Dolej, Stefan: Wirkungen von Stoffwechselprodukten des Rhizobakteriums Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn im Pathosystem Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) - Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Jarvis & Shoemaker.

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Charakterisierung der Versuchsorganismen

2.1.1. Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn

Der mikrobielle Antagonist Bacillus subtilis wird taxonomisch der Ordnung Eubacteriales und der Familie der Bacillacea zugeordnet. Er ist gram-positiv, von stäbchenförmiger Gestalt (2,0 - 3,0 µm lang, Ø 0,7 - 0,9 µm) und peritrich begeißelt (COOK und BAKER 1983, SINCLAIR 1989).

Sein Habitat ist weitgehend durch aerobe und mesophile Bedingungen gekennzeichnet. Das Bakterium ist in einem Temperaturbereich von 5 bis 55 °C aktiv (SINCLAIR 1989). Das Optimum wird bei 25 °C angegeben (GUPTA & UTKHEDE 1986). Der tolerierte pH-Wert liegt zwischen 4,5 und 8,6, wobei das Optimum bei pH 6 - 7,5 liegt (THIMANN 1964, SNEATH et al. 1986, WANDKE 1992).

Unter ungünstigen Umweltbedingungen ist B. subtilis in der Lage, äußerst widerstandsfähige Endosporen zu bilden (SINCLAIR 1989, KNOTT et al. 1995).

Für die Untersuchungen in dieser Arbeit wurden die zellfreien Kulturfiltrate der B. subtilis-Stämme FZB C (FZB 24, IMET 11435) und G (FZB 14, IMET 11327) aus der Stammsammlung der FZB Biotechnik GmbH Berlin verwendet. Beide Stämme werden nach BERGEY’s der Art B. subtilis zugeordnet (SNEATH et al. 1986). Durch ihr Lysotypieverhalten (Empfindlichkeit gegenüber spezifischen Bakteriophagen) unterscheiden sie sich vom ATCC 6051, dem Typstamm für B. subtilis nach BERGEY’s (SNEATH et al. 1986). Sie sind unempfindlich gegen die Bakteriophagen SPP1, phi 3T, PA1 und PC2 und werden durch die Phagen PZA, PZB, PZE, PT4a, PT1b, PT2b, PT3b und PT4b lysiert (BMFT Abschlußbericht der FZB Biotechnik GmbH 1993, BMBF Jahresbericht der FZB Biotechnik GmbH 1995).

Die Wirksamkeit der beiden Stämme hinsichtlich ihrer pathogenunterdrückenden und wuchsstimulierenden Aktivität ist unter in vivo-Bedingungen mehrfach belegt (SCHMIEDEKNECHT 1993, Schmiedeknecht et al. 1994, 1995, 1996, BMBF Jahresbericht der FZB Biotechnik GmbH 1995, FEY 1996, GROSCH & JUNGE 1996).


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2.1.1.1. Entwicklungsphysiologie der B. subtilis-Stämme FZB C und G

Eine Kultur von Einzellern, der nach dem Ansatz kein neues Nährmedium zugefügt wird, ist im Wesentlichen durch 3 charakteristische Entwicklungsphasen gekennzeichnet.

Nach dem Beimpfen der Nährlösung mit den Bakterien tritt nach einer gewissen Verzögerung eine Phase der exponentiellen Bakterienzellteilung, bezeichnet auch als logarithmische Phase, ein. Alle während dieser Phase gebildeten Zellen sind lebens- und vermehrungsfähig und haben eine konstante Generationszeit, die für die vorherrschenden Bedingungen optimal kurz ist. Wenn eine essentielle Komponente in ein Minimum gerät oder sich toxische Metabolite anreichern, verringert sich die Vermehrung, und die Wachstumskurve geht von einer Übergangsphase in die stationäre Phase über. Das Maximum an Zellen ist dann erreicht, und ihre Anzahl bleibt über einen gewissen Zeitraum konstant (SCHRÖDER 1987).

In B. subtilis-Schüttelkulturen werden in jeder Entwicklungsphase unterschiedliche, für diese Phase z. T. charakteristische Metaboliten (z. B. Enzyme und Lipopeptidantibiotika) gebildet. Hierbei verändert sich das Substanzspektrum sowohl quantitativ als auch qualitativ. Die Art B. subtilis ist bekannt für die Produktion von hydrophilen Oligopeptiden und Lipopeptiden (LOEFFLER et al. 1990). In repräsentativen Schüttelkulturen konnten zu Beginn des Wachstums (logarithmische Phase) vorwiegend hydrophile Oligopeptidantibiotika wie Bacilysin (WALKER & ABRAHAM 1970, HILTON et al. 1988, LOEFFLER et al. 1990), Chlorotetain und Rhizocticin (LOEFFLER et al. 1990) und in der stationären Wachstumsphase Lipopetidantibiotika vom Iturin-, Fengymycin- und Surfactin-Typ sowie das Cyclopeptid Mycobacillin (LOEFFLER et al. 1990, BESSON 1994, OHNO et al. 1995) nachgewiesen werden.

Außerdem berichten FIDDAMAN & ROSSALL (1993, 1994) über die Produktion von stark antifungal wirkenden flüchtigen Verbindungen durch einen B. subtilis-Stamm. Die Isolierung und genauere Identifizierung dieser wasserlöslichen Substanzen gelang ihnen jedoch nicht. DASS & TEYEGAGA (1996) bestätigen durch ihre Untersuchungen mit B. subtilis und verschiedenen Pilzen die Bildung von flüchtigen, z. T. stark antifungalen Verbindungen durch das Bakterium. Die Art, Menge, Stabilität und Aktivität der gebildeten antibiotischen Substanzen ist unter in vitro-Bedingungen vom pH-Wert, der Zusammensetzung des angebotenen Mediums und der Temperatur abhängig (FIDDAMAN & ROSSALL 1993, KUBOI et al. 1994, LEIFERT et al. 1995, OHNO et al. 1995).


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Zur Charakterisierung der Kulturfiltrate wurden wichtige physikochemische Parameter (pH-Wert, osmotischer Druck, Restnährstoffgehalte), das physiologisch bedeutsame Zwischenprodukt NH4, ein von B. subtilis typischerweise gebildetes Enzym (Protease) sowie der Gehalt an zyklischen Lipopeptiden analysiert (Tabelle 1).

Tabelle 1: pH-Wert, osmot. Druck sowie Stoffumsatz bzw. Metabolitengehalt ausgewählter Substanzen der Kulturfiltrate der beiden Bacillus subtilis-Stämme FZB C und G nach 8 h Kulturdauer = logarithmische Wachstumsphase, 14 h Kulturdauer = Übergangsphase und 72 h Kulturdauer = Ende der stationären Phase im Landy-Medium (nach BECKMANN 1995 und FZB Biotechnik GmbH 1995).

  FZB C FZB G
Parameter bzw. Substanzgehalt log-Phase/ Ü-Phase/ ES-Phase log-Phase/ Ü-Phase/ ES-Phase
             
pH-Wert 5,97 6,61 7,44 5,94 6,09 7,23
             
Osmotischer Druck 207 136 105 202 153 95
mmol/Kg            
             
Glutaminsäure (mg/ml) 3,2700 3,0900 0,0120 3,6990 3,2760 0,0110
             
Glucose (g/l) 14,5000 13,2900 4,2000 15,4000 14,8100 2,6800
             
NH4- (mug/ml) 9,9620 6,2170 1,1620 11,0480 6,0910 0,1550
             
Protease (TEcas*/ml) 0,0012 0,0090 0,0050 0,0007 0,0150 0,0046
             
zyklische Lipopeptide (g/l) 0,0250 0,0293 0,2420 0,0144 0,0240 0,3025

*Eine Tyrosin-Einheit (TEcas) ist die Enzymmenge, die aus einer Caseinlösung unter definierten Bedingungen soviel in Trichloressigsäure lösliche Substratbruchstücke pro Minute freisetzt, deren Absorption der eines µmol Tyrosin entspricht.

Das Proteasespektrum beider Stämme umfaßt EDTA-hemmbare Metalloproteasen und PMSF-hemmbare alkalische Proteasen (Serinproteasen) (BMFT Abschlußbericht der FZB Biotechnik GmbH 1993). Außerdem bildet der Stamm FZB G mehr Polyglutamat in der logarithmischen Phase und der Übergangsphase als der Stamm FZB C (KREBS 1996).


