Sprühgerät mit Treibmittel versprüht. Die Applikation des Sporenstaubs erfolgte mittels Feinsieb. Die Sporendosierungen wurden so gewählt, daß für die einzelnen Versuchsvarianten eine Applikationsdosis von 2 x 10³, 2 x 10⁴, 2 x 10⁵ und 2 x 10⁶ Sp. / cm² ergab.

Für die beiden Larvenstadien und die Imagines wurden pro Pilzstamm und Formulierung 96 Tiere in die kontaminierten Petrischalen gebracht. Es wurden stets sechs Testinsekten 30 min. behandelt und anschließend in saubere Petrischalen überführt. Die Inkubation erfolgte bei 76% Luftfeuchtigkeit, 25°C und in Dunkelheit.

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Tote Tiere wurden desinfiziert und in feuchte Kammern 7d lang auf Verpilzungen hin überprüft.

Für die statistische Auswertung der Mortalitätsraten zum Zeitpunkt der Endbonitur diente der Chi²-Test (2 x 2 Kontingenztafelanalyse). Aus den kumulativen Mortalitätsraten der Imagines wurden für jeden Pilzstamm für die 2 x 10⁶ Sp. / cm² Dosierung mittels Probitanalyse die LT₅₀- und LT₉₀-Werte ermittelt.

Zur Ermittlung des Einflusses der Formulierung auf die Infektiosität der Pilzsporen nach erfolgter Anhaftung auf der Wirtsoberfläche wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erregerstämme als Wasser- und Wasser-Ölsuspensionen direkt auf frisch geschlüpfte L₅ appliziert. Die Sporendosierungen waren so gewählt, daß die Applikation von 0,1 ml / Testinsekt eine Applikationsdosis von 1 x 10², 5 x 10², 1 x 10³, 5 x 10³, 1 x 10⁴, 5 x 10⁴, 1 x 10⁵, 5 x 10⁵, 1 x 10⁶ und 5 x 10⁶ ergab. Um den Einfluß der Luftfeuchtigkeit auf die Wirksamkeit unterschiedlich formulierter Pilzpräparate zu klären, wurden die Inokulation und die anschließende Inkubation bei 76% und 96% r.F. durchgeführt.

Die Erfolgsbonitur erfolgte fünf Tage nach der Inokulation. Pro Versuchsvariante wurden 4 x 20 Larven getestet.

Aus den Versuchsergebnissen wurden mittels Probianalysen für jeden Pilzstamm und jede Sporenformulierung in Abhängigkeit von der Luftfeuchtigkeit die LD₅₀-, LD₉₀-Werte sowie die dosierungsabhängigen Mortalitätskurven berechnet.

Einfluß auf die Lagerfähigkeit und Persistenz der Konidien von B. bassiana 56 und M. anisopliae 110

Die durchgeführten Untersuchungen dienten zur Bestimmung der Lagerfähigkeit unterschiedlich formulierter Konidien von M.a.110 und B.ba.56. Des weiteren sollte das Persistenzverhalten der Pilze unter den im Lager anzutreffenden Bedingungen überprüft werden.

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Die Kultur von M.a.110 und B.ba.56 erfolgte auf Hfa bei 25°C für 21 Tage bei Dunkelheit im Brutschrank.

Für die Untersuchungen wurden die Konidien als Wasser - und Wasser-Telmion-Suspension sowie als Laktose-Sporenstaub formuliert. Als Vergleichsvariante wurden unformulierte Konidien getestet. Die Zubereitung der Formulierungen wurde nach der in Abschnitt 4.6 beschriebenen Verfahrensweise vorgenommen.

Die Überprüfung des Keimungsverhaltens in Abhängigkeit von der Zeit erfolgte bei einer Lagertemperatur von 4°C, 16°C und 26°C. Zur Aufbewahrung der Sporenformulierungen dienten autoklavierte geschlossene Plasteröhrchen. Die Lagerung des Laktose-Sporenstaubes sowie der unformulierten Konidien erfolgte in geöffneten Röhrchen bei einer von DAOUST und ROBERTS (1983) empfohlenen relativen Luftfeuchtigkeit von 97%.

