Dolej, Stefan: Wirkungen von Stoffwechselprodukten des Rhizobakteriums Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn im Pathosystem Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) - Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Jarvis & Shoemaker.

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Kapitel 3. Ergebnisse

Die dargestellten Ergebnisse sind eine repräsentative Auswahl der unabhängig voneinander durchgeführten Versuchswiederholungen.

3.1. Axenische Tomatensämlingskultur

3.1.1. Wirkung der bakteriellen Kulturfiltrate (KF)

3.1.1.1. Pflanzenwachstum und Entwicklung

0,1%ige Anwendung der KF:

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit den KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G zeigte keine signifikanten Unterschiede zur unbehandelten Kontrolle bezüglich der Wachstumsparameter Sproßlänge, Sproßfrisch- und Sproßtrockenmasse (Tabelle 2).

Tabelle 2: Wirkung der Kulturfiltrate der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei 0,1%iger Anwendung nach 10 Tagen (n = 5, *n = 10, p le 0,05).

      FZB C FZB G
  Kontr. LM log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph.
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                 
Sproß-                
                 
länge* (cm) 7,6a 7,5a 7,8a 7,7a 7,8a 8,0a 8,1a 7,7a
  (100) (101,1) (102,6) (101,3) (102,6) (105,3) (106,9) (101,3)
                 
frischm. (g) 0,45a 0,44a 0,43a 0,45a 0,43a 0,44a 0,43a 0,45a
  (100) (97,8) (95,6) (100,0) (95,6) (97,8) (95,6) (100,0)
                 
trockenm. (mg) 43,8a 44,3a 42,8a 44,2a 44,1a 41,6a 42,1a 39,9a
  (100) (101,3) (97,7) (100,9) (100,7) (95) (96,1) (91,1)
                 
Wurzel-                
                 
frischm. (mg) 189,5a 193,8a 191,3a 196,3a 187,6a 197,8a 200,1a 190,1a
  (100) (102,3) (100,9) (103,6) (99,7) (104,4) (105,6) (100,3)
                 
trockenm. (mg) 11,4a 11,5a 12,1a 12,7a 11,6a 12,0a 13,0a 11,9a
  (100) (101,1) (106,1) (111,4) (101,7) (105,2) (113,9) (104,4)


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Während im Bereich der Sproßentwicklung keine Beeinflussung des Wachstums zu

verzeichnen war, konnte bei der Wurzelentwicklung - und hier besonders bei dem Parameter Wurzellänge - durch die KF der logarithmischen Phase und der Übergangsphase beider Stämme tendenziell eine Förderung festgestellt werden.

Besonders die Behandlung mit dem KF der Übergangsphase des Stammes FZB G bewirkte eine Zunahme der Wurzellänge um 17,5 % gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Die Anwendung des KF des Stammes FZB C zeigte mit 12,1 % eine geringere Wirksamkeit (Abbildung 9). Die Wurzeltrockenmassen erhöhten sich gegenüber der unbehandelten Kontrolle um 13,9 bzw. 11,4 %. Die stimulierende Wirkung des Wurzelwachstums durch die KF der logarithmischen Phase und der Übergangsphase des Stammes FZB G war ausgeprägter, als die der gleichen KF des Stammes FZB C.

Die KF der stationären Phase hatten keine Auswirkungen auf die untersuchten Parameter.

Abbildung 9: Wurzellängenwachstum der Tomatensämlinge nach 10-tägiger Behandlung mit KF der beiden Bacillus subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) bei 0,1%iger Anwendung gegenüber der unbehandelten Kontrolle (n = 5, p le 0,05).

1%ige Anwendung der KF:

Die Anwendung der KF in der 1%igen Konzentration führte bei allen Prüfgrößen zu keiner oder zu einer hemmenden Wirkung (Tabelle 3). Während bei den KF der logarithmischen Phase beider Stämme keine signifikante Wirksamkeit zu verzeichnen war, führten die KF der


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Übergangs- und der stationären Phase zu teilweise signifikanten Wuchsdepressionen sowohl gegenüber der unbehandelten Kontrolle als auch im Vergleich beider Stämme untereinander. Die KF der stationären Phase des Stammes FZB G inhibierten das Wachstum und die Entwicklung der Tomatensämlinge am intensivsten. So verringerte sich beispielsweise die Sproßtrockenmasse der Tomatensämlinge nach 10-tägiger Einwirkung der KF der stationären Phase des Stammes FZB G gegenüber der Kontrolle um 41,3 % und des Stammes FZB C um nur 29,7 %. Die Wurzellänge zeigte sich auch hier als ein sehr sensitiver Parameter. Das KF der stationären Phase beider B. subtilis-Stämme verringerte signifikant das Wurzellängenwachstum (Abbildung 11). Das 1%ige Landy-Medium hatte keinen signifikanten Einfluß auf die wachstumsbeschreibenden Parameter des Sprosses und der Wurzel.

Die Kultivierung der Tomatensämlinge in Reagenzröhrchen und die Wirkung der KF des Stammes FZB G sollen durch Abbildung 10 verdeutlicht werden.

Tabelle 3: Wirkung der Kulturfiltrate der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei 1%iger Anwendung nach 10 Tagen, (n = 5, *n = 10, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

      FZB C FZB G
  Kontr. LM log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph.
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                 
Sproß-                
                 
länge* (cm) 7,6a 7,3a 7,3a 6,8a 4,7b 7,2a 6,5a 4,9b
  (100) (96,2) (96,2) (90,5) (61,1) (94,1) (93,1) (64,4)
                 
frischm. (g) 0,45a 43,8a 0,44a 0,37ab 0,32ab 0,41ab 0,31ab 0,27b
  (100) (97,5) (97,8) (82,2) (71,2) (91,1) (68,9) (60,0)
                 
trockenm. (mg) 43,8a 40,9a 41,6ab 37,3abc 30,8bcd 39,6abc 34,2bc 25,7d
  (100) (93,5) (95,0) (85,2) (70,3) (90,4) (78,1) (58,7)
                 
Wurzel-                
                 
frischm. (mg) 189,5a 186,7a 190,2a 163,9a 132,7b 179,8a 163,3a 120,9b
  (100) (98,5) (100,4) (86,5) (70,1) (94,9) (86,2) (63,8)
                 
trockenm. (mg) 11,4a 10,5ab 10,6ab 10,1ab 8,7ab 10,5ab 9,9ab 7,5b
  (100) (91,7) (93,1) (88,9) (76,6) (91,7) (87,6) (65,5)

(Sproßlänge: HSD = 1,4, -frischmasse: HSD = 0,15, -trockenmasse: HSD = 8,4, Wurzelfrischmasse: HSD = 29,8, -trockenmasse: HSD = 3,6)


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Abbildung 10: Wirkung der KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des Stammes FZB G bei 1%iger Anwendung auf das Wachstum und die Entwicklung von Tomatensämlingen nach 10-tägiger Kultivierung in mit Nährlösung gefüllten Reagenzröhrchen unter axenischen Bedingungen.

Abbildung 11: Hemmung des Wurzelwachstums der Tomatensämlinge nach 10-tägiger Behandlung mit den KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) in 1%iger Konzentration gegenüber der unbehandelten Kontrolle (n = 5, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05, Kontr. = 116,3 cm, HSD = 25,2%)


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3.1.1.2. Pathogenese

0,1%ige Anwendung der KF:

Die Inokulation der Tomatensämlinge mit dem Pathogen führte aufgrund der hohen Inokulumdichte (1,5 x 106 Mikrokonidien/ml) bereits ab dem 5. Tag nach der Inokulation

(5 dpi) zu kollabierten Sämlingen. Die Behandlungsvarianten mit den KF der logarithmischen Phase und der stationären Phase beider B. subtilis-Stämme zeigten zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede bezüglich der unbehandelten Kontrolle. Die Varianten beider Stämme, die mit dem KF der Übergangsphase vorbehandelt waren, wiesen dagegen einen verringerten Anteil kollabierter Pflanzen gegenüber der unbehandelten Kontrolle auf. Zum 2. Boniturtermin (7 dpi) erlagen bereits alle Sämlinge der Kontrollvariante einem Kollaps. Die Übergangsphase-Varianten zeigten zu diesem Boniturtermin eine statistisch signifikant schwächere Pathogenwirkung, die sich in einem verringertem Anteil kollabierter Tomatensämlinge äußerte (Tabelle 4, Abbildung 12). Die Varianten der logarithmischen Phase und der stationären Phase unterschieden sich auch zu diesem Zeitpunkt nicht von der unbehandelten Kontrollvariante.

An dieser Stelle muß darauf hingewiesen werden, daß auch die Sämlinge der Übergangsphase-Varianten keinesfalls ohne Symptome einer Infektion waren. Sie zeigten zum überwiegenden Teil die gleichen Vergilbungs- und Welkeerscheinungen wie die Kontrollpflanzen. In einigen Fällen konnte jedoch besonders bei Sämlingen dieser Behandlungsvarianten ein vitalerer Gesamteindruck gewonnen werden. Die KF der logarithmischen- und der stationären Phase ließen keine deratige Wirkung erkennen.

Zum 3. Boniturtermin (10 dpi) ließen die Varianten beider Stämme keine statistisch absicherbaren Unterschiede sowohl untereinander als auch gegenüber der unbehandelten Kontrolle mehr erkennen. Dennoch wiesen die Sämlinge der Übergangsphase-Varianten immer noch tendenziell weniger kollabierte Pflanzen auf.

Bei der Betrachtung der gesamten Infektionsphase fallen die Behandlungsvarianten mit den KF der Übergangsphase auf, die einen deutlich verzögerten Pathogeneseverlauf zeigten. Diese Untersuchungen, sowie die nachfolgenden mit 1%igem KF, wurden jeweils viermal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.


45

Tabelle 4: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB C und des Landy-Mediums (LM) bei 0,1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

  Anzahl kollabierter Tomatensämlinge
  5 dpi 7 dpi 10 dpi
Variante Stück rel. (%) Stück rel. (%) Stück rel. (%)
Kontrolle 6 (53,3) 15 (100,0) 15 (100,0)
LM 6 (53,3) 13 (86,7) 14 (93,3)
log-Phase 7 (46,7) 13 (86,7) 15 (100,0)
Ü-Phase 6 (40,0) 8* (53,3) 11 (73,3)
ES-Phase 8 (53,3) 15 (100,0) 15 (100,0)

Abbildung 12: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G und des Landy-Mediums (LM) bei 0,1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).