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2.1.2. Tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Harzglut F1)

Für die Untersuchungen wurde die Tomatensorte ‘Harzglut F1’ verwendet. Diese Tafeltomate wurde 1993 von der Quedlinburger Saatzucht GmbH gezüchtet. Die Sorte zeichnet sich gegenüber der bewährten ‘Harzfeuer F1’ durch einen höheren Früh- und Gesamtertrag sowie eine größere Temperaturtoleranz aus. Der Anbau wird sowohl für die Freiland- als auch die Unterglas- und Unterfolienkultur empfohlen (Anonym 1993).

Ausgewählt wurde diese Sorte, weil sie nur Resistenzen gegenüber dem Tomatenmosaikvirus und Cladosporium fulvum (C1) besitzt und über keinerlei Fusarium-Resistenzen verfügt (Samenkatalog, Quedlinburger Saatzucht GmbH 1995/96).

2.1.3. Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. radicis-lycopersici Jarvis & Shoemaker - der Erreger der Fusarium- Stengel- und Wurzelfäule der Tomate

Der Erreger der Fusarium- Stengel- und Wurzelfäule der Tomate wurde erstmals 1978 von JARVIS & SHOEMAKER beschrieben. Aufgrund seiner hohen Pathogenität verursacht der Pilz sowohl unter Freiland- als auch unter Gewächshausbedingungen weltweit beträchtliche Schäden. Er hat sich in den letzten Jahren zu einem der bedeutendsten Krankheitserreger im Tomatenanbau entwickelt (NEMEC et al. 1996). Charakteristisch für diesen Erreger ist seine abweichende Pathogenese von der herkömmlichen Fusarium- Welke der Tomate (Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. lycopersici [Sacc.] Snyd. et Hans.).

In Reinkultur sind beide Species morphologisch nicht voneinander zu unterscheiden (Jarvis & Shoemaker 1978).

Der Pilz infiziert das Wirtsgewebe über verletzte aber auch gesunde Wurzeln sowie Adventivwurzeln im Hypokotylbereich. Sein Temperaturoptimum liegt zwischen 10 und 20 °C. Auch bei höheren Temperaturen, z. B. bei 20 - 22 °C, wird bereits nach 24 Stunden die Epidermis anfälliger Tomatensorten besiedelt und nach weiteren 5 Tagen werden die Zellwände und das Cytoplasma des Cortex aufgelöst (CHAREST et al. 1984, BRAMMALL 1986). Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici produziert in Abhängigkeit vom vorhandenen Substrat u. a. verschiedene pektolytische Enzyme wie z. B. Lyasen, Polygalacturonasen und Pectinasen (GUEVARA et al. 1997).

Die Ausbreitung des Pathogens im Wirtsgewebe erfolgt inter- und intrazellulär.


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Während der Vegetationszeit kennzeichnet befallene Pflanzen ein gestauchter Wuchs, und ihre Blätter weisen Chlorosesymptome, aber keine Welke auf. Erst mit beginnendem Fruchtansatz treten zunächst in den Mittagsstunden sonniger Tage reversible Welkeerscheinungen auf, welche im weiteren Verlauf irreversibel werden (LEARY & ENDO 1971). An der Sproßbasis werden dunkelbraune Verfärbungen und Läsionen erkennbar. Die Leitgefäße dieses Bereiches sind ebenfalls verbräunt (Jarvis & Shoemaker 1978).

Das Pathogen befällt auch 3 - 7 Tage alte Tomatensämlinge.

Während seines Wachstums produziert der Erreger eine Vielzahl sekundärer Metaboliten. Von besonderer Bedeutung hierbei sind Welketoxine wie das Lycomarasmin und die Fusarinsäure (5-Butylpicolinsäure). Während das Lycomarasmin als Produkt der Autolyse von Myzel ensteht (DIMOND & WAGGONER 1953), wird die Fusarinsäure von wachsenden Hyphen im Wirtsgewebe synthetisiert (SANDHU 1960). Die Stabilität von Fusarinsäure ist gering, so daß häufig die beiden natürlichen Analoga Dehydrofusarinsäure und Hydrofusarinsäure auftreten (BACON et al. 1996). In Kulturfiltraten des Pilzes sind deshalb auch ständig Dissoziationsprodukte zu finden. Die Dynamik dieses Prozesses ist vom pH-Wert des Mediums bzw. des Xylemsaftes abhängig (GÄUMANN 1957). Diese Zerfallsprodukte sind oft die kausalen Ursachen für die eigentliche Wirtschädigung. Die Dehydrofusarinsäure ist beispielsweise verantwortlich für die Ausbildung der Blattnekrosen bei jungen Tomatenpflanzen. KLUEPFEL (1957) beschreibt zwei grundlegende Stoffwechselvorgänge der Umwandlung von Fusarinsäure in Tomatenpflanzen. Zum einen erfolgt eine Dekarboxylierung zu 3-Butylpiridin, welches in seiner toxischen Wirkung 100-fach stärker als die Ausgangssubstanz ist. Zum anderen sind resistentere Tomatensorten in der Lage , durch eine Methylierung der Fusarinsäure zu Fusarinsäureamid-Methylat eine Detoxifikation durchzuführen.

Die Menge der gebildeten Fusarinsäure kann innerhalb verschiedener Isolate beträchtlich variieren (MADHOSINGH 1995, VENTER et al. 1996) und ist unter in vitro-Bedingungen beispielsweise vom Glucosegehalt des Mediums abhängig (SANDHU 1960).

Die Verbreitung des Pilzes erfolgt analog der Fusarium-Welke der Tomate. Hervorzuheben ist jedoch die gute Dispersion der Mikrokonidien durch die Luft und die sehr effiziente Besiedlung steriler Böden (BENHAMOU et al. 1989a).

GILLESPIE & MENZIES (1993) berichten über die Verbreitung des Erregers durch Mücken (Bradysia spp.) unter Laborbedingungen.


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Im Laufe der letzten Jahre wurden eine Reihe von resistenten Tomatensorten, z. B. ‘Larma’ und ‘Ohio CR6’, gezüchtet (JARVIS 1988). Ihre Eignung für den kommerziellen Anbau ist jedoch noch nicht zufriedenstellend. Eine Resistenz gegenüber Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici von kommerziell bedeutenden Sorten ist zur Zeit nicht bekannt (NEMEC et al. 1996).

CARON et al. (1985 und 1986) gelang es den Befall von Tomatenpflanzen mit Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici durch den Einsatz des VA Mykorrhizapilzes Glomus intraradices zu verringern. DATNOFF et al. (1995) berichten über gute biologische Bekämpfungserfolge durch eine präinfektionelle Bodenbehandlung mit Trichoderma harzianum und Glomus intraradices. PHAE et al. (1992) konnten durch den Einsatz des B. subtilis-Stammes NB22 eine Reduzierung des Befalles von Freilandtomaten feststellen. Durch eine Substratapplikation von B. subtilis konnten NEMEC et al. (1996) ebenfalls eine Verringerung des Pathogenbefalles erreichen. Eine gute Bekämpfung wird auch durch eine Kombination aus Saatgutinkrustierung und Substratbeimischung von Chitosan, einem ungiftigen biologisch abbaubaren Polymer des ß-1,4-Glucosamine, erreicht (BENHAMOU et al. 1994, LAFONTAINE & BENHAMOU 1996). Als Wirkmechanismus wird eine induzierte systemische Resistenz angenommen.

2.2. Pflanzenanzucht

Für die axenische Anzucht der Tomatensämlinge wurden die Samen 15 min mit NaOCl

(2 % aktives Cl) oberflächensterilisiert und nachfolgend 3x mit sterilem Aqua dest. gespült. Danach wurden die Samen in Plastikschalen, welche mit feuchtem sterilem Quarzsand (Körnung 06 - 1,2 mm) gefüllt waren, mittels einer Pinzette einzeln ausgesät. Nach dem Aussäen wurden die Plastikschalen für 8 Tage in einem Klimaschrank (Heraeus HPS 500) bei 28 °C und 80 % rel. Luftfeuchtigkeit aufgestellt. Mit Sichtbarwerden des Hypokotyls wurde die Aussaat bei einem Tag / Nacht Rhythmus von 16 / 8 h gehalten und mit ca.

210 µmol s-1 m-2 belichtet. Nach 8 Tagen waren die Kotyledonen voll entfaltet und die Tomatensämlinge für die Versuche einsatzbereit.


