Dolej, Stefan: Wirkungen von Stoffwechselprodukten des Rhizobakteriums Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn im Pathosystem Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) - Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Jarvis & Shoemaker.

I

Anhang A. Anhang

Anhang 1

Czapek-Dox-Flüssigmedium:

FeSO4 x 7H2O

0,01 g

MgSO4 x 7H2O

0,5 g

KCl

0,5 g

KH2PO4

1,0 g

NaNO3

2,0 g

Saccharose

15,0 g

Aqua dest. ad 1 l

 

Einstellen des pH-Wertes vor dem Autoklavieren mit 1 N NaOH auf 5,8.

Anhang 2

Slight Nutrient Agar (SNA) nach NIRENBERG (1976):

KH2PO4

1,0 g

KNO3

1,0 g

MgSO4 x 7H2O

0,5 g

KCl

0,5 g

Glucose

0,2 g

Saccharose

0,2 g

Agar-Agar

18,0 g

Aqua dest. ad 1 l

 

pH-Wert vor dem Autoklavieren mit 1 N NaOH auf 5,5 eingestellt.


II

Anhang 3

Ausstattung der GAT: UV-VIS-Detektoren, GAT-LCD 502 (single wavelength) und GAT-PHD 601 (multi wavelength); LC 1431 System Organizer; Pumpen, LC 1500, LC 1110 HPLC Pumps; DP 800 Data Interface.

Trennsystem: Säule - Sperisorb ODS-2, 10 µm, 120 x 16 mm, Gradient - A: Acetonitril, B: 0,01M TEAAC, pH 6,5,

Zeit (min)

A (%)

B (%)

     

0,01

0

100

5

10

90

20

60

40

25

60

40

26

0

100

Detektiert wurde bei lambda = 270 nm.

Anhang 4

Nährlösung:

 

Reinnährstoffgehalt (mg/l):

Ca(NO3)2 x 4H2O

0,88 g

N - 100 mg / Ca - 150 mg

NaH2PO4 x 2H2O

0,126 g

P - 25 mg

K2SO4

0,39 g

K - 175 mg

MgSO4 x 7H2O

0,31 g

Mg - 30 mg

Chelaplex (C10H13O8N2Fe)

0,0031 g

Fe - 0,5 mg

Mikronährelementelösung

1,0 ml

 

Aqua dest. ad 1 l

   

pH-Wert mit 1N KOH auf 5,8 eingestellt, (EC-Wert 1,4 mS x cm-1 bei 24 °C)


III

Mikronährelementelösung:

 

Reinnährstoffgehalt (mg/l):

MnSO4 x 4H2O

1,01 mg

Mn - 0,25 mg

H3BO3

0,56 mg

B - 0,1 mg

CuSO4 x 5H2O

0,098 mg

Cu - 0,025 mg

ZnSO4 x 7H2O

0,124 mg

Zn - 0,05 mg

(NH4)6Mo7O24 x 4H2O

0,322 mg

Mo - 0,025 mg

Aqua dest. ad 1 l

   

Anhang 5

Herstellung der etherischen Diazomethanlösung:

Beim IAA-ELISA verwendete Lösungen:

Paranitrophenylphosphat (Sigma Nr. D-9286)


IV

Anhang 6

Zusammensetzung der Somogyi- und Nelson-Reagenz:

  1. SOMOGYI-Reagenz:
  2. NELSON-Reagenz:


V

Anhang 7

Zusammensetzung der verwendeten Probenpuffer:

SDS-Probenpuffer (2000 µl):

2D-Probenpuffer (2000 µl):

0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

900 µl

Harnstoff

1,080g

Bromphenolblau

100 µl

EDTA/KCl/Tris-HCl (pH 6,8)

1,000 ml

(0,04 % (w/v) in Ethanol 10 %)

1 M Dithiotreithol (DTT)

140 µl

Glycerol

200 µl

Ampholyt 4-6 (Bio-Rad)

100 µl

SDS 10 % (w/v)

600 µl

Glycerol

250 µl

ß-Mercaptoethanol

200 µl

Pefabloc

40 µl

EDTA/KCl/Tris-HCl:

0,5 M Tris-HCl (pH 6,8)

500 µl

EDTA

11,2 mg

KCl

37,3 mg

ad 10 ml Aqua dest.

Anhang 8

Zusammensetzung der Gradienten- und Rundgele:

(Angaben in ml / Gel)

  Trenngel Sammelgel
  10% 15%  
Aqua dest. 4,450 2,450 1,160
Trenngelpuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8) 3,194 3,194 /
Sammelgelpuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8) / / 2,500
Acrylamid* 4,000 6,000 0,840
Natriumdodecylsulfat (SDS) 10 % (w/v) 0,252 0,252 0,050
Tetramethylendiamin (TEMED) 0,008 0,008 0,005
Ammoniumperoxodisulfat (APS) 10 % (w/v) 0,075 0,075 0,050


VI

* Acrylamidlösung:

29,2 % (w/v) Acrylamid

 

0,8 % (w/v) N,N - Methylenbisacrylamid, (30 % T, 2,7 % C)

Zusammensetzung der Rundgele:

Harnstoff

5,400 g

Aqua dest.