Zunächst wurde die Keimfähigkeit der Konidien direkt im Anschluß an die Formulierung bestimmt. 1 mg des Sporenstaubes sowie 0,1 mg der reinen Konidien wurden in 1 ml sterilem aqua dest. suspendiert. Sämtlichen Sporenpräparate wurde vor der Inkubation Glucose und Pepton aus Kasein hinzugegeben (zu je 0,5%). Anschließend wurden acht Tropfen jeder Sporensuspension auf sterilisierte Objektträger mit Adhäsionswirkung gebracht. Nachdem die

Suspensionen getrocknet waren, erfolgte die Inkubation für 48 h bei 25°C in feuchte Kam-mern. Einhundert zufällig ausgewählte Sporen wurden unter dem Lichtmikroskop auf ihre Keimung hin geprüft.

Für die Ermittlung der Keimfähigkeit unterschiedlich gelagerter Konidien wurden die Sporenkeimungstests monatlich über einen Zeitraum von ein Jahr wiederholt. Vor jedem Zählvorgang wurde die Anzahl an Sporen ermittelt, die bereits im Verlauf der Lagerperiode keimten. Für den Vergleich der Ergebnisse galten diese Sporen als nicht mehr infektiös.

Begleitend zu den Lagerungsversuchen wurden die Sporenformulierungen auf ihre Persistenz unter lagerähnlichen Bedingungen hin überprüft. Die zubereiteten Sporenformulierungen wurden zunächst auf sterilisierte Objektträger mit Adhäsionswirkung gebracht. Nach dem diese Suspensionen angetrocknet waren, erfolgte die Aufbewahrung in sterilisierten Petrischalen bei 25°C, 76 r.F. und Dunkelheit im Brutschrank. Jede Versuchsvariante wurde 8-fach wiederholt.

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4.7. Einsatzerprobungen von B. bassiana 56, M. anisopliae 110 und P. fumo soroseus 10 gegen P. interpunctella

4.7.1. Untersuchungen zur Wirkung der Pilze auf die Fekundität, Eier und schlüpfende Eilarven sowie auf die Schlupfrate, Lebensdauer und Fekundität der Imagines von P. interpunctella nach Applikation auf die Brutsubstratoberfläche

Wirkung auf Fekundität, behandelte Eier und schlüpfende Eilarven

Zur Beurteilung kurativer Effekte einer Pilzbehandlung sind Kenntnisse über die Auswirkung auf die Nachfolgegeneration unabdingbar. Ausgehend von den bisher gewonnenen Versuchsergebnissen, war es das Ziel der Untersuchungen, in einem Laborversuch die Wirkung einer Pilz-infektion auf die Fekundität behandelter Weibchen sowie auf behandelte Eier und schlüpfende Eilarven zu überprüfen.

Für den Versuch wurden die Weibchen von P. interpunctella zum Zeitpunkt der Kopulation in kontaminierte Petrischalen gebracht. Die Präparation der Petrischalen erfolgte nach der in Abschnitt 4.3 beschriebenen Verfahrensweise. Es wurden M.a.110, B.ba.56 und Paec.f.10 in einer Dosierung von 2 x 10⁶ So. / cm² getestet. Je Behandlungsvariante wurden acht Weibchen überprüft.

Nach Abschluß der Kopulation wurden die Weibchen in saubere Petrischalen überführt.

Die gelegten Eier wurden täglich ausgezählt und mit einem Haarpinsel vorsichtig in mit konta-miniertem Filterpapier ausgelegten Petrischalen übertragen. Es wurde Filterpapier mit einem Durchmesser von 9 cm verwendet, welches sich in der Mitte von 14 cm Petrischalen befand. Der unbehandelte äußere Rand wurde mit Mandeln ausgelegt. Diese Verfahrensweise ermöglichte die Inokulation von Eilarven, die sich nach dem Schlupf zu dem unbehandelten Fraßsubstrat bewegen konnten.

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Für den Vergleich der Anzahl gelegter Eier je Weibchen bei unterschiedlicher Pilzbehandlung erwies sich nach Testung der Daten auf Varianzhomogenität mittels Levené-Test sowie auf Normalverteilung mittels K-S-Lillefors-Test, eine einfaktorielle Varianzanalyse mit anschließendem NEWMAN-KEULS-Test als geeignet.

