I

Anhang A. Anhang

Anhang 1

Czapek-Dox-Flüssigmedium:

FeSO4 x 7H2O	0,01 g
MgSO4 x 7H2O	0,5 g
KCl	0,5 g
KH2PO4	1,0 g
NaNO3	2,0 g
Saccharose	15,0 g
Aqua dest. ad 1 l

Einstellen des pH-Wertes vor dem Autoklavieren mit 1 N NaOH auf 5,8.

Anhang 2

Slight Nutrient Agar (SNA) nach NIRENBERG (1976):

KH2PO4	1,0 g
KNO3	1,0 g
MgSO4 x 7H2O	0,5 g
KCl	0,5 g
Glucose	0,2 g
Saccharose	0,2 g
Agar-Agar	18,0 g
Aqua dest. ad 1 l

pH-Wert vor dem Autoklavieren mit 1 N NaOH auf 5,5 eingestellt.

II

Anhang 3

Ausstattung der GAT: UV-VIS-Detektoren, GAT-LCD 502 (single wavelength) und GAT-PHD 601 (multi wavelength); LC 1431 System Organizer; Pumpen, LC 1500, LC 1110 HPLC Pumps; DP 800 Data Interface.

Trennsystem: Säule - Sperisorb ODS-2, 10 µm, 120 x 16 mm, Gradient - A: Acetonitril, B: 0,01M TEAAC, pH 6,5,

Zeit (min)	A (%)	B (%)
0,01	0	100
5	10	90
20	60	40
25	60	40
26	0	100

Detektiert wurde bei = 270 nm.

Anhang 4

Nährlösung:		Reinnährstoffgehalt (mg/l):
Ca(NO3)2 x 4H2O	0,88 g	N - 100 mg / Ca - 150 mg
NaH2PO4 x 2H2O	0,126 g	P - 25 mg
K2SO4	0,39 g	K - 175 mg
MgSO4 x 7H2O	0,31 g	Mg - 30 mg
Chelaplex (C10H13O8N2Fe)	0,0031 g	Fe - 0,5 mg
Mikronährelementelösung	1,0 ml
Aqua dest. ad 1 l

pH-Wert mit 1N KOH auf 5,8 eingestellt, (EC-Wert 1,4 mS x cm-1 bei 24 °C)

III

Mikronährelementelösung:		Reinnährstoffgehalt (mg/l):
MnSO4 x 4H2O	1,01 mg	Mn - 0,25 mg
H3BO3	0,56 mg	B - 0,1 mg
CuSO4 x 5H2O	0,098 mg	Cu - 0,025 mg
ZnSO4 x 7H2O	0,124 mg	Zn - 0,05 mg
(NH4)6Mo7O24 x 4H2O	0,322 mg	Mo - 0,025 mg
Aqua dest. ad 1 l

Anhang 5

Herstellung der etherischen Diazomethanlösung:

• 4,5 ml 40 % (w/v) KOH und 15 ml Diethylether 5 min im Eisbad gerührt,
• spatelspitzenweise Zugabe (Hornspatel) von 1,5 g N,N - Nitrosemethylharnstoff,
• nach der vollständigen Auflösung wurde die Etherphase abgenommen und Ansatz erneut mit 5 ml Diethylether für ca. 5 min gerührt,
• die Etherphase wurde erneut abgenommen und mit der ersten Etherphase vereinigt,
• danach Zugabe von 3 Plätzchen KOH zur Trocknung,
• das Substanzgemisch wurde bei -20 °C aufbewahrt,

Beim IAA-ELISA verwendete Lösungen:

• IAA-ME Antigen in methanolischer Stammlösung in einer Konzentration von 1000 nM / 100 µl
• RAMIG (Anti Mouse IgG; Sigma Nr. M-9637) 1 : 1000 Verdünnung
• Enzym-gekoppeltes Antigen (Eigensynthese; FB Biologie der HUB)
• TBS-Puffer pH 7,8 (6,05 g Tris, 0,58 g NaCl, 0,203 g MgCl2)
• TBS / Gelatine-Puffer ( 1 g Gelatine / 1 l TBS-Puffer; 30 min autoklaviert)
• NaHCO3-Puffer 50 mM, pH 9,6