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2.3. Pathogenanzucht

Der Pilz Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici wurde zuerst auf Kartoffeldextrose Agar (KDA) in Petrischalen (Ø 9 cm) bei 24,5 °C in Dunkelheit kultiviert. Nach dem Bewachsen der Petrischalen wurden mit einem Korkbohrer Agarscheiben (Ø 1 cm) ausgestanzt. Von diesen Impfstücken wurden jeweils 5 Stück in einen sterilen 2-l-Meßkolben, welcher 1 l Czapek-Dox-Medium enthielt, gegeben. Das Flüssigmedium wurde zuvor autoklaviert. Der Ansatz wurde für 8 Tage auf einem Rundschüttler (150 U/min) bei Raumtemperatur und unter Tageslichtbedingungen kultiviert. Es wurde eine Inokulumdichte von durchschnittl. 1,0 x 107 Mikrokonidien/ml erreicht. Der pH-Wert des Mediums lag am Ende der Kultur bei 4,9.

Die Zusammensetzung des Czapek-Dox-Mediums ist in Anhang 1 aufgeführt.

2.3.1. Pathogenitätsprüfung und -erhaltung

Um die Pathogenität des verwendeten Isolates zu prüfen, wurden auf KDA-Platten mit einer Mikroliterpipette jeweils 3 Tropfen der Mikrokonidiensuspension gleichmäßig verteilt aufgebracht und dazu 5 oberflächensterilisierte Tomatensamen gegeben. Der Ansatz wurde für 7 Tage bei 24 °C kultiviert und danach die Verbräunung der Keimwurzel bzw. des Hypokotyls kontrolliert.

Zusätzlich wurden nach jedem axenischen Nährlösungsversuch aus Kontrollpflanzen Reisolationen auf Slight Nutrient Agar (SNA) durchgeführt, welche die Ausgangsbasis für die Inokulumherstellung nachfolgender Versuche darstellten.

Die Kultivierung des Pilzes erfolgte für längere Zeit ohne Wirtspassage auf Slight Nutrient Agar (SNA). Die Zusammensetzung dieses Agarmediums ist in Anhang 2 dargestellt

Für Reisolationen wurden dem Medium nach dem Autoklavieren die Antibiotika Penicilin G (100 mg/l), Aureomycin (10 mg/l) und Streptomycinsulfat (50 mg/l) zugesetzt.


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2.4. Herstellung der Kulturfiltrate (KF) von Bacillus subtilis

Die Herstellung der KF erfolgte standardisiert durch die FZB Biotechnik GmbH Berlin.

Als Kulturmedium für die Bakterienhauptkulturen diente das synthetische Medium nach LANDY et al. (1948) mit folgender Zusammensetzung:

L - Glutaminsäure*

5,0 g

MgSO4

0,25 g

KCl

0,25 g

KH2PO4

0,5 g

Fe2(SO4)3 x 6H2O

0,15 mg

MnSO4 x H2O

5,0 mg

CuSO4 x 5H2O

0,16 mg

Glucose*

20,0 g

Aqua dest. ad 1 l

 

* Einwaage in 100 ml Aqua dest. gelöst und separat sterilisiert (fraktionierte Sterilisation) und dem Grundmedium unmittelbar vor dem Animpfen der Bakterien zugesetzt,

pH-Wert vor dem Sterilisieren mit 5 N KOH auf 6,0 eingestellt.

Für die Bakterienvorkulturen wurde ein GNB-Medium (SIFIN GmbH Berlin) mit folgender Zusammensetzung verwendet:

Pankreatisches Pepton

22,5 g

Glucose

1,0 g

K2HPO4

2,0 g

NaCl

3,0 g

pH-Wert vor dem Sterilisieren mit 5N NaOH auf 6,0 eingestellt,

Die KF wurden zu 3 verschiedenen Zeitpunkten des Fermentationsprozesses gewonnen (Abbildung 1).


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Abbildung 1: Wachstumskurve und Zeitpunkte der Gewinnung der Kulturfiltrate (KF) der

Bacillus subtilis-Stämme FZB C und G in Landy-Medium.

 

1: nach 8 h = logarithmische Phase (log-Ph.)

8,9x107 cfu/ml

 

2: nach 14 h = Übergangsphase (Ü-Ph.)

2,1x108 cfu/ml

 

3: nach 72 h = Ende der stationären Phase (ES-Ph.)

1,7x109 cfu/ml

Die KF wurden in 0,1- und 1%iger Anwendungskonzentration geprüft. Als Kontrolle wurde die Wirkung des Bakterienanzuchtmediums (Landy-Medium) in den gleichen Konzentrationen untersucht.

2.4.2. Biochemische Analyse und Fraktionierung der bakteriellen Kulturfiltrate

Die biochemischen Analysen und die Fraktionierung der Kulturfiltrate (KF) erfolgte durch Frau Ilona FISCHER (FB Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin [HUB], AG Prof. Cech †).

Der erste Schritt bei der Fraktionierung der KF war die Entfernung der Lipopeptidantibiotika. Hierbei macht man sich die Eigenschaft der Lipopeptide, in einem sauren Milieu auszufallen, zunutze (LOEFFLER et al. 1990). Die Lipopeptidantibiotika wurden demzufolge durch Ansäuerung der KF mit HCl auf pH 2,5 und anschließender Zentrifugation (Kühlzentrifuge, Sigma 3K30) bei 24.400 x g und 4 °C ausgefällt.

Trotz der Tatsache, daß mit dieser Prozedur nur die Lipopeptide ausgefällt wurden, wird der mit Ammoniak neutralisierte Überstand nachfolgend als “antibiotikafreies KF” bezeichnet. Zur weiteren biochemischen Aufarbeitung wurde das antibiotikafreie KF mit Methanol und Essigsäureethylester (EtOAc) wie in Abbildung 2 dargestellt, extrahiert. Aufgrund der nur geringen Stammunterschiede hinsichtlich der HPLC-Chromatogramme (FISCHER 1994) und


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der Metabolitenspektren der KF konzentrierten sich die Extraktionen auf den Stamm FZB G und dessen KF der Übergangsphase.

Abbildung 2: Trennungsgang zur Fraktionierung der Bacillus subtilis-Kulturfiltrate nach FISCHER (1994) - *geprüfte Fraktionen.

Die Fraktionen wurden in folgenden Varianten geprüft:


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Zusätzlich wurde das organische Lösungsmittel Methanol und der Essigsäureethylester in relevanten Konzentrationen (0,1 und 1 %) hinsichtlich einer eventuellen Wirkung auf die Prüfparameter untersucht.

2.4.2.2. Präparative HPLC-Trennung der Essigsäureethylester-Fraktion - (Subfraktionierung / Sub-Subfraktionierung) -

Die aus der Essigsäureethylester-Extraktion hervorgegangene organische Phase (Fraktion G) wurde mit Hilfe einer präparativen HPLC-Anlage der Firma Gamma Analysentechnik GmbH (GAT) in Subfraktionen (G1-G6) unterteilt.

Mit der gleichen apparativen Austattung wurden nachfolgend die Subfraktionen G3 und G6 rechromatographiert. Siehe auch Anhang 3.

geprüfte Varianten:

Die Konzentrationsangaben hinter den Subfraktionen beziehen sich auf die Ausgangs-konzentration des KF der Übergangsphase des Stammes FZB G (= 100 %).

Die große Anzahl angefallener Fraktionen, Subfraktionen und Sub-Subfraktionen machte es erforderlich, eine schnelle und dennoch zielorientierte Vorauswahl zu treffen. Hierzu wurden alle gewonnenen Fraktionen, Subfraktionen und Sub-Subfraktionen vor der Prüfung an Tomatensämlingen auf ihre phytohormonale Aktivität untersucht. Es wurde die Auxin-Aktivität anhand des Weizenkoleoptilentests und die Cytokinin-Aktivität mittels des Rettichkotyledonentests ermittelt. Diese Untersuchungen wurden von Herrn M. Alemayehu (FG Phytomedizin / Angewandte Entomologie, HUB) durchgeführt (ALEMAYEHU 1997).

Es wurden zum überwiegenden Teil nur Fraktionen, Subfraktionen und Sub-Subfraktionen in den Tomatensämlingstests geprüft, die eine auxin- und/oder cytokinin-ähnliche Aktivität zeigten.


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2.5. Phytohormone

Ausgehend von der Annahme, daß das Phänomen eines verbesserten Pflanzenwachstums und der damit einhergehenden Veränderung der Prädisposition nach B. subtilis-Applikation auf die Wirkung von extrazellulär produzierten Phytohormonen bzw. deren Präkursoren zurückzuführen ist, wurde ein Screening relevanter Substanzen durchgeführt.