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Ein weiteres Prüfkriterium stellte die vertikale Pathogenausbreitung im Gefäßsystem des Sprosses der Tomatensämlinge dar, wobei nur nichtkollabierte Sämlinge nach 5-tägiger Inokulation in die Untersuchung einbezogen wurden. Charakteristisch für alle kollabierten Sämlinge war die vollständige Besiedlung des Leitgefäßsystems mit dem Pathogen (Ergebnis nicht graphisch dargestellt).

Die 10-tägige Vorbehandlung mit den KF der Übergangsphase beider B. subtilis-Stämme führte zu einer deutlich verringerten Pathogenausbreitung in den Segmenten des 1. Internodiums und der Sproßspitze (Abbildung 13). Aus den Sproßspitzen-Segmenten der Übergangsphase-Variante des Stammes FZB G konnten z. B. ca. 65 % weniger Pathogenreisolate gewonnen werden als aus der entsprechenden Kontrollvariante. Die Behandlung der Tomatensämlinge mit dem Landy-Medium führte zu keiner Beeinflussung der Pathogenese.

Ein Myzelauswuchs aus den Enden der Blattstiele konnte nur in sehr wenigen Fällen beobachtet werden und findet deshalb bei den nachfolgenden Ergebnissen keine Erwähnung mehr.

Abbildung 13: Einfluß der 10-tägigen Vorbehandlung mit den 0,1%igen KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse, gemessen an der Reisolierungsrate aus nicht kollabierten Sämlingen nach 5-tägiger Pathogeninokulation (n = 6, p le 0,05).


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1%ige Anwendung der KF:

Der Infektionsverlauf bei den Sämlingen mit 1%iger KF-Vorbehandlung zeigte am 1. Boniturtermin (5 dpi) keine statistisch signifikanten Unterschiede. Der 2. Termin (7 dpi) ließ entsprechend der 0,1%igen KF-Anwendung bei den Übergangsphase-Varianten beider Stämme tendenziell eine pathogeneseverzögernde Wirkung erkennen, die sich jedoch nicht von der unbehandelten Kontrolle unterschied. Zum Zeitpunkt des Versuchsendes (10 dpi) beinhaltete die Übergangsphase-Variante des Stammes FZB G noch 40 % nicht kollabierte Tomatensämlinge. Auch die Behandlung mit dem KF der stationären Phase - besonders des Stammes FZB G - zeigte ebenfalls eine befallsreduzierende Wirkung. Allerdings sind diese Ergebnisse aufgrund der zuvor festgestellten, zum Teil signifikanten Wachstums- und Entwicklungshemmungen durch die Anwendung der 1%ig-konzentrierten KF, mit entsprechender Distanz zu beurteilen. Es konnte beobachtet werden, daß mit der z. T. stark wuchsinhibierenden Wirkung der KF der Übergangs- und der stationären Phase ein Ausbleiben von Hypokotyleinschnürungen einherging. In Tabelle 5 und Abbildung 14 sind die Ergebnisse dargestellt.

Tabelle 5: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB C und des Landy-Mediums (LM) bei 1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).

  Anzahl kollabierter Tomatensämlinge
  5 dpi 7 dpi 10 dpi
Variante Stück rel. (%) Stück rel. (%) Stück rel. (%)
Kontrolle 6 (40,0) 13 (86,7) 15 (100,0)
LM 5 (33,3) 13 (86,7) 15 (100,0)
log-Phase 4 (26,7) 12 (80,0) 14 (93,3)
Ü-Phase 7 (46,7) 10 (66,7) 11 (73,3)
ES-Phase 7 (46,7) 11 (73,3) 13 (86,7)


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Abbildung 14: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G und des Landy-Mediums (LM) bei 1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

Die Übergangsphase-Varianten führten auch hier zu einer geringeren Ausbreitung des Welkeerregers in den Leitgefäßbahnen der Tomatensämlinge. Dies äußerte sich besonders im Reisolationsergebnis der Segmente der Sproßspitze. Auch durch die Behandlungen mit den KF der stationären Phase konnte eine befallsreduzierende Wirkung erreicht werden, obgleich auch diese durch Wachstums- und Entwicklungshemmungen der Tomatensämlinge wahrscheinlich mit begünstigt wurde.

Die Ergebnisse der Pathogenreisolation sind in Abbildung 15 dargestellt.


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Abbildung 15: Einfluß der 10-tägigen Vorbehandlung mit den 1%igen KF der beiden

B. subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse, gemessen an der Reisolierungsrate aus nicht kollabierten Sämlingen nach 5-tägiger Pathogeninokulation (n = 6, p le 0,05).

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit den Extraktionsmitteln Methanol und Essigsäureethylester in relevanten Konzentrationen (0,01-, 0,1- und 1%ig) hatte keinen Einfluß auf die geprüften Parameter von Wachstum und Pathogenese (Ergebnis nicht graphisch dargestellt).

3.1.2. Wirkung der bakteriellen antibiotikafreien Kulturfiltrate

3.1.2.1. Pflanzenwachstum und Entwicklung

0,1%ige Anwendung der antibiotikafreien KF:

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit den lipopeptidantibiotikafreien KF der beiden

B. subtilis-Stämme zeigte bei den Wachstumsparametern des Sprosses und den Wurzelfrisch- und Trockenmassen keine signifikanten Veränderungen gegenüber der unbehandelten Kontrollvariante. Erwähnenswert ist jedoch, daß die KF der stationären Phase nach der Antibiotikaausfällung, im Vergleich zu den komplexen KF bei gleicher Anwendungskonzentration, eine deutliche Förderung des Wurzelwachstums bewirkten.


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Es kann also davon ausgegangen werden, daß die in den KF der stationären Phase enthaltenen Lipopeptide bereits in geringen Konzentrationen das Sämlingswachstum in der axenischen Nährlösungskultur negativ beeinflußten. Hierbei zeigte sich wiederum, daß der Stamm FZB G mit 19,5 % eine stärkere Wirkung als der Stamm FZB C mit 8,9 % hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 und Abbildung 16 dargestellt.

Das der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogene Landy-Medium führte zu keinen nennenswerten Wachstumsveränderungen der Tomatensämlinge.

Tabelle 6: Wirkung der KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G nach Ausfällung der Lipopeptidantibiotika und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei 0,1%iger Anwendung nach 10 Tagen (n=5, *n=10, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

      FZB C FZB G
  Kontr. LM log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph.
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                 
Sproß-                
                 
länge* (cm) 6,8a 7,0a 7,2a 7,1a 7,2a 7,0a 6,7a 7,3a
  (100) (102,9) (105,3) (104,4) (105,3) (102,6) (99,5) (107,3)
                 
frischm. (g) 0,36a 0,37a 0,36a 0,37a 0,34a 0,35a 0,36a 0,39a
  (100) (104,4) (100,0) (104,4) (95,6) (97,8) (100,0) (108,3)
                 
trockenm. (mg) 43,1a 44,2a 46,4a 44,5a 43,5a 44,3a 42,6a 46,1a
  (100) (102,6) (107,6) (103,3) (101,0) (102,8) (98,9) (107,0)
                 
Wurzel-                
                 
frischm. (mg) 158,5a 158,5a 161,5a 158,2a 159,6a 160,7a 159,3a 157,5a
  (100) (100,0) (101,9) (99,8) (100,7) (101,4) (100,4) (99,4)
                 
trockenm. (mg) 10,5a 10,6a 10,7a 11,3a 11,1a 10,8a 11,4a 11,4a
  (100) (100,9) (101,8) (107,9) (105,3) (102,6) (108,8) (108,8)


51

Abbildung 16: Förderung des Wurzelwachstums der Tomatensämlinge gegenüber der unbehandelten Kontrolle nach 10-tägiger Behandlung mit den antibiotikafreien KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) bei 0,1%iger Anwendung (n = 5, p le 0,05, Kontr. = 123,6 cm)

1%ige Anwendung der antibiotikafreien KF:

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit den 1%igen KF nach Antibiotikaausfällung führte bei den Varianten der logarithmischen Phase und der Übergangsphase beider Stämme zu einer deutlichen Hemmung der Sproß- und Wurzelentwicklung (Tabelle 7 und Abbildung 17). Die Sproßlänge wurde beispielsweise bei der Variante FZB G - log-Phase um 27,1 % gegenüber der Kontrolle signifikant reduziert. Auffällig ist weiterhin, daß die Hemmwirkung bei den Varianten der logarithmischen Phase am stärksten ausgeprägt ist. Auch das Landy-Medium führte in dieser Konzentration zu beträchtlichen Wachstumsreduzierungen der Tomatensämlinge. Im Vergleich beider Bacillus-Stämme ist eine tendenziell stärkere Beeinflussung durch die Behandlungsvarianten des Stammes FZB G erkennbar. Bemerkenswert ist jedoch, daß bei den Behandlungen mit den KF der stationären Phase im Vergleich zur Wirkung der komplexen KF (mit Lipopeptidantibiotika) bei gleicher Anwendungskonzentration keine signifikanten Reduzierungen der Wachstumsparameter der Testsämlinge beobachtet werden konnten. Die Tomatensämlinge entwickelten sich in diesen Varianten ohne Unterschiede gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Dies verdeutlicht, ähnlich den Varianten der 0,1%igen antibiotikafreien KF-Anwendung, den offensichtlich bestehenden Zusammenhang mit der Wirkung der ausgefällten Lipopeptide.