Für die statistische Berechnung der Versuchsergebnisse zur Eimortalität nach unterschiedlicher Pilzbehandlung erfolgte eine Umformung des Datenmaterials mittels Winkeltransformation (SACHS 1992). Anschließend wurden die transformierten Daten mit Varianzanalyse und NEWMAN-KEULS-Test ausgewertet.

Zur Auswertung der Versuchsergebnisse zum Einfluß der Pilzbehandlung auf die Mortalität der Eilarven wurde der Chi²-Test (2 x 2 Kontingenztafelanalyse) angewendet.

Einfluß der Pilze auf die Schlupfrate, Lebensdauer und Fekundität der Imagines nach Oberflächenbehandlung des Brutsubstrates

Um die Wirksamkeit einer Lagergutoberflächenbehandlung auf die präimaginalen Stadien und schlüpfenden Falter zu ermitteln, wurden in einem Laborversuch Konidien von M.a.110, B.ba.56 und Paec.f.10 in Form einer Wasser-Telmion-Formulierung auf die Oberfläche von Mandelschrot gesprüht.

Für die Kultivierung der Pilze und die Herstellung der Sporensuspensionen dienten die in Abschnitt 4.3 beschriebenen Verfahrensweisen. Die Applikation der Pilzsuspensionen erfolgte mittels DC-Sprühgerät mit Treibmittel.

Für den Versuch wurden 24 h alte Eier verwendet, die von befruchteten Weibchen in Petrischalen gelegt worden waren. Die Eier wurden abgepinselt, ausgezählt und auf die kontaminierte Oberfläche überführt.

Als Versuchsgefäße dienten 0,45 l Gläser, die mit 180 g Mandelschrot gefüllt waren. Die Substratoberfläche je Gefäß betrug etwa 78,5 cm². Diese wurde mit 1 ml einer 5 x 10⁷ Sp. / ml Suspension besprüht. Um ein Entweichen der geschlüpften Falter zu vermeiden, waren die Gläser mit Gaze abgedeckt. Je Gefäß wurden 96 Eier auf die behandelte Brutsubstratoberfläche gegeben. Der Versuch wurde bei 76% r.F. und 25°C durchgeführt und 4-fach wiederholt. Zum Vergleich wurde eine unbehandelte Kontrollvariante angesetzt.

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Pro Variante und Wiederholung wurden fünf befruchtete Weibchen in saubere Petrischalen überführt. Täglich erfolgte die Auszählung gelegter Eier. Außerdem wurde die Eimortalität festgehalten.

Zur statistischen Auswertung des Anteils geschlüpfter sowie anschließend verpilzter Imagines diente der Chi²-Test (2 x 2 Kontingenztafelanalyse). Für Vergleiche der Lebensdauer von Imagines bei unterschiedlicher Pilzbehandlung wurden die LT₅₀-Werte ermittelt. Für die Auswertung der Anzahl gelegter Eier je Weibchen erwies sich nach Testung auf Varianzhomogenität und Normalverteilung eine einfaktorielle Varianzanalyse mit anschließendem NEWMANN-KEULS-Test als geeignet.

4.7.2. Untersuchungen zur Wirkung einer Konidienanwendung nach Beimischung zum Brutsubstrat einschließlich einer Ausnutzung der Lockwirkung geeigneten Substrates

Die Bestimmung der Wirksamkeit entomopathogener Pilze gegenüber Dörrobstmotten nach Beimischung der Konidien zum Brutsubstrat erfolgte in einem Modellversuch unter lagerähnlichen Bedingungen bei 25°C, 76% r.F.. und in Dunkelheit. Zur Kontaminierung wurden Konidien von M.a.110 und B.ba.56 verwendet, die analog der in Abschnitt 4.3. beschriebenen Verfahrensweisen hergestellt und als Sporenstaub formuliert wurden. Als Versuchsgefäße dienten 0,45 l Gläser, die mit 180 g Mandelschrot bzw. gemahlenen Mandeln gefüllt waren. Pro Versuchsgefäß wurden 10 g der Laktose-Formulierung mit einer Dosierung von 5 x 10⁷ Sp. / g Sporenstaub beigemischt. Die Behandlung der Kontrollvarianten erfolgte mit reiner Laktose.