Paranitrophenylphosphat (Sigma Nr. D-9286)

IV

Anhang 6

Zusammensetzung der Somogyi- und Nelson-Reagenz:

1. SOMOGYI-Reagenz:

2. SOMOGYI I:

   • 144 g Natriumsulfat (Na2SO4) gelöst in 500 ml Aqua dest.,
   • Zugabe von 12 g Rochelle Salz (C4H4KNaO6 x 4 H2O), 24 g Natriumcarbonat (Na2CO3) und 16 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3),
   • Lösung mit Aqua dest. auf 800 ml auffüllen,
   • Lösung bei 27 °C ca. 4 Wochen haltbar,

3. SOMOGYI II:

   • 36 g Natriumsulfat (Na2SO4) in 150 ml Aqua dest. lösen,
   • Zugabe von 4 g Kupfersulfat (CuSO4 x 5 H2O) und Lösung auf 200 ml mit Aqua dest. auffüllen,
   • Lösung bei 27 °C ca. 4 Wochen haltbar,
4. NELSON-Reagenz:
5. • 25 g Ammoniummolybdat ((NH4)6Mo7O24 x 4 H2O) in 450 ml A. dest. lösen,
   • Zugabe von 21 ml konz. Schwefelsäure (H2SO4),
   • 12 g Natriumarsenat in 100 ml A. dest. lösen und davon 25 ml der Ammoniummolybdat - Lösung zugeben,
   • gesamtes Gemisch in einer dunklen Glasflasche für 24 - 48 Stunden bei 37 °C reagieren lassen und danach bei Raumtemperatur aufbewahren.

V

Anhang 7

Zusammensetzung der verwendeten Probenpuffer:

SDS-Probenpuffer (2000 µl):	2D-Probenpuffer (2000 µl):
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8	900 µl	Harnstoff	1,080g
Bromphenolblau	100 µl	EDTA/KCl/Tris-HCl (pH 6,8)	1,000 ml
(0,04 % (w/v) in Ethanol 10 %)	1 M Dithiotreithol (DTT)	140 µl
Glycerol	200 µl	Ampholyt 4-6 (Bio-Rad)	100 µl
SDS 10 % (w/v)	600 µl	Glycerol	250 µl
ß-Mercaptoethanol	200 µl	Pefabloc	40 µl

EDTA/KCl/Tris-HCl:

0,5 M Tris-HCl (pH 6,8)	500 µl
EDTA	11,2 mg
KCl	37,3 mg
ad 10 ml Aqua dest.

Anhang 8

Zusammensetzung der Gradienten- und Rundgele:

(Angaben in ml / Gel)

	Trenngel		Sammelgel
	10%	15%
Aqua dest.	4,450	2,450	1,160
Trenngelpuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8)	3,194	3,194	/
Sammelgelpuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8)	/	/	2,500
Acrylamid*	4,000	6,000	0,840
Natriumdodecylsulfat (SDS) 10 % (w/v)	0,252	0,252	0,050
Tetramethylendiamin (TEMED)	0,008	0,008	0,005
Ammoniumperoxodisulfat (APS) 10 % (w/v)	0,075	0,075	0,050

VI

* Acrylamidlösung:	29,2 % (w/v) Acrylamid
	0,8 % (w/v) N,N - Methylenbisacrylamid, (30 % T, 2,7 % C)

Zusammensetzung der Rundgele:

Harnstoff	5,400 g
Aqua dest.	3,460 ml
Acrylamid*	1,340 ml
Ampholyt (BIO-RAD) 5-8	0,400 ml
Ampholyt (BIO-RAD) 3-10	0,100 ml
Glycerol	0,500 ml
TEMED	0,003 ml
APS 10 %	0,030 ml
*Acrylamidlösung:	29,2 % (w/v) Acrylamid
	0,8 % (w/v) Piperazindiacrylamid

