Dolej, Stefan: Wirkungen von Stoffwechselprodukten des Rhizobakteriums Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn im Pathosystem Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) - Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Jarvis & Shoemaker.

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Kapitel 1. Einführung

Neue Erkenntnisse der Phytomedizin “als Wissenschaft von den kranken und beschädigten Pflanzen, deren Ursachen, Erscheinungsformen sowie Maßnahmen und Mitteln sie gesund und leistungsfähig zu erhalten oder zu heilen” (FRÖHLICH 1991), sind ein bedeutender Faktor im modernen Garten- und Pflanzenbau.

Um die Zielsetzungen der Phytomedizin zu realisieren, ist man ständig bestrebt, neuartige Bekämpfungsstrategien und Pflanzenschutzmittel zu entwickeln. Einen besonderen Stellenwert nehmen hierbei biologische Bekämpfungsmaßnahmen ein. Sie stellen nicht nur eine bedeutende Komponente des integrierten Pflanzenschutzes dar, sondern tragen auch gestiegenen ökologischen und sozialen Aspekten Rechnung.

Ein Verfahren aus der breiten Palette des biologischen Pflanzenschutzes ist der Einsatz von bakteriellen Antagonisten im Boden. Hierbei besteht das Ziel in der Unterdrückung von bodenbürtigen Phytopathogenen und ihres Pflanzenbefalles durch die künstliche Anreicherung der Rhizosphäre mit nützlichen Bakterien. Die aktive Besiedlung und Etablierung der Antagonisten im pflanzlichen Wurzelraum führt zu einer Veränderung des antiphytopathogenen Potentials bzw. der Suppressivität des Bodens (BOCHOW 1989).

Ein Problem beim Einsatz nützlicher bakterieller Organismen sind jedoch die noch unzureichend bekannten Wirkmechanismen. Nur die detaillierte Kenntnis dieser Mechanismen ermöglicht eine gezielte und effiziente Anwendung.

Positive Erfahrungen bei der Nutzung von Rhizobakterien zur biologischen Kontrolle von Phytopathogenen beziehen sich besonders auf die beiden Gattungen Pseudomonas und Bacillus (COOK & BAKER 1983, WELLER 1988, BOCHOW 1989, DEFAGO & KEEL 1995). Der hierbei wohl bedeutendste Vertreter aus der Gattung Bacillus ist der im Boden ubiquitär vorkommende Antagonist B. subtilis (SINCLAIR 1989, LOEFFLER et al. 1990). Er wurde erstmals von EHRENBERG (1835) und einige Jahre später von dem deutschen Botaniker Ferdinand COHN (1872) beschrieben. Weltweit sind eine Vielzahl von Stämmen isoliert und charakterisiert worden, die sich maßgeblich durch Isolierungsort und antagonistisches Potential unterscheiden (SCHÖNBECK & KREUTZER 1971, BROADBENT et al. 1971, SWINBURNE et al. 1975, KREZEL & LESZCZYNSKA 1978,


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UTKHEDE 1984, TSCHEN & KUO 1985, HUBER et al. 1987, HIRAOKA et al. 1992, ORIHARA et al. 1995, ASAKA & SHODA 1996).

Bacillus subtilis produziert eine Vielzahl extrazellulärer Metaboliten (Antibiotika, Siderophoren, Enzyme etc.), deren Bedeutung und Wirkung in der Interaktion von Pflanze - Bakterium - Phytopathogen nur zu einem geringen Teil bekannt sind.

Für die pathogenunterdrückende Wirkung von Bacillus subtilis wird hauptsächlich seine Fähigkeit zur Antibiotikabildung verantwortlich gemacht (SINCLAIR 1989). Hierbei spielen offensichtlich zyklische Lipopeptide, die im Gegensatz zu den hydrophilen Oligopeptiden im natürlichen Boden bedeutend persistenter sind (LOEFFLER et al. 1990), eine große Rolle.