Zur Inokulation wurden Dörrobstmotten-Eier nach der im vorherigen Abschnitt beschriebenen Methode gewonnen und in die mit kontaminiertem Brutsubstrat gefüllten Versuchsgefäße überführt. Es wurden pro Gefäß 96 Eier inokuliert, die innerhalb der letzten 24 h gelegt waren. Der Versuch wurde 4-fach wiederholt. Die geschlüpften Imagines wurden täglich ausgezählt.

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Mit dem Ziel, die Lockwirkung von Röstaromen auf Weibchen der Dörrobstmotte für die Entwicklung einer mikrobiellen Anwendungstechnologie auszunutzen, wurde gerösteter und mit Pilzsporen kontaminierter Mandelbruch verwendet, welcher nach HOPPE (1981) die Eiablage der Weibchen stimuliert. Zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Behandlung von Brutsubstrat mit hoher Attraktanz auf befruchtete Weibchen, wurden den Insekten gleichzeitig unbehandelte Alternativsubstrate angeboten. Als Brutsubstrat dienten lose Haferflocken bzw. ungerösteter verpackter Mandelbruch. Dazu wurden 25 cm x 8 cm x 4 cm Pappkartons verwendet.

Die Sporengewinnung, Formulierung und Kontamination des gerösteten Mandelbruchs erfolgten nach der oben beschriebenen Verfahrensweise mit dem als wirksamer angesehenen Pilzstamm M.a.110.

Die Untersuchungen wurden in 80 cm x 40 cm x 40 cm Käfigen bei 25°C und 70%r.F. (± 5%) durchgeführt. Vor dem Freilassen der befruchteten Weibchen wurden in jedem Versuchskäfig ein 450 ml Glasgefäß mit 180 g kontaminiertem und geröstetem Mandelbruch sowie die gleiche Menge eines unbehandelten Alternativsubstrates aufgestellt. Als Kontrollvariante wurden Käfige ohne behandeltem Brutlockstoff angesetzt. Pro Käfig wurden vier befruchtete Weibchen freigelassen.

Nach 21 Tagen wurden sämtliche Gefäße bzw. Verpackungen aus den Käfigen entfernt und einzeln aufbewahrt, um anhand des Falterschlupfes die Wirksamkeit der Behandlungsmethode bestimmen zu können.

Der Versuch wurde 4-fach wiederholt.

Zur Auswertung wurde die Anzahl pro Käfig geschlüpfter Imagines ermittelt. Für die statistische Verrechnung der Ergebnisse erfolgte nach dem Test auf Varianzhomogenität und Normalverteilung ein Vergleich mittels t-Test zwischen der Anzahl geschlüpfter Falter in Käfigen mit und ohne geröstetem und Pilz kontaminiertem Mandelbruch.

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4.7.3. Untersuchungen zur Wirkung einer Konidienanwendung nach Oberflächenbehandlung von Verpackungsmaterial

Die Bestimmung der Wirksamkeit einer Behandlung von Verpackungsmaterial mit Sporen entomopathogener Pilze erfolgte in einem Laborversuch bei 25°C, bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von etwa 70% (± 5%) und in Dunkelheit.

Als Verpackung dienten 25 cm x 8 cm x 4 cm große Pappkartons, die zunächst zur Beseitigung von anhaftenden Mikroorganismen, welche die Wirkung der Pilzpräparate beeinflussen könnten, für 20 min. bei 120°C autoklaviert wurden. Jeder Karton wurde mit 200 g Mandelbruch gefüllt. Zum Verschließen der Einfüllöffnungen diente Tesafilm. Zur Kontamination der Verpackungen wurden die Pilzsporen als Wasser-Ölformulierung (10% Telmion) mittels DC-Sprühgerät mit Treibmittel auf die Oberfläche der Kartons versprüht. Bei den Untersuchungen dienten Konidien von M.a.110 und B.ba.56 als Inokulum. Die Sporen wurden in einer Dosierung von etwa 5 x 10⁶ Sp./ cm² ausgebracht. Den Kontrollvarianten wurde Wasser-Telmion zugegeben, oder sie blieben unbehandelt.