3,460 ml

Acrylamid*

1,340 ml

Ampholyt (BIO-RAD) 5-8

0,400 ml

Ampholyt (BIO-RAD) 3-10

0,100 ml

Glycerol

0,500 ml

TEMED

0,003 ml

APS 10 %

0,030 ml

   

*Acrylamidlösung:

29,2 % (w/v) Acrylamid

 

0,8 % (w/v) Piperazindiacrylamid

Anhang 9

Zusammensetzung des Laufpuffers (10x konzentriert):

Tris

30 g

Glycin

144 g

SDS

10 g

ad 1000 ml Aqua dest. (pH 8,2 - 8,5)

verwendete Proteinstandards:

92,5 kDa

Phosphorylase B

(TM 4 und 5)

67 kDa

Bovine serum albumin (BSA)

 

45 kDa

Ovar albumin

 

29 kDa

Carbonanhydrase

 

21 kDa

Trypsin inhibitor (soybean)

 

12,5 kDa

Cytochrome C

 

6,5 kDa

Trypsin inhibitor (bovine lung)


VII

Anhang 10

Verwendete Lösungen sowie die Laufparameter bei der 2D-PAGE:

Elektrolyte:

 

Katholyt

20 mM NaOH

Anolyt

10 mM H3PO4

Die Elektrolyte wurden immer frisch unmittelbar vor ihrem Gebrauch angesetzt.

Overlay-Puffer: (10 ml):

Bromphenolblau-Glycerol-Lösung (2 ml):

Harnstoff

3,005 g

Bromphenolblau

100 µl

Glycerol

0,5 ml

(0,04 % (w/v) in Ethanol 10 %)

Ampholyt 5 - 8

0,165 ml

Glycerol

200 µl

Ampholyt 3 - 10

0,085 ml

SDS 10 %

600 µl

ad 10 ml Aqua dest.

 

Tris-HCl (pH 6,8)

900 µl

   

ad 2 ml Aqua dest.

Zusammensetzung des 2D-Standards:

76,0 kDa, pI 5,9

Conalbumin

31,0 kDa, pI 5,9

Carbonanhydrase

66,2 kDa, pI 5,2

Albumin

21,5 kDa, pI 4,5

Trypsin inhibitor

43,0 kDa, pI 5,0

Actin

17,5 kDa, pI 7,0

Myoglobin

36,0 kDa, pI 8,5

GAPDH

   

Equilibrierungslösung (10 ml):

Laufparameter:

ohne Jodacetamid

 

30 min

200 V

Aqua dest.

2,000 ml

75 min

400 V

Tris-HCl (pH 6,8)

2,500 ml

75 min

600 V

Glycerol

2,000 ml

20 min

800 V

SDS 10 %

3,000 ml

10 min

1000 V

1 M DTT

0,500 ml

   

Die Equilibrierungslösung mit Jodacetamid hatte die gleiche Zusammensetzung enthielt jedoch 370 mg Jodacetamid.


VIII

Anhang 11

Fixierlösung:

Ethanol

50 % (v/v)

Essigsäure

10 % (v/v)

Silberfärbung:

Ethanol 10 % (v/v)

10 min

Periodsäure 0,7 % (w/v)

10 min

Ethanol 10 % (v/v)

2 x 5 min

Aqua dest.

3 x 3 min

Na2S2O3 0,02 % (w/v)

1 min

Aqua dest.

3 x 20 sek

AgNO3 0,2 % (w/v), Formalin 0,03 % (v/v)

30 min

Aqua dest.

20 sek

Na2CO3 6 % (w/v), Formalin 0,02 % (v/v)

bis Banden sichtbar wurden

Na-EDTA 1,86 % (w/v)

10 min

Coomassie Färbung:

Die Gele wurden für mind. 1 h in folgendem Gemisch gefärbt:

Coomassie Briliant Blue

0,2 % (w/v)

Ethanol

50 % (v/v)

Essigsäure

40 % (v/v)

Aqua dest.

10 %

Entfärbe Lösung:

Ethanol

50 % (v/v)

 

Essigsäure

10 % (v/v)


IX

Anhang 12

Trennsyteme:

  1. Säule: Nucleosil C18, 125 x 5 mm,
  2. Gradient: A: Methanol, B: 0,01 M TEAAC, pH 4,3

Zeit (min)

A (%)

B (%)

     

0,01

0

100

15

90

10

25

0

100

Detektiert wurde bei lambda = 270 nm.


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