Aufgrund der Mannigfaltigkeit der durch dieses Nutzbakterium produzierten antibiotisch wirksamen Substanzen ist das Spektrum der bekämpfbaren Phytopathogene relativ groß. Es erstreckt sich von bodenbürtigen Pilzen (ABOU-SHAAR 1988, BOCHOW 1989, 1991, HENTSCHEL 1991, ASAKA & SHODA 1996) über Bakterien (GRIESBACH & LATTAUSCHKE 1991, HASSANEIN & EL-GOORANI 1991, PHAE et al. 1992) bis hin zu pflanzenparasitären Nematoden (SIKORA 1988).

Der Großteil guter Bekämpfungserfolge wurde jedoch bei der Unterdrückung von bodenbürtigen phytopathogenen Pilzen gemacht.

So gelang es ABOU-SHAAR, (1988) durch die Anwendung von B. subtilis die Korkwurzelkrankheit der Tomate (Pyrenochaeta lycopersici) im Gewächshaus deutlich zu reduzieren. Der Erreger der Schwarzen Wurzelfäule der Gewächshausgurke (Phomopsis sclerotioides) ließ sich durch eine B. subtilis-Applikation auf das Niveau einer Fungizidbehandlung (Carbendazim 0,3 %) abschwächen (AL RASHID 1988). Auch unter hydroponischen Anbaubedingungen konnte der Befall von Edelnelken mit dem Erreger der Fusarium-Welke (Fusarium oxysporum f.sp. dianthi) durch den Einsatz von B. subtilis wirksam vermindert werden (OBIEGLO et al. 1990). Über die Bekämpfung des bakteriellen Welkerregers der Tomate (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) mit B. subtilis in Hydroponikkulturen berichten GRIESBACH & LATTAUSCHKE (1991). Gute Wirkungen erreichten auch NEMEC et al. (1996) gegen den Erreger der Fusarium-Stengel- und Wurzelfäule (Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici) der Tomate durch den Einsatz der beiden in den USA zugelassenen B. subtilis-Präparate “Quantum 4000 HB®” und “Kodiak®”. Eine Kombination mit Trichoderma harzianum konnte die Wirksamkeit noch steigern.


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Die phytosanitäre Wirkung einer B. subtilis-Anwendung kann auch durch die Kombination mit einem gering dosierten Fungizid erhöht bzw. stabilisiert werden (AL RASHID 1988, JACOB et al. 1988, HWANG et al. 1996).

Aufgrund seiner geringen Konkurrenzfähigkeit bei der Rhizosphärenbesiedlung ist eine präinfektionelle Anwendung zu bevorzugen (KATZ & DEMAIN 1977, BOCHOW 1989).

Auch mit zellfreien Kulturfiltraten des Nutzbakteriums konnten gute Bekämpfungserfolge von Uromyces phaseoli, dem Erreger des Bohnenrostes (BAKER et al. 1985), Sclerotinia sclerotiorum, dem Erreger der Sclerotinia-Krankheit des Rapses (ZHANG et al. 1995b) und Rhizoctonia solani, dem Erreger der Umfallkrankheit der Tomate (ASAKA & SHODA 1996) erzielt werden.

Die Wirkmechanismen, die der Pathogenunterdrückung durch B. subtilis zugrunde liegen, beruhen weitgehend auf Prozessen der Antibiose und der Konkurrenz um Raum und Nährstoffe (RYTTER et al. 1989, SINCLAIR 1989). Derartige suppressive Effekte gegenüber Phytopathogenen werden auch als eine mögliche Ursache für indirekte Wachstumsförderungen, besonders der Pflanzenwurzeln, diskutiert (REDDY & RAHE 1989, YOUNG et al. 1990, GLICK 1995).