Anhang 9

Zusammensetzung des Laufpuffers (10x konzentriert):

Tris	30 g
Glycin	144 g
SDS	10 g
ad 1000 ml Aqua dest. (pH 8,2 - 8,5)

verwendete Proteinstandards:	92,5 kDa	Phosphorylase B
(TM 4 und 5)	67 kDa	Bovine serum albumin (BSA)
	45 kDa	Ovar albumin
	29 kDa	Carbonanhydrase
	21 kDa	Trypsin inhibitor (soybean)
	12,5 kDa	Cytochrome C
	6,5 kDa	Trypsin inhibitor (bovine lung)

VII

Anhang 10

Verwendete Lösungen sowie die Laufparameter bei der 2D-PAGE:

Elektrolyte:
Katholyt	20 mM NaOH
Anolyt	10 mM H3PO4

Die Elektrolyte wurden immer frisch unmittelbar vor ihrem Gebrauch angesetzt.

Overlay-Puffer: (10 ml):	Bromphenolblau-Glycerol-Lösung (2 ml):
Harnstoff	3,005 g	Bromphenolblau	100 µl
Glycerol	0,5 ml	(0,04 % (w/v) in Ethanol 10 %)
Ampholyt 5 - 8	0,165 ml	Glycerol	200 µl
Ampholyt 3 - 10	0,085 ml	SDS 10 %	600 µl
ad 10 ml Aqua dest.		Tris-HCl (pH 6,8)	900 µl
		ad 2 ml Aqua dest.

Zusammensetzung des 2D-Standards:

76,0 kDa, pI 5,9	Conalbumin	31,0 kDa, pI 5,9	Carbonanhydrase
66,2 kDa, pI 5,2	Albumin	21,5 kDa, pI 4,5	Trypsin inhibitor
43,0 kDa, pI 5,0	Actin	17,5 kDa, pI 7,0	Myoglobin
36,0 kDa, pI 8,5	GAPDH

Equilibrierungslösung (10 ml):	Laufparameter:
ohne Jodacetamid		30 min	200 V
Aqua dest.	2,000 ml	75 min	400 V
Tris-HCl (pH 6,8)	2,500 ml	75 min	600 V
Glycerol	2,000 ml	20 min	800 V
SDS 10 %	3,000 ml	10 min	1000 V
1 M DTT	0,500 ml

Die Equilibrierungslösung mit Jodacetamid hatte die gleiche Zusammensetzung enthielt jedoch 370 mg Jodacetamid.

VIII

Anhang 11

Fixierlösung:

Ethanol	50 % (v/v)
Essigsäure	10 % (v/v)

Silberfärbung:

Ethanol 10 % (v/v)	10 min
Periodsäure 0,7 % (w/v)	10 min
Ethanol 10 % (v/v)	2 x 5 min
Aqua dest.	3 x 3 min
Na2S2O3 0,02 % (w/v)	1 min
Aqua dest.	3 x 20 sek
AgNO3 0,2 % (w/v), Formalin 0,03 % (v/v)	30 min
Aqua dest.	20 sek
Na2CO3 6 % (w/v), Formalin 0,02 % (v/v)	bis Banden sichtbar wurden
Na-EDTA 1,86 % (w/v)	10 min

Coomassie Färbung:

Die Gele wurden für mind. 1 h in folgendem Gemisch gefärbt:

Coomassie Briliant Blue	0,2 % (w/v)
Ethanol	50 % (v/v)
Essigsäure	40 % (v/v)
Aqua dest.	10 %

Entfärbe Lösung:	Ethanol	50 % (v/v)
	Essigsäure	10 % (v/v)

IX

Anhang 12

Trennsyteme:

1. Säule: Nucleosil C18, 125 x 5 mm,
2. Gradient: A: Methanol, B: 0,01 M TEAAC, pH 4,3

Zeit (min)	A (%)	B (%)
0,01	0	100
15	90	10
25	0	100

Detektiert wurde bei = 270 nm.

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