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Tabelle 7: Wirkung der KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G nach Ausfällung der Lipopeptidantibiotika auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei 1%iger Anwendung nach 10 Tagen (n=5, *n=10, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

      FZB C FZB G
  Kontr. LM log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph.
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                 
Sproß-                
                 
länge* (cm) 6,8a 5,5a 5,7a 6,0a 6,7a 5,0a 6,0a 7,0a
  (100) (81,2) (84,2) (88,2) (98,7) (72,9) (88,2) (103,3)
                 
frischm. (g) 0,36a 0,31a 0,28a 0,30a 0,34a 0,26a 0,29a 0,35a
  (100) (86,1) (78,7) (83,8) (96,0) (71,8) (82,2) (97,8)
                 
trockenm. (mg) 43,1ab 33,9ab 31,4ab 36,5ab 40,4ab 28,1b 33,0ab 43,9a
  (100) (78,6) (72,8) (84,7) (93,8) (65,3) (76,6) (101,8)
                 
Wurzel-                
                 
frischm. (mg) 158,5abc 132,3bcd 125,4d 131,7bcd 167,6a 115,2d 127,3cd 160,6ab
  (100) (83,5) (79,1) (83,2) (105,7) (72,7) (80,3) (101,3)
                 
trockenm. (mg) 10,5ac 8,5abc 7,9bc 8,3abc 10,6a 7,6c 8,4abc 10,6a
  (100) (81,3) (75,0) (78,6) (101,0) (72,1) (79,9) (101,1)

(Sproßtrockenmasse: HSD = 15,2, Wurzelfrischmasse: HSD = 32,7, -trockenmasse: HSD = 2,6)

Abbildung 17: Wirkung der antibiotikafreien KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) bei 1%iger Anwendung auf das Wurzelwachstum der Tomatensämlinge gegenüber der unbehandelten Kontrolle nach 10-tägiger Behandlung (n = 5, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05, Kontr. = 139,7 cm, HSD = 20,5 %)


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3.1.2.2. Pathogenese

0,1%ige Anwendung der antibiotikafreien KF:

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit den antibiotikafreien KF der beiden B. subtilis-Stämme führte zu keinen signifikanten Unterschieden hinsichtlich des Pathogeneseverlaufes. Dennoch konnte bei der Übergangsphase-Variante des Stammes FZB G tendenziell ein schwach verringerter Anteil kollabierter Sämlinge festgestellt werden (Abbildung 18). Bei der entsprechenden Variante des Stammes FZB C konnte ein solcher Trend nicht beobachtet werden (Tabelle 8). Des weiteren zeigten die logarithmische Phase-Varianten am 1. und 2. Boniturtermin teilweise eine leichte Förderung des Kollabierens der Pflanzen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Am Ende der Infektionsphase (10 dpi) zeigten die verschiedenen Behandlungen gegenüber der unbehandelten Kontrolle ein ausgeglichenes Befallsbild.

Das Landy-Medium zeigte nach 5 und 7 dpi ähnlich den Varianten der logarithmischen Phase eine leichte, jedoch nicht signifikante, Begünstigung des Pathogeneseverlaufes.

Tabelle 8: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit den antibiotikafreien KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB C und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) bei 0,1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).

  Anzahl kollabierter Tomatensämlinge
  5 dpi 7 dpi 10 dpi
Variante Stück rel. (%) Stück rel. (%) Stück rel. (%)
Kontrolle 6 (40,0) 11 (73,3) 15 (100,0)
LM 7 (46,7) 11 (73,3) 15 (100,0)
log-Phase 6 (40,0) 12 (80,0) 14 (93,3)
             
Ü-Phase 7 (46,7) 11 (73,3) 15 (100,0)
             
ES-Phase 7 (46,7) 8 (53,3) 14 (93,3)


54

Abbildung 18: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit den antibiotikafreien KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) bei 0,1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).

Der Anteil Stengelabschnitte, aus denen Fusarium-Myzel auswuchs, war im Vergleich zur 0,1%igen Anwendung der komplexen KF größer. Dennoch konnte eine verringerte vertikale Pathogenausbreitung besonders bei den Übergangsphase-Varianten beider Stämme gegenüber der unbehandelten Kontrolle festgestellt werden (Abbildung 19). Der Anteil von Myzelauswuchs aus den Segmenten der Sproßspitze verdeutlicht dies besonders. Auch die Behandlung der Tomatensämlinge mit dem antibiotikafreien KF der stationären Phase des Stammes FZB C führte zu einem reduzierten Anteil von Stengelabschnitten mit Myzelauswuchs.


55

Abbildung 19: Einfluß der 10-tägigen Vorbehandlung mit den antibiotikafreien 0,1%igen KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse, gemessen an der Reisolierungsrate aus nicht kollabierten Sämlingen nach 5-tägiger Pathogeninokulation (n = 6, p le 0,05).

1%ige Anwendung der antibiotikafreien KF:

Die antibiotikafreien KF der beiden B. subtilis-Stämme ließen über den gesamten Infektionszeitraum keine Wirkung auf die Pathogenese erkennen. Auch eine positive Beeinflussung durch die KF der Übergangsphase-Varianten war zu keinem Zeitpunkt gegeben. Bei der Vorbehandlung mit KF der Übergangsphase zeigten beide Stämme zum 2. Boniturtermin sogar eine tendenzielle Förderung der Pathogenentwicklung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 und Abbildung 20 dargestellt.

Die Wirksamkeit des Landy-Mediums unterschied sich nicht von den übrigen Behandlungs-varianten.


56

Tabelle 9: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit den antibiotikafreien KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB C und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) bei 1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).

  Anzahl kollabierter Tomatensämlinge
  5 dpi 7 dpi 10 dpi
Variante Stück rel. (%) Stück rel. (%) Stück rel. (%)
Kontrolle 6 (40,0) 13 (86,7) 15 (100,0)
LM 5 (33,3) 12 (80,0) 15 (100,0)
log-Phase 6 (40,0) 12 (80,0) 14 (93,3)
             
Ü-Phase 6 (40,0) 15 (100,0) 15 (100,0)
             
ES-Phase 6 (40,0) 14 (93,3) 15 (100,0)

Abbildung 20: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit den antibiotikafreien KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) bei 1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).

Abbildung 20: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit den antibiotikafreien KF der logarithmischen-, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) bei 1%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).


57

Die Vorbehandlung mit den 1%igen antibiotikafreien KF und dem Landy-Medium ließ keinen unmittelbaren Einfluß auf den Reisolationsanteil des Pathogens aus den Sproßsegmenten erkennen (Abbildung 21).

Abbildung 21: Einfluß der 10-tägigen Vorbehandlung mit den antibiotikafreien 1%igen KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und dem der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen Landy-Medium (LM) auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse, gemessen an der Reisolierungsrate aus nicht kollabierten Sämlingen nach 5-tägiger Pathogeninokulation (n = 6, p le 0,05).

3.1.3. Wirkung der Essigsäureethylester-Fraktion des KF und deren HPLC-Subfraktionen

3.1.3.1. Pflanzenwachstum und Entwicklung

20%ige Anwendung:

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit der Essigsäurethylester-Fraktion (G) führte zu keiner signifikanten Veränderung des Wachstums gegenüber der unbehandelten Kontrollvariante (Tabelle 10). Die aus dieser Fraktion gewonnenen HPLC-Subfraktionen G3, G5 und G6 zeigten jedoch eine Förderung des Pflanzenwachstums (Tabelle 10, Abbildung 22). Besonders die Subfraktionen G3 und G6 führten teilweise zu einer signifikanten Zunahme der


58

Wurzellänge und der Wurzeltrockenmasse der behandelten Sämlinge. Die deutlichste Wirkung der Subfraktionen konnte auch hier im Bereich des Wurzelwachstums festgestellt werden.

Die Essigsäureethylester-Fraktion (G) zeigte in den Untersuchungen von ALEMAYEHU (1997) eine cytokininähnliche Aktivität.

Durch die Analytik dieser Fraktion mittels HPLC konnte jedoch die Anwesenheit bekannter bzw. typischer Vertreter dieser Phytohormongruppe ausgeschlossen werden (FISCHER 1996). Ferner war die durchgeführte Extraktion so ausgerichtet, daß im KF enthaltene Auxine in dieser Fraktion angereichert sein müßten (KOLETZKI 1996). Dennoch konnten durch die HPLC-Untersuchungen keine Indol-Verbindungen nachgewiesen werden (FISCHER 1996).

Die HPLC-Subfraktionen G3, G5 und G6 zeigten sowohl eine cytokinin- als auch auxinähnliche Aktivität, wobei sich die cytokininähnliche Wirkung gegenüber der Ausgangsfraktion (G) nicht wesentlich verändert hatte (ALEMAYEHU 1997).

Tabelle 10: Wirkung der Essigsäureethylester-Fraktion G und deren HPLC-Subfraktionen G1- G6 auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei 20%iger Anwendungskonzentration nach einer Kultivierungsdauer von 10 Tagen (n=5, *n=10, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

      HPLC-Subfraktionen
  Kontr. G G1 G2 G3 G4 G5 G6
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                 
Sproß-                
                 
länge* 6,9a 7,0a 6,9a 7,0a 7,2a 6,6a 7,0a 7,5a
in cm (100) (102,1) (100,0) (102,1) (104,4) (95,3) (102,0) (108,7)
                 
                 
trockenm. 37,8a 38,5 38,1a 36,4a 39,5a 37,0a 35,7a 41,1a
in mg (100) (101,8) (100,9) (96,2) (104,6) (97,8) (94,4) (108,7)
                 
                 
Wurzel-                
                 
trockenm. 7,5a 8,0ab 7,6a 7,2a 9,5ab 7,7a 8,4ab 10,1b
in mg (100) (106,0) (101,5) (95,8) (126,1) (102,1) (112,3) (134,8)

(Wurzeltrockenmasse: HSD = 2,2)


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Abbildung 22: Wirkung der Essigsäureethylester-Fraktion G und deren HPLC-Subfraktionen (G1-G6) auf das Wurzellängenwachstum von Tomatensämlingen bei einer Anwendungskonzentration von 20 % nach einer Kultivierungsdauer von 10 Tagen (n = 5, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05,

Kontr. = 117,6 cm, HSD = 20,5 %).