In neuerer Zeit wird ein weiterer bedeutender Mechanismus der Pathogenunterdrückung dem Phänomen der Induzierten Resistenz zugeschrieben. Die Prozesse einer lokalen und systemischen Resistenz können durch verschiedene natürliche und synthetische Induktoren ausgelöst werden. Das Spektrum natürlicher Induktoren ist weit gefächert; so können z. B. avirulente Phytopathogene (CHAUDHARY et al. 1983, VILLICH-MELLER & WELTZIEN 1990, OLIVAIN et al. 1995), endophytische Pilze (BARGMANN & SCHÖNBECK 1992), Rhizobakterien (DEFAGO et al. 1995, VAN LOON 1995), Kulturfiltrate bzw. verschiedene Metaboliten bakteriellen Ursprungs (MAISS 1987, STEINER 1990, STEINER & SCHÖNBECK 1995, LEEMAN et al. 1995) und Pflanzenextrakte (YOKOYAMA et al. 1991, GEHRISCH-STANGENBERG et al. 1996. SCHMITT et al. 1996) Resistenz induzieren. Des weiteren können Behandlungen mit Phosphaten (GOTTSTEIN & KUC 1989, IRVING & KUC 1990), Oxalat (KESSMANN et al. 1994), Phytohormonen (MILLS et al. 1986, CHRIST & MÖSINGER 1989), ß-Aminobuttersäure (COHEN et al. 1994, LI et al. 1996) und Methyl-Jasmonat (LI et al. 1996) gleichfalls zu induziert resistenten Pflanzen führen. Auch physikalische Reize, wie z. B. Temperatur, können eine erhöhte Resistenz bewirken


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(STERMER & HAMMERSCHMIDT 1985, TRONSMO et al. 1993). In der Literatur häufig aufgeführte synthetische Induktoren sind Salicylsäure (CONTI et al. 1996) und 2,6-Dichlorisonikotinsäure (METRAUX et al. 1991, THIERON et al. 1995). Aufgrund der Vielgestaltigkeit der Induktoren sind viele Prozesse und Mechanismen, insbesondere die Signalkette, noch nicht aufgeklärt (SCHÖNBECK et al. 1993). Bei der Auslösung einer induzierten Resistenz scheint jedoch die Salicylsäure eine zentrale Stellung einzunehmen (GAFFNEY et al. 1993, VERNOOIJ et al. 1994, KESSMANN et al. 1996, UKNES et al. 1996). Charakteristisch für induziert resistente Pflanzen ist die Aktivierung von Resistenzgenen, welche für die Pathogenabwehr mitverantwortliche Proteine codieren (PIETERSE et al. 1996). Diese Proteine wurden erstmals als pathogenesis-related (PR-) Proteine von VAN LOON & VAN KAMMEN (1970) beschrieben. So kommt es beispielsweise nach einer Resistenzinduktion oft zur Anreicherung der antifungalen Hydrolasen ß-1,3-Glucanase und Chitinase (DUMAS-GAUDOT et al. 1996). Außerdem können Aktivitätsveränderungen von Peroxidasen, Phenylalanin-Ammoniumlyasen (PAL) und Polyphenoloxydasen (PPO) im pflanzlichen Gewebe auftreten (STEINER & SCHÖNBECK 1995). Häufig ist auch die Akkumulation bzw. Neusynthese von PR-Proteinen, mit nicht genau bekannter Wirkung, involviert (MAUCH et al. 1988, UKNES et al. 1992).

Auch heute ist man noch auf der Suche nach genaueren Markern für eine induzierte systemische Resistenz. KRASKA (1996) beschäftigte sich beispielsweise mit der DNA-Methylierung bei Weizen, als einem weiteren Marker für systemisch induzierte Resistenz. Er zeigte, daß eine Resistenzinduktion durch einen aus B. subtilis gewonnenen Induktor (B 50) und den beiden chemischen Substanzen Trigonellin (N-Methylnicotinsäure) und Isonikotinsäure-methylester mit einer Verringerung der Methylierung der DNA einhergeht.

Unter praxisüblichen Anbaubedingungen konnte MAISS (1987) durch die Anwendung zellfreier Kulturfiltrate von B. subtilis eine Resistenz gegen Viren in Gurken und Gerste induzieren. Auch STEINER & SCHÖNBECK (1995) berichten über die resistenz-induzierende Eigenschaft einer aus dem Kulturfiltrat von B. subtilis gewonnenen proteinhaltigen Fraktion bei Monokotyledonen gegenüber biotrophen Blattpathogenen.

RAUPACH & KLOEPPER (1996) beobachteten nach B. subtilis-Applikation bei Gurkenpflanzen und nachfolgender CMV-Infektion eine völlige Verhinderung der Kranheitserscheinung bzw. eine reduzierte Krankheitsintensität. Sie schlußfolgerten daraus, daß in den Pflanzen eine PGPR<1>-vermittelte systemische Resistenz induziert wurde.