Durch die analytischen Untersuchungen der Kulturfiltrate konnte die Bildung von Gibberellinen unter den gegebenen Anzuchtbedingungen des Bakteriums ausgeschlossen werden (FISCHER 1994).

Die Testsubstanzen wurden in den Endkonzentrationen von 10-10 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M und 10-4 M geprüft. Hierzu wurden diese in 1N NaOH gelöst und mittels einer Verdünnungsreihe der Nährlösung der Tomatensämlinge zugesetzt. Die Herstellung dieser Varianten erfolgte unmittelbar vor dem Einsetzen der Versuchspflanzen. Aufgrund der starken Verdünnung waren keine pH-Wert-Korrekturen der Nährlösung erforderlich. Die Kultivierung erfolgte wie unter 2.7 bzw. 2.8 beschrieben.

Es wurde die Wirksamkeit folgender Substanzen untersucht:

1.) Das Heteroauxin (IAA) ist die dominierende Auxinverbindung im pflanzlichen Phytohormonhaushalt. Die Indol-3-ylessigsäure ist ein häufig von Bakterien und Actinomyceten synthetisiertes Auxin (FRANKENBERGER et al. 1995). Der auffälligste Auxineffekt ist die Stimulation des Zellstreckungswachstums von Pflanzen. Hauptsyntheseorte sind schnell wachsende Meristeme sowie Laub- und Keimblätter. IAA wird in höheren Pflanzen hauptsächlich über den IPyA-Weg synthetisiert (KOGA et al. 1992).

Abbildung 3: Chemische Struktur der Indol-3-ylessigsäure (IAA).

2.) Die IPyA, auch Indol-3-ylbrenztraubensäure, ist eine bedeutende Vorstufe der IAA-Synthese. Verschiedene Mikroorganismen, wie Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens und Streptomyces griseoflavus besitzen die Fähigkeit, ausgehend


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von der Aminosäure Tryptophan bzw. DL-Tryptophan über den IPyA-Weg IAA zu synthetisieren (STOWE 1955, PERLEY und STOWE 1966, und EL-ABYAD et al. 1994). Auxinvorstufen wirken in Biotests wie Auxin, weil sie im pflanzlichen Gewebe zu Auxin umgesetzt werden (LIBBERT 1993). IPyA konnte als einziger Vertreter von Phytohormonen, allerdings nur temporär, im KF der Übergangsphase detektiert werden (FISCHER 1994).

Abbildung 4: Chemische Struktur der Indol-3-ylpyruvatsäure (IPyA).

Abbildung 5: Mikrobielle und pflanzliche Bildung von IAA aus der Aminosäure Tryptophan über den IPyA-Weg, nach PATTEN und GLICK (1996).

3.) Als ein Vertreter der synthetischen Auxine wurde die IBA geprüft. Sie wird oft für die Bewurzelung und Förderung der Wurzelentwicklung von Pflanzenstecklingen verwendet. Synthetische Auxine werden durch Auxinoxidase oder andere pflanzeneigene Enzyme nicht so schnell wie IAA abgebaut und wirken deshalb nachhaltiger (STRASBURGER et al. 1983, LIBBERT, 1993).

Abbildung 6: Chemische Struktur der Indol-3-ylbuttersäure (IBA).


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4.) Die synthetische Verbindung Kinetin (6-Furfurylaminopurin) wurde als Vertreter der Cytokinine in die Untersuchungen einbezogen. Cytokinine bewirken eine allgemeine Stimulation des pflanzlichen Stoffwechsels, vor allem der RNA- und Proteinbiosynthese, verzögern aber auch den RNA- und Proteinabbau (LIBBERT 1993). Über die Biosynthese von Cytokininen durch Mikroorganismen wird vergleichsweise zu den Auxinen nur wenig berichtet. Verbreitet ist die Produktion von Cytokininen bzw. cytokinin-ähnlichen Verbindungen besonders bei Bakterien der Gattung Rhizobium (TALLER & STURTEVANT 1991).

Abbildung 7: Chemische Struktur des Kinetin.

Alle Phytohormone und die IAA-Vorstufe IPyA wurden von der Firma Sigma (IAA Nr. I-2886, IPyA Nr. I-7017, IBA Nr. I-5386, Kinetin Nr. K-0753) bezogen.

2.6. Pflanzenaktivator BION®

Der von der Ciba-Geigy AG entwickelte und seit 1996 registrierte Pflanzenaktivator BION® wurde für Vergleichszwecke in die Untersuchungen mit einbezogen. BION® gehört zur Gruppe der Benzothiadiazole (BTH) und ist ein Benzo (1, 2, 3) thiadiazol-7-thio-carbonsäure S-methylester. BION® ist in der Lage, pflanzliche Resistenz gegenüber einer Vielzahl von pilzlichen Pathogenen zu induzieren. Er übernimmt in der Signalkette die Funktion der Salicylsäure und löst somit über ein Bindungsprotein eine systemisch aktivierte Resistenz (SAR) aus. Diese derzeit einzige als Pflanzenaktivator registrierte Verbindung stellt eine neue Generation von Pflanzenstärkungsmitteln dar.

BION® hat in den empfohlenen Anwendungskonzentrationen grundsätzlich keine direkte Wirkung auf phytopathogene Pilze und Bakterien (KESSMANN et al. 1996, RAUM 1997).


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Der Pflanzenaktivator wurde in der axenischen Nährlösungskultur in den Konzentrationen 10-6 bis 10-3 M geprüft.

2.7. Axenische Nährlösungskultur

Die Kultivierung der Tomatensämlinge erfolgte in Reagenzröhrchen (16 cm x Ø 1,8 cm), welche mit jeweils 22 ml der Nährlösung unter Zusatz der entsprechenden Prüfsubstanz gefüllt waren. Nach dem Befüllen der Reagenzröhrchen wurden diese mit Nescofilm verschlossen und mittels einer heißen Impföse mit einem ca. 4 mm großen Loch in der Mitte versehen. Durch diese Öffnung wurde dann nachfolgend die Wurzel der Tomatensämlinge in die Nährlösung eingehängt.

Hierzu wurden die 8 Tage alten Tomatensämlinge vorsichtig mit sterilem Aqua dest. aus dem Quarzsand ausgeschwämmt und von anhaftenden Quarzsandkörnchen befreit. Besondere Aufmerksamkeit wurde einer möglichst gleichen Habitusentwicklung und der Unversehrtheit der Wurzeln geschenkt.

Der Flüssigkeitsstand in den Reagenzröhrchen war so bemessen, daß die Wurzeln völlig in die Nährlösung eintauchten. Jede Behandlungsvariante beinhaltete 15 Reagenzröhrchen.

Die Sämlinge wurden für 10 Tage in einem Klimaschrank (Heraeus HPS 500) kultiviert. Es wurde ein Tag / Nacht-Rhythmus von 16 / 8 h, ein Temperaturregime von 24 / 19 °C und eine rel. Luftfeuchte von 65 / 70 % eingestellt. Die Belichtungsintensität betrug 210 - 240

µmol s-1 m2.

Der Flüssigkeitsentzug der Testpflanzen wurde nach Bedarf mit einer definierten Menge sterilem Aqua dest. bzw. Nährlösung mittels einer 20 ml Einmalspritze ausgeglichen.

2.7.1. Nährlösungszusammensetzung

Die Zusammensetzung der Nährlösung (Makro- und Mikronährstoffe) erfolgte nach GÖHLER & DREWS (1986) und wurde speziell für Tomatensämlinge modifiziert nach DREWS (1993).

Die Nährlösung wurde unter weitgehend keimfreien Bedingungen hergestellt.

Die genauen Bestandteile der Nährlösung sind in Anhang 4 aufgeführt.