3.1.3.2. Pathogenese

Die Vorbehandlung der Tomatensämlinge mit der G-Fraktion und deren HPLC-Subfraktionen führte mit Ausnahme der Variante G3 zu keiner statistisch gesicherten Verringerung des Anteils an kollabierten Sämlingen. Es konnte zu keinem der 3 Boniturtermine ein Unterschied zur unbehandelten Kontrolle ermittelt werden. Die mit der Subfraktion G3 kultivierten Pflanzen zeigten jedoch zum 1. Boniturtermin mit einem Anteil von nur 33,3 % von kollabierten Sämlingen gegenüber der Kontrolle mit 66,7 % eine um ca. 50 % reduzierte Pathogenwirkung. Zum 2. und 3. Termin unterschied sich der Anteil kollabierter Sämlinge signifikant von der unbehandelten Kontrolle. Im Vergleich der Wirkung dieser HPLC-Subfraktion mit dem aus ihr extrahierten KF der Übergangsphase des Stammes FZB G ist eine deutliche Aktivitätssteigerung festzustellen. Das Ergebnis ist in Abbildung 23 dargestellt.


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Abbildung 23: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der Essigsäureethylester-Fraktion G und deren HPLC-Subfraktionen (G1-G6) bei 20%iger Anwendung auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

Die Reisolation des Pathogens aus den Sproßsegmenten zeigte bei der Variante G3 einen z. T. signifikant geringeren Anteil an Segmenten mit Myzelauswuchs. Aus den Segmenten der Sproßspitze konnte z. B. nur aus 20 % Fusarium-Myzel reisoliert werden. Aus den entsprechenden Abschnitten der Kontrollpflanzen wuchs aus jedem Segment der Pilz aus

(100 %). Dieses Ergebnis korreliert mit der Verringerung des Anteils kollabierter Sämlinge nach Vorbehandlung mit dieser HPLC-Subfraktion.

Die Wirksamkeit der Behandlung mit der Fraktion G sowie den restlichen Subfraktionen unterschied sich statistisch nicht von der unbehandelten Kontrollvariante. Erwähnenswert ist jedoch, daß mit Ausnahme der Variante G5 alle geprüften HPLC-Subfraktionen im Bereich der Sproßspitze zu einem leichten Rückgang der Reisolationsrate führten (Abbildung 24).


61

Abbildung 24: Einfluß der 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der Essigsäureethylester-Fraktion G und deren HPLC-Subfraktionen (G1-G6) auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse, gemessen an der Reisolierungsrate nicht kollabierter Sämlinge nach 5-tägiger Pathogeninokulation (n = 5, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

40%ige Anwendung der HPLC-Subfraktionen G3 und G6:

Aufgrund der guten Wirkung der Subfraktionen G3 und G6 hinsichtlich der Förderung des Wurzelwachstums bzw. der Pathogenesehemmung wurden diese beiden Varianten mit einer verdoppelten Anwendungskonzentration nochmals geprüft. Hierbei führte besonders die Variante G3 zu einem signifikanten Wurzellängen- und Trockenmassezuwachs sowohl gegenüber der Kontrolle als auch gegenüber der 20%igen Anwendungskonzentration. Bei der G6-Variante war die Wirkung auf das Wurzelwachstum weniger deutlich ausgeprägt und unterschied sich nicht von der 20%igen Konzentration; jedoch von der Kontrolle. Die Förderung des Sproßwachstums konnte im Vergleich zur 20%igen Applikation bei beiden Subfraktionen nicht erhöht werden.

Die signifikante Steigerung des Wurzellängenwachstums zwischen der 20- und 40%igen Anwendungskonzentration durch die Subfraktion G3 macht die physiologisch wirksame Potenz der in dieser Subfraktion enthaltenen Substanzen deutlich. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 und Abbildung 25 dargestellt.


62

Tabelle 11: Wirkung der HPLC-Subfraktionen G3 und G6 auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei einer 20- und 40%igen Anwendungskonzentration nach einer Kultivierungsdauer von 10 Tagen (n=5, *n=10, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

    HPLC-Subfraktionen
  Kontr. G3 (20%) G3 (40%) G6 (20%) G6 (40%)
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%)
           
Sproß-          
           
länge* 6,9a 7,2a 7,3a 7,5a 7,0a
in cm (100) (104,4) (105,8) (108,7) (101,4)
           
           
trockenm. 37,8a 39,5a 42,1a 41,1a 39,9a
in mg (100) (104,6) (111,3) (108,7) (105,6)
           
           
Wurzel-          
           
trockenm. 7,5a 9,5ab 10,6b 10,1b 10,0b
in mg (100) (126,6) (141,3) (134,7) (133,3)

(Wurzeltrockenmasse HSD = 2,5)

Abbildung 25: Wirkung der HPLC-Subfraktionen G3 und G6 auf das Wurzellängenwachstum von Tomatensämlingen bei einer Anwendungskonzentration von 20 und 40 % nach einer Kultivierungsdauer von 10 Tagen (n = 5, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05, Kont. = 125,7 cm, HSD = 16,7 %).


63

Pathogenese:

Die Anwendung der erhöhten, 40%igen Konzentration führte bei beiden Subfraktionen zu keiner Wirkungssteigerung gegenüber der unbehandelten Kontrolle und der 20%igen Konzentration (Abbildung 26 ). Die potentielle phytosanitäre Wirksamkeit der Subfraktion G3 ist scheinbar nach “oben” bei 20 % ausgeschöpft. Dies schließt jedoch eine weitere Wirkungserhöhung durch geringere Konzentrationen nicht aus. Über die Potenz dieser HPLC-Subfraktion, Resistenz bzw. Toleranz zu induzieren, kann deshalb an dieser Stelle nur spekuliert werden.

Die Pathogenausbreitung im Sproß der Sämlinge ließ sich durch die Erhöhung der Anwendungskonzentration im Vergleich zur 20%igen Anwendung nicht weiter reduzieren (Ergebnis nicht graphisch dargestellt).

Abbildung 26: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung mit den HPLC-Subfraktionen G3 und G6 in zwei verschiedenen Anwendungskonzentrationen (20 und 40 %) auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge, (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).


64

3.1.4. Wirkung der HPLC-Sub-Subfraktionen

3.1.4.1. Pflanzenwachstum und Entwicklung

Mit dem Ziel der Isolierung und Identifizierung von Reinsubstanzen wurden die beiden in der axenischen Nährlösungskultur biologisch aktivsten Subfraktionen G3 und G6 des B. subtilis-Stammes FZB G nochmals mittels präparativer HPLC getrennt. Aufgrund der sehr kurzen Zeitspanne zwischen den HPLC-Retentionszeiten der Subfraktionen G5 und G6 wurden beide Peaks, bei der wiederholten Trennung der G-Fraktion, als eine Probe abgesammelt und werden deshalb nachfolgend als G5+6 bezeichnet.

Im Tomatensämlingstest führte die Anwendung der Sub-Subfraktionen zu keinen signifikanten Wachstumsveränderungen gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Die Sub-Subfraktionen wurden in einer Konzentration von 20 % getestet (Tabelle 12).

Nach der HPLC-Trennung zeigten die Sub-Subfraktionen B und D aus der Trennung von G5+6 immer noch cytokinin- und auxinähnliche Wirkungen. Die Sub-Subfraktionen von G3 hingegen hatten keine derartigen Wirkungen mehr (ALEMAYEHU 1997).

Bei dieser Aufreinigungsstufe (Sub-Subfraktionierung) konnte im Vergleich zu den Ausgangs-Subfraktionen ein allgemein abnehmender Trend der Wirksamkeit der physiologisch aktiven Komponenten des KF festgestellt werden.


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Tabelle 12: Wirkung der HPLC-Sub-Subfraktionen von G3 und G5+6 auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei einer 20%igen Anwendungskonzentration nach 10-tägiger Kultivierungsdauer (n = 5, *n = 10, p le 0,05).

    HPLC-Sub-Subfraktionen (von G3) HPLC-Sub-Subfraktionen (von G5+6)
  Kont. B C F G B D G E
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                   
Sproß-                  
                   
länge* 5,9a 5,7a 5,5a 6,1a 5,4a 6,3a 5,6a 5,7a 5,9a
in cm (100) (96,6) (93,2) (103,4) (91,5) (106,8) (94,9) (96,6) (100,0)
                   
                   
trockenm. 35,1a 37,3a 38,1a 35,8a 36,0a 37,8a 35,5a 38,3a 33,2a
in mg (100) (106,3) (108,5) (102,0) (102,6) (102,0) (101,1) (109,1) (94,6)
                   
                   
Wurzel-                  
                 
länge 140,6a 144,4a 152,2a 156,1a 132,6a 158,2a 147,8a 159,3a 141,2a
in cm (100) (102,7) (108,2) (111,0) (94,3) (112,5) (105,1) (113,3) (100,4)
                   
trockenm. 8,6a 9,3a 9,9a 8,1a 8,7a 8,9a 8,4a 9,6a 8,5a
in mg (100) (108,1) (115,1) (94,2) (101,2) (103,5) (97,7) (111,6) (98,8)

3.1.4.2. Pathogenese

Die Behandlung mit den Sub-Subfraktionen von G3 und G5+6 hatte keine Auswirkungen auf die Fusarium-Infektion der Tomatensämlinge. Die gefundenen Ergebnisse zum Anteil kollabierter Sämlinge sowie der Pathogenreisolation entsprechen weitgehend denen der 1%igen Anwendung der antibiotikafreien KF (Ergebnisse nicht graphisch dargestellt).