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ZHANG et al. (1995b) fanden in mit B. subtilis behandelten Rapspflanzen eine erhöhte Peroxidase-, Polyphenoloxidase-, Phenylalanin-Ammoniumlyase und Superoxid-dismutaseaktivität sowie einen erhöhten Gehalt an phenolischen Verbindungen.

Nach der Applikation von B. subtilis in den Rhizosphärenbereich verschiedenster Pflanzengattungen werden immer wieder wachstumsfördernde Effekte beschrieben (ZASPEL 1988, KLOEPPER et al. 1991, TURNER & BACKMAN 1991, ZHANG et al. 1995a). Das Phänomen einer Befallsreduzierung, verbunden mit einer Wachstumsstimulierung nach B. subtilis-Anwendung, beobachteten auch SCHMIEDEKNECHT et al. (1995). Nach einer Knollenbehandlung von Pflanzkartoffeln im Freilandanbau stellten sie neben der Unterdrückung der Erreger des Kartoffelschorfes (Streptomyces scabies) und der Wurzeltöter- bzw. Pockenkrankheit (Rhizoctonia solani) auch Mehrerträge von durchschnittlich 17,7 % fest. Bei Versuchen mit Winterweizen (ZASPEL 1992), Mais (FEY 1996) und Sonnenblumen (Helianthus annuus L.) (SCHMIEDEKNECHT 1996) konnten ähnliche wuchs- und ertragsstimulierende Effekte beobachtet werden. ZHANG et al. (1995b) stellten nach einer Saatgutbehandlung von Rapssamen mit B. subtilis eine signifikante Erhöhung der Wurzellänge und der Blütenanzahl fest. Eine Befallsreduzierung von Baumwolle mit dem Erreger der Fusarium-Welke (Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum) und einem gleichzeitig signifikant erhöhten Ertrag nach einer B. subtilis-Samenbehandlung beschrieben BRANNEN & BACKMAN (1994).

Auch im Zierpflanzenbau führten B. subtilis-Anwendungen zu Ertragssteigerungen und Qualitätserhöhungen z. B. in der Schnittcyclamenproduktion (JACOB 1992), bei der Bewurzelung von Edelnelkenstecklingen (OBIEGLO 1992, JACOB et al. 1992), Pelargonium zonale-Stecklingen (JACOB & HAMDAN 1992) und Ziergehölzstecklingen (JACOB et al. 1991, GLÜCK 1993). BROADBENT et al. (1977) stellten bei einer breiten Palette von Zierpflanzensamen (Portulaca sp., Delphinium sp., Celosia sp. u.a.) höhere Auflaufraten sowie ein verbessertes Sämlingswachstum fest.

Freilebende Bodenbakterien, die eine Stimulierung des Wachstums von Pflanzen bewirken, werden unter der Bezeichnung “plant growth-promoting rhizobacteria” (PGPR) zusammengefaßt (KLOEPPER & SCHROTH 1978, KLOEPPER et al. 1989). Für eine direkte Wirkung von PGPR werden von GLICK (1995) verschiedene Mechanismen angenommen:

Der Produktion von Phytohormonen bzw. deren Präkursoren durch PGPR wird von FRANKENBERGER & ARSHAD (1995) eine Schlüsselrolle bei der Wachstumsförderung von Pflanzen beigemessen.

Von vielen PGPR ist bekannt, daß sie in der Lage sind, Phytohormone wie z. B. Indol-3-ylessigsäure (IAA) oder phytohormon-ähnliche Verbindungen zu synthetisieren (BROWN 1972, PRIKRYL et al. 1985). Durch ihre Untersuchungen zeigten BAREA et al. (1976), daß 86 % der aus der Rhizosphäre verschiedener Pflanzen isolierten Bakterienspecies in der Lage sind, Auxine und andere Pflanzenwachstumsregulatoren zu bilden. So wurden auch in den Kulturfiltraten verschiedener Bacillus subtilis-Isolate auxin-ähnliche Verbindungen (RASNIZINA 1938), IAA (MÜLLER et al. 1989), gibberellin-ähnliche Substanzen (KATZNELSON & COLE 1965), die Cytokinine Zeatin, Zeatinribosid (STEINER 1990, MÜLLER et al. 1989), Dihydrozeatinribosid und Isopentyladenosin (MÜLLER et al. 1989) und cytokininaktive Substanzen (POHLE 1993) gefunden.