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2.7.2. Pathogeninokulation

Nach der 10-tägigen Kultivierung der Sämlinge wurde die Nährlösung mit einer 25 ml Pipette, welche an der Spitze mit einem feinen Schlauch verlängert war, abgesaugt. Der Schlauch wurde hierzu durch eine zweite Öffnung im Nescofilmverschluß bis zum Boden des Reagenzröhrchens eingeführt und der Röhrcheninhalt mittels einer elektronischen Pipetierhilfe (“Pipetboy” Integra Biosciences) abgesaugt. Danach wurden mit einer Einmalspritze 25 ml steriles Aqua dest. eingefüllt, die Röhrchen kurz geschüttelt und analog wieder abgesaugt. Dieser Schritt diente zum Abspülen anhaftender Testsubstanzrückstände an Wurzel und Reagenzglas. Im Anschluß daran wurden 22 ml der Konidiensuspension mit einer Einmalspritze eingefüllt. Zuvor wurde die Pathogensuspension durch eine feine sterile Gaze (250 µm) filtriert, um Myzelfragmente auszusondern. Von der erhaltenen Mikrokonidiensuspension wurde mit einer Thomakammer die Inokulumdichte bestimmt und auf 1,5 x 106 Mikrokonidien/ml mit sterilem Leitungswasser eingestellt. Die Kontrollpflanzen wurden in entsprechend verdünntem Czapek-Dox-Medium weiterkultiviert.

Die Konzentrationseinstellung des Inokulums erfolgte unmittelbar vor der Inokulation.

2.8. Gewächshauskultur

Die Wirksamkeit der KF beider B. subtilis-Stämme wurde unter Gewächshausbedingungen in den Anwendungskonzentrationen 0,1- und 1%ig geprüft. Ebenfalls erfolgte die Prüfung der IAA-Vorstufe IPyA in analogen Konzentrationen wie in der axenischen Nährlösungskultur. Fraktionen konnten aufgrund der geringen Ausbeute bei der präparativen HPLC nicht getestet werden.

2.8.1. Substrat und Kultur

Die Versuche wurden in Ø 9 cm Plastiktöpfen (150 g Substrat) durchgeführt. Als Substrat wurde eine Mischung aus handelsüblicher Pflanzerde (Floragard-Torfkultursubstrat) und Quarzsand (Körnung 0,6 - 1,2 mm) im Verhältnis 2 : 1 (v/v) verwendet. Die Anzucht der Tomatensämlinge erfolgte wie unter 2.2 beschrieben. Es wurde pro Topf ein Tomatensämling


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pikiert und anschließend mit der Kulturfiltratsuspension bzw. der IPyA-Lösung (100 ml / Topf) angegossen. Die Konzentrationseinstellung der KF und der IPyA-Lösung erfolgte mit Leitungswasser. Die Kontrollpflanzen wurden mit 0,1- und 1%igen Landy-Medium sowie mit Leitungswasser angegossen. Jede Behandlungsvariante wurde mit 8 Wiederholungen randomisiert angelegt. Bei Bedarf wurde mit Leitungswasser gegossen.

Die Versuchspflanzen wurden bei einer Temperatur von durchschnittl. 22 °C und einer durchschnittl. relativen Luftfeuchte von 68 % kultiviert.

2.8.2. Pathogeninokulation

10 Tage nach dem Pikieren wurden die Sämlinge mit einer Mikrokonidiensuspension von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici inokuliert.

Das Inokulum wurde wie unter 2.3 hergestellt und in der gleichen Konzentration angewandt. Es wurden jeweils pro Topf 50 ml im Gießverfahren an die Sproßbasis appliziert. Die Kontrollpflanzen wurden mit entsprechend verdünntem Czapek-Dox-Medium und Leitungswasser angegossen.

2.9. Ermittlung des Pflanzenwachstums

Die Wirksamkeit der Behandlungen mit den KF bzw. Fraktionen und den Phytohormonen wurde anhand der Parameter Sproß- und Wurzellänge sowie den entsprechenden Frisch- und Trockenmassen ermittelt.

Alle Parameter wurden nach der 10-tägigen Behandlung mit den Prüfsubstanzen bestimmt.

Die Wurzellänge wurde als absolute Wurzellänge nach NEWMAN (1966) errechnet. Hierzu wurde das gesamte Wurzelsystem einer Pflanze in eine mit etwas Wasser gefüllte Schale mit einem 1 x 1 cm Raster gelegt und die Anzahl der Schnittpunkte der Wurzeln mit den horizontalen und vertikalen Gitternetzlinien ausgezählt.


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Die Wurzellänge wurde nach folgender Formel errechnet:

R = absolute Wurzellänge

N = Anzahl der Schnittpunkte

A = Fläche des verwendeten Rasters

H = totale Länge aller Gitternetzlinien

Die Trockenmasse wurde nach einer 48-stündigen Trocknung bei 65 °C bestimmt.

2.10. Ermittlung des Pathogenbefalles

In der axenischen Kultur der Tomatensämlinge wurde nach 5, 7 und 10 Tagen nach Pathogeninokulation der Anteil kollabierter Pflanzen bestimmt. Der Kollaps trat infolge der Einschnürung des Hypokotyls ein. Die Bonitur erfolgte nach dem “ja oder nein” - Prinzip.

Als zusätzlicher Parameter wurden nichtkollabierte Sämlinge nach 5-tägiger Pathogeninokulation oberhalb der Kotyledonen vom Hypokotyl abgetrennt und nach Entfernung der Blätter in 3 Segmente (Epikotyl, 1. Internodium und Sproßspitze) zerlegt. Jedes Segment hatte dabei eine Länge von 1 cm. Diese Sproßsegmente wurden für 15 min mit Natrium-hypochloridlösung (3 % aktives Cl) oberflächensterilisiert und nachfolgend dreimal mit sterilem Aqua dest. gespült. Nach einer ca. 10-minütigen laminaren Lufttrocknung auf sterilem Filterpapier wurden die Sproßsegmente auf SNA-Agar ausgelegt und für 5 Tage bei 24 °C im Dunkeln inkubiert. Danach wurde die Anzahl der Segmente mit Myzelauswuchs als Maß für die Pathogenausbreitung erfaßt. Bestimmt wurde die Befallshäufigkeit pro Sproßsegment.

Der Pathogenbefall der Gewächshausversuche wurde ebenfalls durch Auslegen von Sproßsegmenten auf SNA-Agar erfaßt. Dies erfolgte jedoch erst 21 Tage nach der Pathogeninokulation. Welkesymptome konnten zu diesem Zeitpunkt noch nicht beobachtet werden. Eine Bonitur der Leitgefäßverbräunung erwies sich aufgrund des juvenilen Gewebes sowohl in der Nährlösungs- als auch in der Substratkultur als nicht praktikabel.


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2.11. Fusarinsäure-Anwendung

Zur Prüfung der Spezifität von festgestellten pathogeneseverzögernden Wirkungen einiger Behandlungsvarianten wurden diese zusätzlich auf eine mögliche Streßkompensationswirkung gegenüber dem Phytotoxin Fusarinsäure (Sigma Nr. F-6513) untersucht. Die Tomatensämlinge wurden hierzu analog mit den Testsubstanzen für 10 Tage kultiviert und anschließend der Toxinlösung ausgesetzt.

Die Herstellung der Fusarinsäurelösung erfolgte mit Nährlösung in einer Konzentration von

25 ppm.

Bonitiert wurde das Auftreten und die Ausprägung von Adernekrosen nach 5, 7 und 10 Tagen. Es erfolgte eine Abstufung nach folgenden Boniturklassen:

 

0 -

keine Symptome,

 

1 -

schwache Adernekrosen, Hauptadern nur leicht aufgehellt,

 

2 -

mittelstarke Symptomausprägung, Hauptadern leicht ocker verfärbt,

 

3 -

starke Nekrotisierung der Hauptadern, deutlich ockerfarbig und leicht eingerollte Blattspreiten

 

4 -

stark vergilbte und eingerollte Blattspreiten, teilweiser Blattverlust,

Es wurde ein Schädigungsindex (SI) nach folgender Formel berechnet:

n = Anzahl der Sämlinge mit gleicher Boniturnote b = Boniturnote N = Anzahl der bonitierten Sämlinge B = Anzahl der Boniturklassen


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2.12. Bestimmung des Indol-3-ylessigsäure (IAA)-Gehaltes

Nach der 10-tägigen Kultivierung der Tomatensämlinge mit Bacillus subtilis-KF bzw. deren Fraktionen und den Phytohormonen bzw. deren Präkursoren erfolgte die quantitative Bestimmung des Indolessigsäuregehaltes. Es wurde nur Pflanzenmaterial aus axenischer Kultur analysiert.

2.12.1. Probenaufbereitung und Extraktion

Das Pflanzenmaterial wurde in Sproß und Wurzel separiert, wobei jedes Probengefäß mindestens 4 Sprosse bzw. 4 Wurzelsysteme enthielt. Nach Bestimmung der Frischmassen wurden die Proben in flüssigem Stickstoff schockgefroren und nachfolgend bis zur Gewichtskonstanz (24 h) lyophilisiert. Das Probenmaterial wurde bis zur weiteren Aufarbeitung bei -80 °C gelagert.