66

3.1.5. Wirkung der Phytohormone und der IAA-Vorstufe IPyA

3.1.5.1. Pflanzenwachstum und Entwicklung

Indol-3-ylessigsäure (IAA) und deren Vorstufe Indol-3-ylpyruvatsäure (IPyA):

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit dem Auxin IAA und einer bedeutenden Vorstufe dieser Substanz, der IPyA, zeigte besonders bei einer Konzentration von 10-4 M stark ausgeprägte signifikante Wuchshemmungen. Diese erstreckten sich sowohl auf die Sproß- als auch auf die Wurzelentwicklung. Auch bei der Konzentration von 10-6 M konnte noch eine inhibierende Wirkung der Sämlingsentwicklung beobachtet werden, wobei diese bei IAA intensiver ausgeprägt war. Ab einer Konzentration von 10-7 M konnten bezüglich der Sproßentwicklung keine Unterschiede zur unbehandelten Kontrolle mehr festgestellt werden. Im Wurzelbereich führte diese Konzentration immer noch zu leichten Wachstums- und Entwicklungshemmungen. Erst die 10-8 M Verdünnungsstufe führte zu einem gleichen Wurzelwachstum wie die Kontrollvariante. Die nach LIBBERT (1993) für die Förderung der Wurzelentwicklung physiologisch aktivste Konzentration für exogen gebotene IAA von

10-10 M, zeigte auch hier tendenziell eine Zunahme der Wurzellängen und der Wurzeltrockenmassen beider Varianten. Des weiteren konnte bei den Anwendungskonzentrationen von 10-8 bis 10-6 M eine verstärkte Wurzelhaarentwicklung beobachtet werden, welche sich bei der Konzentration 10-6 M im unmittelbaren Bereich der Wurzelspitze konzentrierte. Ferner konnte bei dieser Konzentration ein leichtes Anschwellen der Wurzelspitzen beobachtet werden. Die Varianten 10-7 und 10-6 M zeigten zusätzlich einen verstärkten Ansatz von Seitenwurzeln. Bei den Sämlingen der Variante IAA 10-4 M zeigte sich bereits 16 Stunden nach dem Einhängen in die Testlösung eine deutliche Epinastie der Kotyledonen, welche bis zum 7. Tag der Behandlung anhielt. Außerdem waren die Kotyledonenunterseiten deutlich mit Anthocyanen angereichert.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefaßt.


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Tabelle 13: Wirkung des Phytohormons IAA und dessen Vorstufe IPyA auf das Wachstum und die Entwicklung von Tomatensämlingen bei verschiedenen molaren Anwendungs-konzentrationen nach einer Kultivierungsdauer von 10 Tagen (n = 5, *n = 10, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

    Indol-3-ylessigsäure (IAA) Indol-3-ylpyruvatsäure (IPyA)
  Kontr. 10-10 10-8 10-7 10-6 10-4 10-10 10-8 10-7 10-6 10-4
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                       
Sproß-                      
                       
länge* 6,8a 7,1a 6,9a 6,9a 6,5a 4,6b 6,7a 6,8a 6,9a 6,6a 3,6b
in cm (100) (104,4) (101,5) (101,5) (95,6) (67,6) (102,0) (100,0) (101,5) (97,1) (52,9)
                       
                       
trockenm. 38,8a 38,1a 38,9a 39a 30,2a 16,3b 35,7a 38,2a 39,6a 33,9a 6,3b
in mg (100) (98,2) (100,3) (100,5) (77,8) (42,1) (92,0) (98,5) (102,1) (87,4) (16,2)
                       
                       
Wurzel-                      
                       
länge 167,4a 182,2a 175,6a 170,3a 103,8b 63,1c 179,2a 169,0a 155,0a 151,1a 39,4c
in cm (100) (108,8) (104,9) (101,7) (62,0) (37,7) (107,0) (101,0) (92,6) (90,2) (23,5)
                       
                       
trockenm. 8,2ab 8,75ab 8,2a 7,4b 6,4bc 3,7d 9,8a 8,1b 7,9b 7,2bc 4,7cd
in mg (100) (105,9) (100,7) (89,6) (77,5) (44,8) (118,6) (98,1) (95,6) (87,2) (56,9)

(Sproßlänge: HSD = 1,2, -trockenmasse: HSD = 12,2; Wurzellänge: HSD = 31,2, -trockenmasse: HSD = 2,6)

Indol-3-ylbuttersäure (IBA) und das Cytokinin Kinetin:

Das synthetische Auxin IBA zeigte im Vergleich zur IAA und der Vorstufe IPyA mit ansteigender Konzentration eine stärkere wuchsinhibierende Wirkung auf die Sproß- und Wurzelentwicklung der Tomatensämlinge (Tabelle 14 ). Bereits die 10-8 M Applikation führte z. B. zu einer fast 26%igen Reduzierung der Wurzellänge. Bei dieser Variante konnte auch eine verstärkte Wurzelhaarentwicklung beobachtet werden. Die nächsthöhere Konzentration (10-7 M) fiel besonders durch ihre leicht verdickte Hauptwurzel und eine verstärkte Wurzelhaarbildung auf. Die Konzentrationen 10-6 und 10-4 M führten analog zur IAA zu starken Wuchsinhibierungen. Lediglich die geringste Anwendungskonzentration von 10-10 M zeigte keine signifikanten Unterschiede mehr zur unbehandelten Kontrolle.


68

Die Kinetin-Anwendung führte ebenfalls ab einer Konzentration von 10-8 M besonders im Wurzelbereich zu signifikanten Wachstumshemmungen (Tabelle 14). Diese setzten sich mit dem Ansteigen der Konzentration entsprechend fort. So wurde die Wurzellänge beispielsweise bei der 10-4 M Applikation um fast 82 % gegenüber der unbehandelten Kontrolle reduziert. Die Tomatensämlinge dieser Variante zeigten nach 48 Stunden vergleichbare Anthocyananreicherungen wie die IAA 10-4 M-Variante. Außerdem konnte hier eine Hyponastie der Kotyledonen beobachtet werden. Besonders auffällig bei dieser Behandlungsvariante war, daß mit einer Konzentrationszunahme ab 10-8 M eine rübenförmig verdickte und anthocyanangereicherte Hauptwurzel auftrat. Entsprechend verringert wurde das Längenwachstum der Hauptwurzel und der Seitenwurzeln.

Tabelle 14: Wirkung des synthetischen Auxins IBA und des Cytokinins Kinetin auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei verschiedenen molaren Anwendungskonzentrationen nach einer Kultivierungsdauer von 10 Tagen (n = 5, *n = 10, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

    Indol-3-ylbuttersäure (IBA) Kinetin
  Kontr. 10-10 10-8 10-7 10-6 10-4 10-10 10-8 10-7 10-6 10-4
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                       
Sproß-                      
                       
länge* 6,2a 6,2a 5,1ab 4,3bcd 3,2cde 2,5de 6,5a 4,7abc 3,8bcde 3,5bcde 2,3e
in cm (100) (100,0) (82,4) (70,0) (51,3) (40,1) (105,3) (76,4) (61,8) (56,7) (37,4)
                       
                       
trockenm. 37,6a 37,3a 32,7a 26,7ab 23,7abc 9,2c 37,6a 31,3ab 25,7abc 24,3abc 15,1bc
in mg (100) (99,2) (87,2) (70,4) (62,9) (24,4) (100,0) (83,2) (68,4) (64,7) (40,2)
                       
                       
Wurzel-                      
                       
länge 154,2a 135,4ab 114,3b 75,1c 34,7de 15,4e 160,8a 75,2c 47,2cd 39,2de 27,9de
in cm (100) (87,8) (74,1) (48,7) (22,5) (10,0) (104,3) (48,8) (30,6) (25,4) (18,1)
                       
                       
trockenm. 8,7ab 9,5a 8,4a 5,6abc 4,9bc 3,5c 8,4a 6,4abc 5,6abc 4,6c 3,9c
in mg (100) (109,6) (96,3) (64,1) (56,7) (40,2) (96,9) (73,5) (63,8) (53,2) (44,7)

(Sproßlänge: HSD = 1,9, -trockenmasse: HSD = 17,2; Wurzellänge: HSD = 28,0, -trockenmasse: HSD = 3,9)


69

3.1.5.2. Pathogenese

Indol-3-ylessigsäure (IAA) und deren Vorstufe Indol-3-ylpyruvatsäure (IPyA):

Die Vorkultivierung der Tomatensämlinge mit IAA zeigte zu keinem der 3 Boniturtermine eine Beeinflussung des Pathogeneseverlaufes (Tabelle 15). Die Anwendungskonzentration

10-4 M führte zu einem leicht verringerten Anteil an kollabierten Sämlingen. Dies kann unter Berücksichtigung der stark wuchsinhibierenden Wirkung nicht als Verringerung der Pathogenese betrachtet werden.

Tabelle 15: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit dem Phytohormon Indol-3-ylessigsäure (IAA) in verschiedenen molaren Konzentrationen auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).

  Anzahl kollabierter Tomatensämlinge
  5 dpi 7 dpi 10 dpi
Variante Stück rel. (%) Stück rel. (%) Stück rel. (%)
Kontrolle 8 (53,3) 14 (93,3) 15 (100,0)
             
IAA 10-10 M 8 (53,3) 12 (80,0) 14 (93,3)
             
IAA 10-8 M 7 (46,7) 15 (100,0) 15 (100,0)
             
IAA 10-7 M 8 (53,3) 14 (93,3) 15 (100,0)
             
IAA 10-6 M 7 (46,7) 13 (86,7) 15 (100,0)
             
IAA 10-4 M 6 (40,0) 12 (80,0) 13 (86,7)

Ein wesentlich anderes Bild zeigte die 10-tägige Vorbehandlung mit der IAA-Vorstufe IPyA. Hier führte die Anwendung in den Konzentrationen 10-8 und 10-7 M nach 5- und 7-tägiger Pathogeninokulation zu einer signifikanten Reduzierung des Anteils an kollabierten Tomatensämlingen. Am 1. Boniturtermin konnten bei der Variante 10-7 M keine kollabierten Sämlinge festgestellt werden. Die 10-8 M-Variante lag mit einem Anteil von 26,7 % nur leicht darüber. Die nicht vorbehandelte Kontrolle zeigte zu diesem Zeitpunkt bereits mehr als 50 % eingeschnürte und umgefallene Sämlinge. Am 2. Boniturtermin wurde ein ähnliches Bild


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beobachtet. Die Behandlungsvarianten 10-8 und 10-7 M zeigten mit nur 33,3 bzw. 6,7 % kollabierten Sämlingen gegenüber der unbehandelten Kontrolle mit 93,3 % eine um 64 bzw. 93 % signifikant verringerte Pathogenwirkung. Die Varianten 10-6 und 10-4 M hatten mit einem Anteil von 66,7 bzw. 73,3 % keine vergleichbar positive Wirkung. Selbst am 3. Boniturtermin zeigte die Variante 10-7 M immer noch eine signifikante Befallsreduktion. Hervorzuheben ist, daß offensichtlich keine eindeutige Dosis-Wirkungsbeziehung besteht.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 27 dargestellt.