Die Menge der produzierten Substanzen ist jedoch von dem angebotenen Substrat, den Kulturbedingungen und der Wachstumsphase abhängig. So wird z. B. die Synthese von Indol-Derivaten um ein Vielfaches gesteigert, wenn man dem Anzuchtmedium die physiologische Auxin-Vorstufe Tryptophan zusetzt (MÜLLER et al. 1989, MARTENS & FRANKENBERGER 1993).

Die bakterielle Auxin-Biosynthese kann ausgehend von der IAA-Vorstufe Tryptophan über verschiedene Bildungswege erfolgen. Die am häufigsten nachgewiesenen Wege sind der Indol-3-ylacetamid (IAM)- und der Indol-3-ylpyruvatsäure (IPyA)-Weg (CHERYL & GLICK 1996). Während der IAM-Weg von Tryptophan über IAM zu IAA führt, läuft die Synthese beim IPyA-Weg über IPyA und Indol-3-ylacetaldehyd. Der IAM-Weg ist effizienter und wird z. B. von einigen tumorbildenden phytopathogenen Bakterien realisiert (FETT et al. 1987, MANULIS et al. 1991, YAMADA 1993). Hierbei kommt es zu einer genetischen Veränderung in der Pflanze, welche zu einer Überproduktion an IAA und damit zu unkontrollierten Wucherungen (Hypertrophien) und Wuchsdepressionen führt (FETT et al. 1987). Die Synthese


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über den IPyA-Weg hingegen ist charakteristisch für die meisten höheren Pflanzen (LIBBERT 1993) und viele PGPR (PRIKRYL et al. 1985, CHERYL & GLICK 1996).

Die Wirkung exogen applizierter Phytohormone und deren Vorstufen auf das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen wurde intensiv von FRANKENBERGER & ARSHAD (1991 und 1995) untersucht. Sie zeigten, daß die Behandlung von natürlichem Boden mit den physiologischen Phytohormonvorstufen Tryptophan (IAA), Adenin (Cytokininen) und Methionin (Ethylen) zu einer verstärkten mikrobiellen Synthese der resultierenden Phytohormone führte und das Pflanzenwachstum stimulierte. BROWN et al. (1968) behandelten Tomatensamen und die Wurzeln von Tomatensämlingen mit einer Kombination von GA3 und IAA und stellten eine Steigerung der Sproßlänge und der Blattgröße fest. Die alleinige Behandlung mit IAA zeigte keine Wirkung.

Die Behandlung von Pflanzen mit Wachstumsregulatoren kann Mechanismen der induzierten Resistenz auslösen und damit die Pathogenese beeinflussen. CORDEN & DIMOND (1959) berichten über eine erhöhte Widerstandsfähigkeit von Tomatensämlingen gegenüber Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici nach 14-tägiger Behandlung mit verschiedenen Naphtalen-substituierten aliphatischen Verbindungen. Die beste Wirksamkeit bezüglich einer verringerten Gefäßverbräunung zeigten die synthetischen Wachstumsregulatoren 1-Naphtylessigsäure und 4-(1-Naphtyl)-buttersäure in einer Konzentration von 2x10-5 M. Gleichfalls führte die Anwendung jedoch zu einer Reduzierung der Wurzellänge der Testpflanzen. Über die Akkumulation von PR-Proteinen nach Injektion von IAA (50 ppm) in die Blätter von Tomatenpflanzen berichten CHRIST & MÖSINGER (1989). Der Befall mit Phytophthora infestans wurde ebenfalls als verringert beschrieben.

Während sich die meisten Untersuchungen von Bacillus subtilis auf die Mechanismen der Antibiose konzentrieren, wird über die direkte wuchsbeeinflussende Wirkung dieses Bakteriums und deren Relevanz für die Pflanzengesundheit vergleichsweise wenig berichtet. YOUNG et al. (1991) und FRANKENBERGER & ARSHAD (1995) vertreten auf der Grundlage ihrer Versuche mit verschiedenen PGPR und Phytohormonen die Hypothese, daß bei der pathogenunterdrückenden Wirkung auch Mechanismen, ausgelöst durch bakterienbürtige phytohormonal aktive Verbindungen, involviert sein müssen.