Für die IAA-Extraktion wurden nur Sproßproben verwendet.

Hierzu wurde das Pflanzenmaterial mit einem Glasstab pulverisiert und mit 80% Methanol (v/v) versetzt. Dem Methanol wurden pro Liter 100 mg des Antioxidationsmittels BHT (Sigma Nr. B-1378) zugesetzt. Es wurden pro Gramm Sproßfrischmasse 10 ml des Extraktionsmittels verwendet. Die Extraktion erfolgte über Nacht (mind. 12 h) auf einem Schüttler (IKA-VIBRAX-VXA) bei 4 °C unter Lichtabschluß. Alle nachfolgenden Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Der Extrakt wurde durch einen Glasfaserfilter (Schleicher & Schüll Nr. 6) mit einem angelegten Vakuum von 450 mbar vorgereinigt. Zur späteren Bestimmung der Wiederfindungsrate wurden jeder Probe 3 µl Tritium-markierte IES zugesetzt und nach Durchmischen der Proben jeweils 100 µl des radioaktiven Gemisches entnommen. Die darin enthaltene Radioaktivität diente als Bezugsgröße für die Berechnung der Wiederfindungsrate. Anschließend wurde der Methanolanteil der Proben durch Zugabe von H2O auf 70 % gesenkt und eine Festphasenextraktion mittels RP 18 Kartuschen (Amchro, Merck) durchgeführt. Das angelegte Vakuum betrug 850 mbar. Der methanolische Extrakt wurde nun in einer Vakuumzentrifuge (Univapo 100 / Unijet II) auf die wäßrige Phase eingeengt. Danach wurden die Proben mit 0,5 N NaOH auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und 1x gegen das gleiche Volumen Diethylether ausgeschüttelt. Die Etherphase wurde abgesaugt und verworfen. Der pH-Wert des Probenextraktes wurde nun auf pH 2,5 mit 1 N HCL abgesenkt und 3x gegen das gleiche Volumen Diethylether ausgeschüttelt. Die Etherphasen wurden jeweils vorsichtig abgesaugt und vereinigt. Eventuell mitpipetiertes Wasser wurde in flüssigem Stickstoff ausgefroren und der Überstand in neue Reagenzröhrchen gefüllt. Die wasserfreie Etherphase wurde unter gasförmigem Stickstoff bis zur Trockene eingeengt. Die Trockenphase wurde dann in 1 ml Methanol aufgenommen und die darin enthaltene IES mit 0,5 ml etherischer Diazomethanlösung


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(Anhang 5) versetzt. Nach 15 min wurde die IES-Methylierung durch Zugabe von 3 Tropfen 0,2 M Essigsäure in Methanol gestoppt. Die Proben wurden nochmals bis zur Trockene unter gasförmigem Stickstoff eingeengt und bis zum quantitativen Phytohormonnachweis bei -80 °C aufbewahrt.

2.12.2. IAA - ELISA

Der Enzymgebunde Immunoassay (ELISA) ist ein quantitativer Nachweis für Antigene. Eine definierte Menge eines mit einem Enzym gekoppelten Antigens konkurriert mit einer unbekannten Menge des freien Antigens der zu messenden Probe um die Bindung mit einem spezifischen Antikörper, der an einer festen Phase adsorbiert ist. Durch eine Waschprozedur werden alle nicht gebundenen Enzym-gekoppelten und freien Antigene entfernt. Nach der Zugabe eines Enzymsubstrates wird die gebundene Enzymaktivität des Enzym-gekoppelten Antigens bestimmt. Dies ist ein Maß für den Antigengehalt der Probe.

Die Mikrotiterplatten wurden mit RAMIG-Lösung beschichtet (200 µl / Cup) und über Nacht im Kühlschrank (4 °C) inkubiert. Danach wurden die Platten dekantiert, gewaschen und mit den monoklonalen Antikörpern bei 4 °C über Nacht beschichtet. Am darauffolgenden Tag wurden die Platten dekantiert und 2x mit H2O gewaschen. Die Mikrotiterplatten wurden mit einer Standardverdünnungsreihe des Antigens, sowie mit den zu messenden Proben in verschiedenen Verdünnungen beschickt (jeweils 100 µl in TBS-Puffer) und 1 Stunde bei

4 °C inkubiert. Im Anschluß daran wurde der Antigen-Enzym-Komplex (Tracer) in einer vorher ermittelten Konzentration dazugegeben und der Ansatz bei 4 °C 3 h inkubiert. Dann wurden die Platten dekantiert, 2x mit H2O gewaschen und mit 200 µl Paranitrophenylphosphat (1 mg / ml in NaHCO3-Puffer) je Kavität gefüllt. Der Ansatz wurde dann bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert. Die photometrische Messung erfolgte bei lambda = 405 nm. Anhand einer Eichkurve mit IAA wurde der Antigengehalt der Proben errechnet.

Die detaillierte Zusammensetzung aller verwendeten Lösungen ist in Anhang 5 dargestellt.


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2.13. Bestimmung von Enzymaktivität

2.13.1. Probennahme

Die Zeitpunkte für die Probennahme zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Tomatensämlinge wurden, wie in Abbildung 8 dargestellt, gewählt. Die 1. Probennahme fand nach der 10-tägigen Kultivierung mit der entsprechenden Testsubstanz, unmittelbar vor der Pathogeninokulation, statt. Die 2. Probennahme Testsubstanz, unmittelbar vor der Pathogeninokulation, statt. Die 2. Probennahme

Abbildung 8: Zeitpunkte der Probennahme für die Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten der Tomatensämlinge.

2.13.2. Probenaufbereitung und Extraktion

Die Probenaufbereitung erfolgte wie unter Punkt 2.12.1 beschrieben. Das pulverisierte Pflanzenlyophilisat wurde nach MAUCH et al. (1988) extrahiert.

Hierzu wurden je Gramm Frischmasse 4 ml kalte 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) verwendet. Das Extraktionsmittel enthielt zusätzlich den Proteasehemmer Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Merck Nr. 7349) in einer Konzentration von 1 mM. Die Proben wurden 30 min bei 4 °C auf einem Schüttler (IKA-VIBRAX-VXA) extrahiert und anschließend das unlösliche Material durch Zentrifugation (20.000 x g, 4 °C, 20 min, Kühlzentrifuge, Sigma 3K30) sedimentiert. Der Überstand wurde in 1 ml Aliquote portioniert und zur Proteinfällung mit Ammoniumsulfat (95%ige Sättigung) für 2 Stunden bei 0 °C versetzt. Danach wurde das Präzipitat durch Zentrifugation (20.000 x g, 20 min, 4 °C) gesammelt und in 0,5 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) resuspendiert. Der erhaltene Proteinextrakt wurde bis zur Analyse bei -18 °C gelagert.


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2.13.3. Proteinbestimmung

Der Proteingehalt des Pflanzenextraktes wurde nach BRADFORD (1976) bestimmt. In ein Reagenzröhrchen wurden 100 µl der Proteinlösung und 5 ml Bradford-Reagenz pipetiert. Das Gemisch wurde kurz mit einem Vortex-Mixer geschüttelt und nach 5 min Reaktionszeit die Extinktion bei lambda = 595 nm (Mikrotiterplatten-Photometer Dynatech MR 5000) gemessen. Der Probenleerwert enthielt 100 µl 10 mM Tris-HCl Puffer und 5 ml Bradford-Reagenz. Anhand einer Eichkurve mit Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Nr. B-4287) wurde die Proteinkonzentration bestimmt.

Bradford-Reagenz:

0,1g Coomassie Brilliant Blue G 250 (MERCK Nr. 15444) werden in 50 ml 96%igem Ethanol gelöst, dann mit 100 ml 85%iger H3PO4 versetzt und mit Aqua dest. auf 1 l aufgefüllt.

2.13.4. Bestimmung der ß-1,3-Glucanase

Die ß-1,3-Glucanase-Aktivität des Proteinextraktes wurde über den Nachweis reduzierender Zucker nach der Somogyi-Nelson Methode bestimmt (NELSON 1944, SOMOGYI 1952).