Nach der Kontamination erfolgte die Aufstellung der mit Mandelbruch gefüllten Verpackungen in Versuchskäfigen (Breite: 40 cm, Länge: 80 cm, Höhe: 40 cm). In jedem Käfig wurden acht Kartons untergebracht und anschließend eine unterschiedliche Anzahl befruchteter Dörrobstmottenweibchen freigelassen. Es wurden Varianten mit 2, 4 und 8 Weibchen pro Käfig angesetzt. Diese Verfahrensweise sollte es ermöglichen, Informationen über die Wirksamkeit behandelten Verpackungsmaterials bei unterschiedlicher Schaderregerdichte zu gewinnen. Pro Behandlungsvariante und für jede Schädlingsdichte erfolgten vier Wiederholungen. 28 d nach dem Zusetzen der Insekten wurde die Erfolgsbonitur durchgeführt. Erfaßt wurde die Anzahl lebender Larven.

Für die statistische Auswertung der Versuchsergebnisse erwies sich eine zweifaktorielle Varianzanalyse als geeignet.

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4.7.4. Untersuchungen zur Übertragung der Konidien von M. anisopliae 110 unter Ausnutzung der Lockwirkung von Sexualpheromonen der Dörrobstmotte

Die Untersuchungsergebnisse zum Einfluß einer Pilzbehandlung von Dörrobstmotten-Weibchen zum Zeitpunkt der Kopulation veranschaulichten eine deutliche Auswirkung auf die Fekundität der Insekten (s. 5.7.1).

Im Verlauf der vorliegenden Untersuchungen sollte in einem Flugversuch überprüft werden, ob mit Hilfe des Sexualpheromons TDA frisch geschlüpfte Dörrobstmotten-Männchen an eine mit Pilzsporen kontaminierte Stelle angelockt werden können, um mit Konidien inokuliert zu werden und um anschließend die Erreger während der Kopulation auf gesunde Weibchen zu übertragen.

Die Untersuchungen erfolgten mit dem gegenüber adulten Dörrobstmotten wirksameren Laktose-Konidienstaub.

Zunächst wurden die von 21 Tage alten Pilzkulturen geernteten Konidien angefärbt, um die Kontamination der Männchen sowie die Übertragung der Sporen auf die Weibchen unter dem Fluoreszenzmikroskop nachweisen zu können. Als Farbstoff diente Acridinorange, welches zunächst in 0,1 mol Natriumphosphat Puffer bei pH 8,0 gelöst wurde. Die Herstellung des Puffers erfolgte analog der von SCHULZE und GRAUPNER (1960) beschriebenen Verfahrensweise. 1 ml der Acridinorange-Lösung wurde jeweils zu 1 g trockenen Metarhizium anisopliae - Konidien zugegeben. Die anschließende Trocknung der gefärbten Sporen erfolgte im Trockenschrank bei 30°C.

Zur Herstellung der Formulierung wurden die gefärbten Konidien nach der im Abschnitt 4.6 beschriebenen Verfahrensweise mit dem Laktose-Pulver vermischt. Die Sporenkonzentration betrug 1 x 10⁸ Sp. / g Laktose.

Für den Modelversuch wurden zwei geschlossene Räume mit folgenden Abmessungen ausgewählt:

Raum A 175 cm x 120 cm x 230 cm ; Raum B 175 x 175 x 230 (Länge x Breite x Höhe).

In der Mitte jedes Versuchsraumes wurde ein offener Pappkarton (50 cm x 50 cm x 10 cm) aufgestellt, dessen Innenflächen zuvor mit dem angefärbten Sporen-Laktose-Staub kontaminiert worden sind. Für jeden Karton wurden 10 g des Konidienstaubes mit Hilfe eines Siebes appliziert. Im Zentrum des behandelten Kartons befand sich der Pheromon-Köder (Firma Temmen Hattersheim).

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21 Tage nach Beginn des Flugversuches wurden sämtliche toten Motten aufgesammelt und auf anhaftende Pilzsporen hin unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

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