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REDDY et al. (1991) fanden eine positive Korrelation zwischen der Cytokininproduktion von PGPR und dem verringerten Befall von Tomatenpflanzen mit Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici.

Auch BOCHOW et al. (1995) und DOLEJ & BOCHOW (1996) vertreten die Meinung, daß der Förderung des Pflanzenwachstums bzw. einer veränderten Phytohormonbalance, hervorgerufen durch bakterienbürtige Metaboliten, eine Schlüsselrolle bei der Verbesserung der Pflanzengesundheit zukommt. Von einer verringerten Prädisposition der Pflanzen nach einer PGPR-Applikation sprechen SEPEHR (1983) und ZASPEL (1988).

Schlußfolgernd aus dem vorher Dargestellten war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, mögliche Wirkmechanismen für eine direkte Wachstums- und Gesundheitsförderung von Pflanzen durch B. subtilis bzw. dessen Stoffwechselprodukten näher zu untersuchen. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Rolle von Phytohormonen, deren Präkursoren und phytohormonal aktiven Metaboliten von B. subtilis hinsichtlich ihrer Bedeutung bei Pathogeneseprozessen gewidmet.

Aufgrund der Komplexizität derartiger Untersuchungen und der hierbei zu berücksichtigenden multifaktoriellen Mechanismen wurde versucht, ein vereinfachtes Modellsystem zu entwickeln, das reproduzierbare und interpretierbare Ergebnisse liefert. Die Untersuchungen wurden deshalb mit zellfreien, standardisiert hergestellten Kulturfiltraten zweier gut charakterisierter B. subtilis-Stämme durchgeführt. Kulturfiltrate stellen die Gesamtheit der von den Mikroorganismen in das Kulturmedium über eine definierte Zeit ausgeschiedenen Stoffwechselprodukte dar. Der Einfluß des Nutzbakteriums mit seinen Stoffwechselprodukten wurde anhand dieser Kulturfiltrate simuliert. Die Arbeit mit Kulturfiltraten hat den Vorteil, daß prinzipiell mögliche Wirkungen mit einer relativ geringen Variabilität des Stoffproduzenten B. subtilis reproduzierbar und gleichzeitig biochemisch analysierbar sind. Ein Nachteil besteht jedoch darin, daß die Anwendung von Kulturfiltraten besonders unter in vivo-Bedingungen die wirklichen Prozesse der Interaktion zwischen Pflanze und Bakterium nur fragmentarisch widerspiegelt. Um dennoch eine gewisse Annäherung an die Dynamik des Bakterienwachstums bei der Wurzelbesiedlung zu erreichen, wurden die Kulturfiltrate zu drei verschiedenen Zeitpunkten des Fermentationsprozesses gewonnen. Mit dem Ziel der Isolierung von wirksamen Reinsubstanzen wurden die Kulturfiltrate mehrfach biochemisch fraktioniert.

Zur Erfassung der Wachstumsparameter, besonders des Wurzelwachstums der benutzten Testpflanze Tomate, wurde ein Großteil der Untersuchungen in erdeloser Nährlösungskultur


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durchgeführt. Dadurch war es möglich, das Wurzelwachstum ohne Reinigungsverluste gut zu analysieren. Durch eine axenische klimagesteuerte Kulturführung konnten Fremdeinflüsse, beispielsweise durch andere Mikroorganismen und Stressoren, so gering wie möglich gehalten werden. Unter diesen Bedingungen wurde die Mehrzahl der Versuche durchgeführt.

Als eine geeignete Test- bzw. Wirtspflanze - Pathogen - Kombination zur Ermittlung phytosanitärer Effekte wurde auf der Grundlage der Untersuchungen von GOBENA (1990) das Pathosystem Tomate - Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ausgewählt.

Gewächshausversuche dienten der Verifizierung der Versuchsergebnisse unter praxisnahen Bedingungen.


Fußnoten:
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