Testprozedur nach FISCHER et al. (1989), modifiziert:

In 25 ml eines 50 mM Natriumacetat-Puffers (pH 5,0) wurden 25 mg Laminarin (Sigma Nr. L-9634) bei 37 °C für 10 min in einem Wasserbad gelöst. Danach wurden jeweils 2,5 ml dieser Lösung mit 20 µl der Proteinlösung gemischt und der Ansatz erneut für 10 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 0,5 ml dieser Lösung mit 0,5 ml SOMOGYI-Reagenz (4 Volumeneinheiten SOMOGYI I und 1 Volumeneinheit SOMOGYI II unmittelbar vor Gebrauch herstellen, Zusammensetzung siehe Anhang 6) vermischt und die Mixtur für 15 min bei 100 °C im Wasserbad inkubiert. Nach Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur wurden sie mit je 0,5 ml NELSON-Reagenz (Anhang 6) versetzt und danach vorsichtig mit 3,5 ml H2O gemischt. Zur Bestimmung der Extinktion wurden die Proben in Mikrotiterplatten pipetiert (200 µl / Cup) und bei lambda = 660 nm gelesen.

Eine Eichreihe mit Glucose diente zur Errechnung der ß-1,3-Glucanase-Aktivität der Proben.

Der Probenleerwert setzte sich aus der Proteinlösung, der Laminarin-Lösung und der SOMOGYI-Reagenz zusammen, wurde jedoch sofort nach seinem Ansatz für 15 min gekocht. Die weitere Behandlung erfolgte analog den Proben.

Die Aktivität wurde in Katal berechnet. Dabei ist ein Katal definiert, als die Enzymaktivität, welche die Bildung von 1 Mol Glucoseäquivalenten pro Sekunde katalysiert.


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2.13.5. Bestimmung der Chitinase

Die Chitinase-Aktivität der Proben wurde nach WIRTH & WOLF (1990) bestimmt.

Als Substrat diente CM-Chitin-RBV in wäßriger Lösung (2 mg/ml).

In einem Eppendorfgefäß wurden 100 µl dieser Lösung, 100 µl 0,2 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,0) und 200 µl Proteinlösung für 1 Stunde bei 26 °C in einem Wasserbad inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 100 ml 1 N HCl und der Abkühlung des Ansatzes auf Eis für 10 min. Das prezipitierte, nicht umgesetzte Substrat wurde durch Zentrifugation (14.900 x g, 4 °C, 5 min) gesammelt. Der Überstand wurde auf Mikrotiterplatten aufgetragen (200 µl/Cup) und die Extinktion bei lambda = 550 nm bestimmt. Die Zusammensetzung des Probenleerwertes war analog, jedoch ohne die entsprechende Enzymlösung. Als Positivkontrolle wurde Chitinase (Sigma Nr. C-6137) verwendet.

2.13.6. Bestimmung der Peroxidase

Die Ermittlung der Peroxidase-Aktivität erfolgte nach einer Anleitung von ABELES (1970).

In Reagenzröhrchen wurden jeweils 100 µl der Proteinlösung mit 4 ml der Guaiacollösung vermischt und nach 1 min Reaktionszeit die Extinktion von Tetraguaiacol bei lambda = 470 nm bestimmt. Die Reaktion fand bei Zimmertemperatur statt.

Zusammensetzung der Guaiacollösung:

2.14. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

Die mit Kulturfiltraten bzw. Kulturfiltratfraktionen und der IAA-Vorstufe Indol-3-ylpyruvatsäure vorbehandelten Tomatensämlinge wurden auf Veränderungen ihrer Proteinmuster untersucht.

Die Trennung erfolgte nach der relativen Molekülmasse der Proteine mittels Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (LAEMMLI 1970) bzw. nach


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ihrem Isoelektrischen Punkt (IP) und der relativen Molekülmasse (2-Dimensionale-Trennung) nach JUNGBLUT & SEIFERT (1990).

2.14.1. Probenaufbereitung und Extraktion

Die Aufbereitung der Proben und deren Extraktion erfolgte wie unter Punkt 2.13.2 dargestellt, jedoch ohne Ammoniumsulfatfällung. Für die Trennung der Proben in SDS-Gelen wurde der Proteinrohextrakt verwendet. Dieser wurde im Verhältnis 1:1 (v/v) mit 2x SDS-Probenpuffer (siehe Anhang 7 ) gemischt und anschließend in einem Heizblock (Eppendorf) für 4 min bei 95 °C vollständig denaturiert. Bei der hochauflösenden 2-Dimensionalen-Proteintrennung wurde mit gefällten Proben gearbeitet, um die Ionenstärke der Proteinlösung (< 50 mM) zu verringern. Hierzu wurde der Rohextrakt wie folgt behandelt:

Proteinfällung:

2.14.2. Gelherstellung

Für die gelelektrophoretische Trennung wurden Gradientengele mit einem Polyacrylamidgel-Gradienten von 10 % - 15 % verwendet. Die Gele hatten eine Stärke von 1 mm und eine Trennstrecke von 12 cm. Bei der 2D-Trennung wurden für die erste Dimension Rundgele mit einer Länge von 6,0 cm und einem Durchmesser von 0,9 mm benutzt. Die Trennung in der zweiten Dimension erfolgte ebenfalls mit Gradientengelen (T = 10 % - 15 %).

Die genaue Gelzusammensetzung ist dem Anhang 8 zu entnehmen.


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Zum Gießen der Gele wurden aus entsprechend großen Glasscheiben, getrennt durch 1 mm Teflon-Spacer, Gelkassetten zusammengesetzt und in einem Gießstand fixiert. Bevor zu beiden Ausgangskonzentrationen des Trenngels APS zugegeben wurde, wurden jeweils 0,5 ml der Gemische abgenommen und in einem separaten Becherglas vereinigt und mit 50 µl APS versetzt. Diese Lösung diente zum Abdichten der unteren Öffnung der Gelkassette. Die beiden Trenngelkomponenten wurden dann nach APS-Zusatz in einen Gradientenmischer gegeben und mittels eines feinen Schlauches zwischen die Glasplatten gefüllt. Durch die abnehmende Porenweite im Gel wird eine höhere Trennschärfe erreicht. Nach dem Gießen wurde das Trenngel vorsichtig mit wassergesättigtem Isopropanol überschichtet, um die Polymerisation störungsfrei ablaufen zu lassen und eine glatte, saubere Geloberfläche zu erhalten. Nach der Polymerisation des Trenngels (ca. 15 min) wurde das Isopropanol abgegossen und die Geloberfläche 1x mit Aqua dest. gespült. Danach wurde das Trenngel mit der Sammelgellösung überschichtet und zur Aussparung von Probentaschen ein Teflonkamm eingesetzt. Das Gel wurde zum völligen Auspolymerisieren über Nacht bei 4 °C aufbewahrt.

Zum Gießen der Rundgele wurden 20 Glasröhrchen (Länge 7,0 cm, Innendurchmesser 0,9 mm) in einem Glaszylinder (Ø 1 cm) senkrecht ausgerichtet. Danach wurde die Gellösung vorsichtig mit einer 1 ml-Pipette in den Glaszylinder gegeben. Durch Kapillarwirkung wurde die Gellösung auch im Inneren der Glasröhrchen aufgenommen. Es wurde solange neue Lösung in den Glaszylinder pipetiert, bis der Gelstand im Innern der Röhrchen eine Höhe von 6,0 cm erreicht hatte und somit ca. 1 cm Platz bis zum oberen Rand der Glasröhrchen war. Nach dem Polymerisieren der Rundgele (ca. 15 min) wurden diese vorsichtig aus dem Glaszylinder entnommen und das äußerlich anhaftende Gel mit Aqua dest. abgespült. Gele mit eingeschlossenen Luftblasen wurden ausgesondert. Die Rundgele wurden über Nacht in einer “Feuchten Kammer” bei 8 °C gelagert.

2.14.3. Elektrophoretische Trennung

a) Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE):

Die Gradientengele wurden aus dem Gießstand entnommen und mittels einer speziellen Halterung in die Laufkammer gehängt. Zuvor wurde der Teflonkamm aus dem Sammelgel entfernt und die Puffertanks mit Laufpuffer (1x konzentriert, siehe Anhang 9) gefüllt. Die Proteinproben wurden mit einer Mikroliterspritze in die Taschen des Sammelgels unterschichtet. Die enthaltene Proteinmenge je Probe betrug 12 µg. Für die Molekulargewichtsbestimmung wurden Proteinstandards der Firma SERVA (TM 4 und 5, siehe Anhang 9) verwendet.