Abbildung 27: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der IAA-Vorstufe IPyA in verschiedenen molaren Konzentrationen auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

Die Pathogenreisolation aus den Sproßsegmenten nichtkollabierter Tomatensämlinge zeigte, daß die Ausbreitung des Pilzmyzels im Wirtsxylem deutlich langsamer bei den 10-8 und 10-7 M konzentrierten Varianten verlief. So konnte beispielsweise aus nur 50 % der Sproßsegmente des 1. Internodiums und 16,7 % der Sproßspitzensegmente der Variante 10-7 M Pilzmyzel reisoliert werden. Die Kontrolle zeigte demgegenüber eine 100%ige Reisolation aus den Segmenten des 1. Internodiums bzw. 83,3 % aus den Sproßspitzensegmenten. Selbst aus den sonst zu 100 % besiedelten Segmenten des Epikotyls konnte nach Vorbehandlung mit IPyA


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10-7 M nur aus 83,3 % der Segmente das Pathogen reisoliert werden. Die Variante 10-8 M zeigte im Vergleich zur 10-7 M-Variante mit einer 66,7- bzw. 50%iger Reisolationsrate eine schon etwas stärkere Pathogenausbreitung. Bei den Varianten 10-10, 10-6 und 10-4 M konnte ebenfalls kein signifikant geringerer Anteil an Pilzmyzel aus den Sproßsegmenten reisoliert werden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 28 dargestellt.

Abbildung 28: Einfluß einer 10-tägigen Vorbehandlung mit der Auxinvorstufe IPyA auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse, gemessen an der Reisolierungsrate aus nicht kollabierten Sämlingen nach 5-tägiger Pathogeninokulation (n = 6, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

Zur Überprüfung der Spezifität der gefundenen Wirkung der IPyA wurden mit dieser Substanz analog vorbehandelte Tomatensämlinge dem unspezifisch wirkenden Pathotoxin, Fusarinsäure ausgesetzt. Hierbei zeigte sich, daß die Behandlung mit der Auxinvorstufe bei Anwendungskonzentrationen von 10-10 bis 10-7 M zu einem verringerten Schädigungsindex führte (Abbildung 29). Am deutlichsten konnte die verringerte Symptomausprägung, infolge der Toxinwirkung, bei der Variante 10-10 M beobachtet werden. Die Sämlinge mit dieser Behandlungskonzentration zeigten zum 1. Boniturtermin (5 dpi) keine Anzeichen einer Intoxikation. Die nicht vorbehandelten Tomatensämlinge der Kontrolle sowie der Varianten 10-6 und 10-4 M zeigten bereits zu diesem Zeitpunkt deutlich beginnende Schadsymptome. Die Konzentrationen 10-10 und 10-8 M führten zu einem signifikant reduzierten Schädigungsindex gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Der Kompensationseffekt auf die Toxinwirkung konnte auch zum 2. und 3. Boniturtermin bei den Varianten 10-10 bis 10-7 M festgestellt


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werden. Es zeigte sich, daß mit zunehmender Konzentration eine Abnahme der Wirksamkeit korrelierte.

Abbildung 29: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der Auxin-Vorstufe IPyA in verschiedenen molaren Konzentrationen auf die Schädigung infolge einer Fusarinsäure-Intoxikation (25 ppm) nach 5, 7 und 10 Tagen (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

Indol-3-ylbuttersäure (IBA) und das Cytokinin Kinetin:

Die Behandlungen der Tomatensämlinge mit dem synthetischen Auxin IBA und dem Cytokinin Kinetin führten zu keiner Beeinflussung der Pathogenese. Es zeigten sich zu allen drei Boniturterminen keine statistisch signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl kollabierter Sämlinge zur unbehandelten Kontrollvariante. Lediglich die 10-4 M konzentrierten Varianten beider Phytohormone zeigten besonders zum 3. Boniturtermin einen leicht verringerten Anteil kollabierter Pflanzen. Dieser ist wahrscheinlich auf die stark wuchsinhibierende Wirkung dieser Konzentrationsstufe, wie schon bei IAA und IPyA festgestellt, zurückzuführen. Das Ergebnis der IBA-Varianten ist in Tabelle 16 und das der Kinetin-Varianten in Abbildung 30 dargestellt. Die Anzahl der Pathogen-Reisolationen aus den Sproßsegmenten zeigte ebenfalls keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Ergebnis nicht graphisch dargestellt).


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Tabelle 16: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit dem synthetischen Auxin Indol-3-ylbuttersäure (IBA) in verschiedenen molaren Konzentrationen auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).

  Anzahl kollabierter Tomatensämlinge
  5 dpi 7 dpi 10 dpi
  Stück rel. (%) Stück rel. (%) Stück rel. (%)
Kontrolle 6 (40,0) 12 (80,0) 15 (100,0)
             
IBA 10-10 M 5 (33,3) 12 (80,0) 14 (93,3)
             
IBA 10-8 M 7 (46,7) 15 (100,0) 15 (100,0)
             
IBA 10-7 M 5 (33,3) 14 (93,3) 15 (100,0)
             
IBA 10-6 M 7 (46,7) 12 (80,0) 15 (100,0)
             
IBA 10-4 M 5 (33,3) 12 (80,0) 13 (86,7)

Abbildung 30: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit Kinetin in verschiedenen molaren Konzentrationen auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 5-, 7- und 10-tägiger Pathogeninokulation (n = 15, p le 0,05).


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3.1.6. Wirkung des Pflanzenaktivators BION®

Der Pflanzenaktivator BION® wurde in einer Konzentration von 10-6 M als Referenzsubstanz geprüft. Höhere Konzentrationen (10-5, 10-4 und 10-3 M) erwiesen sich in der axenischen Nährlösungskultur als phytotoxisch und führten bei den Testsämlingen zu chlorotischen, eingerollten Blättern. Besonders auffällig bei diesen Konzentrationen war ein starkes Streckungswachstum des Epikotyls, welches den Pflanzen einen etiolierten Gesamteindruck verlieh. Die Ausprägung dieser Symptome verringerte sich mit abnehmender Konzentration.

Diese als phytotoxisch eingestuften Konzentrationen führten jedoch zu einer völligen Verhinderung des Kollabierens der inokulierten Tomatensämlinge. Gleichfalls konnten keine Myzelauswüchse aus dem Leitgefäßsystem beobachtet werden (Ergebnisse nicht graphisch dargestellt). Mit Erreichen einer Konzentration, die zu keinen phytotoxischen Erscheinungen mehr führte (10-6 M), ließ auch die gute pathogenesebeeinflussende Wirkung deutlich nach. Die Wirksamkeit von BION® (10-6 M) im Vergleich zu der HPLC-Subfraktion G3 und der IAA-Vorstufe IPyA (10-8 und 10-7 M) ist in den Abbildungen 31 und 32 dargestellt.

Abbildung 31: Gegenüberstellung der Wirkung des Pflanzenaktivators BION, IPyA und der HPLC-Subfraktion G3 auf den Anteil kollabierter Tomatensämlinge nach 10-tägiger Vorbehandlung in Nährlösungskultur unter axenischen Bedingungen (n = 15, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).


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Abbildung 32: Gegenüberstellung der Pathogenreisolationen aus Tomatensämlingssprossen nach 10-tägiger Vorkultivierung mit dem Pflanzenaktivator BION, IPyA und der HPLC-Subfraktion G3 in Nährlösungskultur unter axenischen Bedingungen nach 5-tägiger Pathogeninokulation (n = 7, *signifikant zur Kontrolle nach chi2-Test mit p le 0,05).

3.2. Gewächshauskultur

Unter Gewächshausbedingungen wurden nur die komplexen KF der beiden B. subtilis-Stämme und die IAA-Vorstufe IPyA in den gleichen Konzentrationen wie in der axenischen Nährlösungskultur geprüft. Zusätzlich wurde noch die IPyA-Konzentration 10-3 M getestet.

3.2.1. Wirkung der bakteriellen KF

3.2.1.1. Wachstum und Entwicklung

KF - 0,1%ige Anwendung:

Die 0,1%ige Anwendung der KF in der Substratkultur zeigte im Vergleich zur Nährlösungskultur eine weniger intensiv ausgeprägte Wirksamkeit auf das Wachstum und die Entwicklung der Tomatensämlinge. Selbst das in der Nährlösungskultur so sensitiv ansprechende Wurzellängenwachstum konnte nicht beeinflußt werden. Die Behandlungen mit den KF der beiden B. subtilis-Stämme unterschieden sich nicht signifikant von der Kontrolle (Tabelle 17).


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Tabelle 17: Wirkung der KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei 0,1%iger Anwendung nach 10 Tagen in Substratkultur unter Gewächshausbedingungen (n = 5, *n = 8, p le 0,05).

      FZB C FZB G
  Kontr. LM log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph.
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                 
Sproß-                
                 
länge* (cm) 4,6a 4,8a 5,0a 4,5a 4,8a 4,7a 4,8a 4,4a
  (100) (104,3) (108,7) (97,8) (104,3) (102,2) (104,3) (95,7)
                 
trockenm. (mg) 23,6a 24,3a 25,3a 24,2a 22,5a 24,6a 24,0a 23,5a
  (100) (103,0) (107,2) (102,5) (95,3) (105,1) (101,7) (99,6)
                 
Wurzel-                
                 
länge (cm) 134,1a 139a 140,6a 132,3a 136,8a 139,5a 134,0a 141,6a
  (100) (103,7) (104,4) (98,7) (102,0) (104,0) (99,9) (105,6)
                 
trockenm. (mg) 7,2a 7,5a 7,8a 7,3a 7,0a 7,9a 6,9a 7,4a
  (100) (104,1) (108,3) (101,4) (97,2) (109,7) (95,8) (102,8)

KF - 1%ige Anwendung:

Die Anwendung der KF in 1%iger Konzentration führte ebenfalls zu keiner signifikanten Wirkung auf das Wachstum und die Entwicklung der Tomatensämlinge gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Dennoch konnte bei der Wurzelentwicklung ein negativer Trend beobachtet werden. Hierbei war besonders auffällig, daß auch die KF der logarithmischen Phase tendenziell einen hemmenden Einfluß ausübten.