Die elektrophoretische Trennung im Sammelgel erfolgte bei 20 mA / Gel und im Trenngel bei 30 mA / Gel. Der Lauf der Elektrophorese wurde in einem Kühlraum bei 4 °C durchgeführt . Die Dauer der Trennung betrug 6 - 6,5 h.


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2-Dimensionale-Gelelektrophorese:

Für die Trennung in der ersten Dimension wurden die Rundgele an der oberen Seite mit einem Adapter versehen und in die Halterung für die Laufkammer eingesetzt. In das untere Reservoir der Laufkammer wurde der Katholyt (700 ml) eingefüllt und in das obere Reservoir der Anolyt (150 ml). Die Röhrchenadapter wurden nochmals fest in die Halterung gepreßt, um das obere Reservoir flüssigkeitsdicht abzuschließen. Danach wurden die Gelröhrchen blasenfrei mittels einer Mikroliterspritze mit dem Anolyten gefüllt. Anschließend wurden 20 µl Overlay-Puffer auf die Geloberfläche jedes Röhrchens gegeben. Dann wurden die Proteinproben durch Unterschichtung aufgetragen. Die verwendete Proteinmenge betrug bei jeder Probe 10 µg. Für die Molekulargewichtsbestimmung wurde ein 2-D-Standard (BIO-RAD) verwendet. Der Lauf der Elektrophorese erfolgte als non-equilibrium-pH-gradient-electrophoresis (NEPHGE). Nach Beendigung der ersten Dimension wurden die Röhrchengele von ihrem Halteadapter entfernt und mit einem Spritzenadapter versehen. Damit wurden die Rundgele direkt in eine Equilibrierungslösung gepreßt. Zuerst wurden sie für 2 min in jodacetamid-freier Lösung aufbewahrt und anschließend nochmals für 2 min in jodacetamid-haltiger Lösung. Für die Trennung in der 2. Dimension wurden die Rundgele direkt nach der Equilibrierung auf ein SDS-Gradientengel luftblasenfrei aufgelegt und mit 200 µl einer Bromphenolblau-Glycerol-Lösung überschichtet. Es wurden pro Gradientengel jeweils 2 Rundgele positioniert. Die hierfür verwendeten Gradientengele entsprachen in ihrer Zusammensetzung denen unter Punkt 2.14.2, jedoch mit einem anders gegliederten Sammelgel. Hierfür wurde ein speziell für Rungele hergestellter Kamm verwendet. Der Lauf der Elektrophorese erfolgte analog der SDS-Gradientengeltrennung.

Alle verwendeten Lösungen sowie die Zusammensetzung des 2D-Standards und die Laufparameter sind in Anhang 10 aufgeführt.

2.14.4. Gelfärbung und Konservierung

Nach dem Elektrophoreselauf wurden die Gele für 15 min in Fixierlösung inkubiert. Danach erfolgte eine Silberfärbung der Proteine nach BLUM et al. (1987). Da es Proteine gibt, die nicht mit Silber färben, wurden die Gele zusätzlich mit Coomassie Briliant Blue angefärbt. Nach der Färbung wurden die Gele fotografiert und anschließend in einem Vakuum-Geltrockner getrocknet.

Die verwendeten Lösungen sind Anhang 11 zu entnehmen.


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2.15. Bestimmung der direkten Wirkung der Testsubstanzen auf das Pathogen in vitro

Alle geprüften Substanzen wurden parallel zu den Pflanzentests auf ihre direkte fungistatische Wirksamkeit gegenüber dem Pathogen untersucht. Es wurden die gleichen Konzentrationen wie in den Pflanzentests verwendet. Die Kontrollvarianten wurden mit entsprechend verdünntem Landy-Medium bzw. sterilisiertem Aqua dest. angesetzt.

2.15.1. KDA-Platten-Test

Die Testsubstanzen wurden dem Kartoffel-Dextrose-Agar kurz vor dem Erstarren beigemischt. Für Kontrollansätze wurde steriles Aqua dest. bzw. Landy-Medium in den entsprechenden Konzentrationen zugesetzt. Die Platten (Ø 9 cm) wurden ca. 1 Stunde nach dem Gießen mit gleichmäßig myzelbewachsenen Agar-Stanzstücken (Ø 0,8 cm) beimpft. Es wurde je ein Impfstück in der Plattenmitte aufgesetzt. Die Kultivierung der Platten erfolgte für 5 Tage bei 24 °C in Dunkelheit.

Es wurde das radiäre Myzelwachstum durch rechtwinklige Kreuzmessung ermittelt:

a = Längenausdehnung der Kolonie (mm)

b = Breitenausdehnung der Kolonie (mm)

Ø = mittlerer Durchmesser der Pilzkolonie aus

Aus dem mittleren Durchmesser der Pilzkolonie wurde die Hemmungsrate in % nach SELLAM et al. (1978) wie folgt errechnet:

2.15.2. CD-Submerskultur-Test

Da das Inokulum für die Pflanzentests in Submerskultur angezogen wurde, sollte auch die Wirkung der Kulturfiltrate auf die Pathogenentwicklung unter diesen Bedingungen geprüft werden. Es wurden die Parameter Myzeltrockenmasse, Mikrokonidien-Produktion und


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Fusarinsäure-Produktion untersucht. Bei diesen Untersuchungen wurde nur der Einfluß der KF des B. subtilis-Stammes FZB G geprüft. Die KF wurden nach dem Autoklavieren dem Medium unter sterilen Bedingungen zugesetzt. Die Kontrollansätze wurden mit entsprechenden Mengen Landy-Medium und sterilem Aqua dest. gemacht. Die Pilzkultur erfolgte in 500 ml Rundkolben, welche 200 ml des Kulturmediums enthielten. Beimpft wurden die Rundkolben mit je einem myzelbewachsenen Agarstück (Ø 1cm). Die weitere Kultur erfolgte wie unter 2.3 dargestellt.

Zur Bestimmung der Myzeltrockenmasse wurden 10 ml der Kulturflüssigkeit mit Hilfe einer Vakuumpumpe durch Rundfilter (Whatman Nr.1) gesaugt und diese anschließend für 24 Stunden bei 65 °C getrocknet. Das Vakuum wurde jeweils für die Dauer von 1 min angelegt. Die vorher bestimmte Eigenmasse der Rundfilter wurde subtrahiert.

Die Anzahl der Mikrokonidien wurde durch Auszählen mit einer Thomakammer unter einem Lichtmikroskop ermittelt.

2.15.3. Bestimmung des Fusarinsäure-Gehaltes

Für die Bestimmung des Fusarinsäure-Gehaltes wurde die Kulturflüssigkeit bei 24.400 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand mit 2N HCl auf pH 3,0 angesäuert. Proben, welche nicht unmittelbar danach weiter aufgearbeitet wurden, wurden bei -20 °C gelagert. Der Überstand wurde dann 3x gegen das gleiche Volumen Diethylether ausgeschüttelt. Die vereinigten Etherphasen wurden bis zur wäßrigen Phase eingeengt und unter Vakuum getrocknet. Der Rest wurde vor der Injektion in der mobilen HPLC-Phase resuspendiert. Als Standard diente eine Fusarinsäurelösung mit einer Konzentration von 500 ppm. Die verwendete Fusarinsäure wurde von der Firma Sigma (Nr. F-6513) bezogen.

Die HPLC Analyse wurde mit einer HPLC-Anlage vom Typ Shimadzu (SCL-6B System Controller; CTO-6A Column Oven; SPD-6AV UV-VIS Spectrophotometric Detector; Pumpen, LC-6A) durchgeführt. Siehe auch Anhang 12.


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2.16. Statistische Auswertung

Die Versuche wurden mindestens zweimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Anzahl der Wiederholungen je Variante (n) wird bei den entsprechenden Ergebnisdarstellungen angegeben. Bei Vorliegen einer Normalverteilung und von Varianzhomogenität wurden die Meßwerte einfaktoriell varianzanalytisch verrechnet. Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit 1. Art mit p le 0,05 zugelassen. Der paarweise Vergleich von Mittelwerten erfolgte mit dem t-Test nach STUDENT, der Vergleich mehrer Mittelwerte mit dem TUKEY-Test. Nicht metrisch skalierte Daten wurden mit dem Chi-Quadrat-Test verrechnet. Die signifikanten Unterschiede sind durch unterschiedliche Kleinbuchstaben bzw. Sternchen gekennzeichnet.

Die statistische Verrechnung der Versuchsergebnisse erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS für Windows (Version 6.01).


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