Die wesentlich geringere Wirkung der KF der stationären Phase im Vergleich zu den entsprechenden Varianten unter axenischen Kulturbedingungen macht den Unterschied beider Testsysteme deutlich. Die Lipopeptide zeigten hier eine wesentlich geringere wuchsinhibierende Wirkung.

Zwischen den Behandlungsvarianten beider Stämme konnten keine Unterschiede festgestellt werden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 dargestellt.


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Tabelle 18: Wirkung der KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G und des Landy-Mediums (LM) auf das Wachstum von Tomatensämlingen bei 1%iger Anwendung nach 10 Tagen in Substratkultur unter Gewächshausbedingungen (n = 5, *n = 8, p le 0,05).

      FZB C FZB G
  Kontr. LM log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph.
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                 
Sproß-                
                 
länge* (cm) 4,6a 4,8a 4,6a 4,8a 4,7a 4,5a 4,3a 4,4a
  (100) (104,3) (100,0) (104,3) (102,2) (97,8) (93,5) (95,7)
               
trockenm. (mg) 23,6a 21,9a 24,2a 23,8a 25,5a 23,7a 21,9a 24,0a
  (100) (92,8) (102,5) (108,7) (108,0) (100,4) (92,8) (101,7)
                 
Wurzel-                
                 
länge (cm) 134,1a 125,8a 119,2a 120,6a 124,6a 123,2a 121,8a 127,7a
  (100) (93,8) (88,9) (89,9) (92,9) (91,5) (90,9) (95,2)
                 
trockenm. (mg) 7,2a 6,8a 6,0a 6,3a 6,2a 6,0a 6,1a 6,6a
  (100) (94,2) (83,3) (88,0) (85,8) (83,3) (84,9) (91,7)

3.2.1.2. Pathogenese

KF - 0,1%ige Anwendung:

Die Behandlung mit den 0,1%igen KF zeigte bei der Pathogenreisolierung aus den Sproßsegmenten nach 3-wöchiger Inokulation keine verringerte Reisolierungsrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Tomatensämlinge aller Varianten zeigten zu diesem Zeitpunkt deutliche Blattvergilbungen. Welkesymptome konnten nicht beobachtet werden. Stammunterschiede wurden nicht festgestellt. Das Ergebnis ist in Abbildung 33 dargestellt.


78

Abbildung 33: Einfluß einer 10-tägigen Vorbehandlung mit den 0,1%igen KF der beiden

B. subtilis-Stämme FZB C und G und dem Landy-Medium (LM) auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse nach 21-tägiger Pathogeninokulation in Substratkultur unter Gewächshausbedingungen (n = 8, p le 0,05).

KF - 1%ige Anwendung:

Die 1%ige KF-Applikation führte bei den Varianten der Übergangs- und der stationären Phase zu einer verringerten Reisolierungsrate des Pathogens aus den Sproßsegmenten des 1. Internodiums und der Sproßspitze. Im Vergleich zur 0,1%igen Anwendung ist hier eine Steigerung der Wirksamkeit erkennbar. Die proportionale Zunahme des Antibiotikagehaltes im Boden dürfte hierfür von wesentlicher Bedeutung sein. Aufgrund der Versuchsmethodik konnte ein direkter Kontakt zwischen den KF und dem Pathogen nicht verhindert werden.

Die Behandlungen mit dem Landy-Medium und den KF der logarithmischen Phase zeigte keine Wirkung auf den Fusarium-Befall.

Das Ergebnis ist in Abbildung 34 dargestellt.


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Abbildung 34: Einfluß der 10-tägigen Vorbehandlung mit den 1%igen KF der beiden

B. subtilis-Stämme FZB C und G und dem Landy-Medium (LM) auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem der Tomatensämlingssprosse nach 21-tägiger Pathogeninokulation in Substratkultur unter Gewächshausbedingungen (n = 8, p le 0,05).

3.2.2. Wirkung der IAA-Vorstufe IPyA

3.2.2.1. Wachstum und Entwicklung

Das Indolderivat IPyA wurde aufgrund der besonders guten Wirksamkeit hinsichtlich der Pathogenunterdrückung in der axenischen Nährlösungskultur auch unter Gewächshausbedingungen in Substratkultur geprüft.

Es konnte keine Beeinflussung der geprüften Wachstumsparameter bei einer der Anwendungskonzentrationen festgestellt werden (Tabelle 19 ). Selbst die in Nährlösungskultur stark phytotoxische Konzentration von 10-4 M führte zu keinen signifikanten Wachstumsdepressionen gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Erst eine Konzentration von 10-3 M führte zu signifikanten Wuchshemmungen, welche mit der 10-4 M Konzentration der axenischen Nährlösungskultur vergleichbar sind.


80

Tabelle 19: Wirkung der IAA-Vorstufe IPyA in verschiedenen molaren Konzentrationen auf das Wachstum von Tomatensämlingen nach 10 Tagen in Substratkultur unter Gewächshausbedingungen (n = 5, *n = 8, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

    Indol-3-ylpyruvatsäure (IPyA)
  Kontr. 10-10 10-8 10-7 10-6 10-4 10-3
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
               
Sproß-              
               
länge* 6,8a 6,9a 6,6a 6,9a 6,5a 6,7a 5,1b
in cm (100) (101,5) (97,1) (100,0) (95,6) (98,5) (75,0)
               
               
trockenm. 46,8a 47,1a 46,5a 45,7a 47,8a 46,4a 21,2b
in mg (100) (100,6) (99,4) (97,7) (102,1) (99,1) (45,3)
               
               
Wurzel-              
               
länge 109,4 107,3a 113,2a 108,7a 109,0a 112,3a 55,8b
in cm (100) (98,1) (104,1) (97,7) (99,6) (102,7) (51,0)
               
               
trockenm. 7,2a 7,0a 7,2a 7,4a 6,9a 7,5a 3,9b
in mg (100) (97,2) (100,0) (102,8) (95,8) (104,2) (54,2)

(Sproßlänge: HSD = 1,3, -trockenmasse: HSD = 16,9, Wurzellänge: HSD = 36,9, -trockenmasse: HSD = 2,9)

3.2.2.2. Pathogenese

Durch die Behandlung der Tomatensämlinge in Substratkultur mit der IAA-Vorstufe IPyA konnte keine Beeinflussung der Pathogenese festgestellt werden. Die sich in der axenischen Nährlösungskultur als äußerst wirksam gezeigten Anwendungskonzentrationen von 10-8 und 10-7 M ließen keine vergleichbare pathogenunterdrückende Wirkung erkennen. Selbst die wuchsinhibierende Konzentration 10-3 M war diesbezüglich wirkungslos.

Das Ergebnis ist in Abbildung 35 dargestellt.


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Abbildung 35: Einfluß der 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der IAA-Vorstufe IPyA auf die Ausbreitung des Pathogens im Leitgefäßsystem nach 21-tägiger Pathogeninokulation in Substratkultur unter Gewächshausbedingungen (n = 8, p le 0,05).

3.3. IAA-Gehalt der Tomatensämlinge

Für die Bestimmung des IAA-Gehaltes der Tomatensämlinge nach 10-tägiger Behandlung mit den entsprechenden Substanzen wurden nur solche Behandlungsvarianten ausgewählt, welche einen positiven Einfluß auf das Wachstum und die Entwicklung sowie die Pflanzengesundheit ausübten. Es wurden folgende unter axenischen Bedingungen kultivierte Varianten analysiert:

Aus versuchstechnischen Gründen war eine Analyse der mit der G3-Fraktion 40%ig vorbehandelten Tomatensämlinge nicht möglich.

Die Wiederfindungsrate der mit Tritium markierten IAA betrug durchschnittl. 75 %.

KF (0,1 %) und die HPLC-Subfraktion G3:

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit den KF des Stammes FZB G führte bei den Varianten der logarithmischen Phase und der Übergangangsphase zu einem Anstieg des IAA-Gehaltes in den Sproßteilen, der jedoch statistisch nicht abgesichert werden konnte. Den


82

höchsten Wert zeigten die mit dem KF der Übergangsphase kultivierten Sämlinge. Die Konzentration der IAA war hier mit 75,7 % gegenüber der Kontrolle erhöht. Die Anwendung des KF der stationären Phase hatte keine Auswirkung auf den IAA-Gehalt.

Tomatensämlinge, die mit der 20%igen HPLC-Subfraktion G3 behandelt wurden, zeigten ebenfalls eine Zunahme an freier IAA.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 36 dargestellt.

Abbildung 36: Wirkung des Kulturfiltrates der logarithmischen, Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G bei 0,1%iger Anwendung und der aus dem KF der Übergangsphase dieses Stammes gewonnenen HPLC-Subfraktion G3 bei 20%iger Anwendung auf den IAA-Gehalt von Tomatensämlingssprossen nach 10-tägiger Kultivierungsdauer in Nährlösung (n = 3, p le 0,05, HSD = 464,9).

IPyA 10-10 - 10-6 M:

Die exogene Zugabe der IAA-Vorstufe IPyA zur Nährlösung führte erwartungsgemäß zu einem Anstieg des endogenen IAA-Gehaltes der Tomatensämlinge. Bei der 10-7 M Anwendung konnte ein über das 3fache erhöhter Gehalt dieses Auxins ermittelt werden, der jedoch bereits in der nächsthöheren Konzentration wieder auf das Niveau der Kontrolle abfiel. Die Sämlingssprosse der Anwendungskonzentration von 10-10 M zeigten mit 380,6 pmol/g FM gegenüber der Kontrolle mit 361,3 pmol/g FM einen nur leicht erhöhten Wert. Die Variante 10-8 M hingegen bewirkte mit 741,8 pmol/g FM einen deutlich höheren Gehalt an IAA, der


83

sich jedoch nicht signifikant von der Kontrolle und der Variante 10-7 M unterscheidet. Das Ergebnis ist in Abbildung 37 dargestellt.

Abbildung 37: Wirkung der IAA-Vorstufe IPyA bei verschiedenen molaren Anwendungskonzentration auf den IAA-Gehalt von Tomatensämlingssprossen nach 10-tägiger Behandlung (n = 3, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05, HSD = 536,4).

3.4. Enzymatische Aktivität

Für die Bestimmung der Enzymaktivitäten wurden nur Behandlungsvarianten ausgewählt, die eine positive Wirkung auf die Pflanzengesundheit hatten. Da sich die beiden B. subtilis-Stämme nicht bedeutend voneinander unterschieden, wurde der Stamm FZB G repräsentativ ausgewählt.

Die Untersuchungen beinhalteten folgende Varianten (1. und 2. Probennahmetermin):


84

3.4.1. Sproß

3.4.1.1. ß-1,3-Glucanase

KF (0,1 %) des Stammes FZB G und die HPLC-Subfraktion G3:

Probennahme:

Nach der 10-tägigen Einwirkung der KF konnte in den Proteinextrakten der Tomatensämlingssprosse ein leichter Anstieg der ß-1,3-Glucanaseaktivität bestimmt werden, wobei die enzymatische Aktivität der stationären Phase-Variante die geringste Erhöhung gegenüber der unbehandelten Kontrolle aufwies. Nur die mit der HPLC-Subfraktion G3 behandelten Tomatensämlinge zeigten eine signifikant erhöhte ß-1,3-Glucanaseaktivität gegenüber der unbehandelten Kontrolle (Abbildung 38 ).

Abbildung 38: Wirkung einer 10-tägigen Behandlung mit den KF des B. subtilis-Stammes FZB G bei 0,1%iger Anwendung und der HPLC-Subfraktion G3 bei 20%iger Anwendung auf die ß-1,3-Glucanaseaktivität von Tomatensämlingssprossen (n = 4, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05, HSD = 39,7).

Probennahme:

Zum Zeitpunkt der 2. Probennahme, also nach 5-tägiger Pathogeninokulation zeigte sich eine weniger deutliche Wirkung als zum 1. Termin. Wenn auch die Varianten der Übergangsphase und der Fraktion G3 in ihrer Aktivität leicht über der infizierten Kontrolle lagen, unterschieden


85

sie sich nicht signifikant von dieser. Lediglich die nicht inokulierte, in verdünntem Czapek-Dox Medium kultivierte Kontrolle unterschied sich signifikant von den übrigen mit Fusarium infizierten Varianten (Abbildung 39). Die ß-1,3-Glucanaseaktivität der Tomatensämlinge war nach der 5-tägigen Pathogeninokulation im Vergleich zur 1. Probennahme deutlich erhöht.

Abbildung 39: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung mit den KF des B. subtilis-Stammes FZB G bei 0,1%iger Anwendung und der Fraktion G3 bei 20%iger Anwendung auf die ß-1,3-Glucanaseaktivität von Tomatensämlingssprossen nach 5-tägiger Fusarium-Inokulation (Kontr.(-) - pathogenfreie Kontrolle, Kontr.(+) - inokulierte Kontrolle, n = 4, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05, HSD = 2,2).

IPyA 10-10 - 10-6 M:

Probennahme:

Zum Zeitpunkt der 1. Probennahme konnte bei den Tomatensämlingen der Variante 10-7 M mit einer rund 60%igen Aktivitätserhöhung gegenüber der unbehandelten Kontrolle eine signifikante Zunahme der ß-1,3-Glucanaseaktivität bestimmt werden. Die Behandlung mit den Konzentrationen 10-10 , 10-8 und 10-6 M zeigte eine geringere bzw. keine Wirksamkeit. Das Ergebnis ist in Abbildung 40 dargestellt.


86

Abbildung 40: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der Auxin-Vorstufe IPyA in verschiedenen molaren Konzentrationen auf die ß-1,3-Glucanaseaktivität des Sprosses (n = 4, p le 0,05, HSD = 42,8).

Probennahme:

Die Aktivität der ß-1,3-Glucanase der Variante 10-7 M unterschied sich nach der 5-tägigen Pathogeninokulation nicht mehr signifikant von den übrigen inokulierten Behandlungsvarianten und der inokulierten Kontrolle. Sie zeigte aber dennoch im Vergleich aller Varianten den höchsten Wert (Abbildung 41).

Abbildung 41: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der Auxin-Vorstufe IPyA in ansteigend molarer Konzentration auf die ß-1,3-Glucanaseaktivität nach 5-tägiger Fusarium-Inokulation (Kontr.(-) - pathogenfreie Kontrolle, Kontr.(+) - inokulierte Kontrolle, n = 4, p le 0,05, HSD = 2,2).


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3.4.1.2. Chitinase und Peroxidase

Die Untersuchungen zur Aktivität des Enzyms Chitinase zeigten bei den KF-Varianten und bei der Fraktions-Variante (G3) zu beiden Probennahmezeitpunkten keine Veränderungen gegenüber der unbehandelten, infizierten Kontrolle. Die Behandlungen mit der IAA-Vorstufe IPyA führten ebenfalls zu keiner statistisch gesicherten Aktivitätsveränderung des Enzyms. Zwischen 1. und 2. Probennahme konnte ein allgemeiner Aktivitätsanstieg beobachtet werden (Tabelle 20).

Auch bei der Peroxidaseaktivität konnten an beiden Terminen keine Unterschiede zu der unbehandelten und mit Pathogen inokulierten Kontrolle festgestellt werden. Erwartungsgemäß wurde zum 2. Termin der Probennahme ebenfalls eine allgemein höhere enzymatische Aktivität gemessen (Tabelle 20).

Tabelle 20: Aktivität der beiden Enzyme Chitinase und Peroxidase nach 10-tägiger Vorkultur (1. Termin) mit den KF des B. subtilis-Stammes FZB G, der HPLC-Subfraktion G3 und der IAA-Vorstufe IPyA und nach 5-tägiger Pathogeninokulation (2. Termin), Kontr.(-) - nicht inokulierte Kontrolle, (+) - inokulierte Kontrolle (n = 4, Werte mit verschiedenen Buchstaben in den Zeilen unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05).

  KF-Varianten
  Kontr.(-) Kontr.(+) log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. G3
Enzymaktivität            
             
Chitinase (DeltaE550/h/mg Prot.) 1.Termin 0,16a / 0,18a 0,16a 0,19a 0,17a
Chitinase (DeltaE550/h/mg Prot.) 2.Termin 0,18a 0,24b 0,22ab 0,24b 0,25b 0,21ab
             
Peroxidase (DeltaE470/min/mg Prot.) 1.T. 0,44a / 0,47a 0,46a 0,49a 0,48a
Peroxidase (DeltaE470/min/mg Prot.) 2.T. 0,75a 1,25b 1,30b 1,35b 1,20b 1,27b
             
  IPyA-Varianten
  Kontr. (-) Kontr. (+) IPyA10-10 IPyA10-8 IPyA10-7 IPyA10-6
             
Chitinase (DeltaE550/h/mg Prot.) 1.Termin 0,12a / 0,14a 0,16a 0,14a 0,13a
Chitinase (DeltaE550/h/mg Prot.) 2.Termin 0,17a 0,26b 0,25b 0,27b 0,23ab 0,24ab
             
Peroxidase (DeltaE470/min/mg Prot.) 1.T. 0,39a / 0,51a 0,45a 0,40a 0,43a
Peroxidase (DeltaE470/min/mg Prot.) 2.T. 0,82a 1,50b 1,30b 1,40b 1,34b 1,57b
             

(KF-Varianten: Chitinase HSD = 0,05, Peroxidase HSD = 0,22, IPyA-Varianten: Chitinase

HSD = 0,07, Peroxidase HSD = 0,3)


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3.4.2. Wurzel

Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Wurzel wurde nur Material des 1. Probennahmetermines verwendet. Am 2. Probennahmetermin zeigten die Wurzeln, bedingt durch die Pathogeninfektion, bereits starke lytische Erscheinungen, die eine weitere Bearbeitung als nicht sinnvoll erschienen ließen.

3.4.2.1. ß-1,3-Glucanase

KF (0,1 %) des Stammes FZB G und die HPLC-Subfraktion G3:

Die Behandlung der Tomatensämlinge mit den KF und der HPLC-Subfraktion G3 führte auch im Wurzelbereich zu keiner statistisch gesicherten veränderten ß-1,3-Glucanase-Aktivität gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Die Enzymaktivitäten lagen auf dem Niveau der Kontrolle. (Ergebnis nicht graphisch dargestellt).

IPyA 10-10 - 10-6 M:

Die Wurzelproben der mit der IAA-Vorstufe IPyA in den Konzentrationen von 10-8 und 10-7 M behandelten Tomatensämlinge zeigten tendenziell eine erhöhte ß-1,3-Glucanase-Aktivität. Eine signifikante Aktivitätserhöhung, wie sie bei den Sproßproben gefunden wurde, konnte nicht ermittelt werden. Die 10-7 M Konzentration zeigte im Vergleich aller Behandlungsvarianten den stärksten Trend einer Aktivitätserhöhung. Das Ergebnis ist in Abbildung 42 dargestellt.


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Abbildung 42: Wirkung einer 10-tägigen Vorbehandlung von Tomatensämlingen mit der Auxin-Vorstufe IPyA in verschiedenen molaren Konzentrationen auf die ß-1,3-Glucanase-Aktivität der Wurzeln (n = 4, p le 0,05).

3.4.2.2. Chitinase und Peroxidase

Die KF des Stammes FZB G, die HPLC-Subfraktion G3 sowie die IPyA-Behandlungen zeigten gegenüber der entsprechenden unbehandelten Kontrolle keine veränderten Enzymaktivitäten (Tabelle 21).

Tabelle 21: Aktivität der beiden Enzyme Chitinase und Peroxidase nach 10-tägiger Vorkultur (1. Termin) mit den KF des B. subtilis-Stammes FZB G, der HPLC-Subfraktion G3 und der IAA-Vorstufe IPyA, Kontr.(-) - nicht inokulierte Kontrolle (n = 4, p le 0,05).

  KF-Varianten
  Kontr.(-) log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph. G3
Enzymaktivität          
           
Chitinase (DeltaE550/h/mg Prot.) 0,19a 0,17a 0,19a 0,16a 0,20a
           
Peroxidase (DeltaE470/min/mg Prot.) 0,51a 0,46a 0,49a 0,46a 0,52a
           
  IPyA-Varianten
  Kontr. (-) IPyA 10 IPyA 10 IPyA 10 IPyA 10
           
Chitinase (DeltaE550/h/mg Prot.) 0,20a 0,20a 0,18a 0,21a 0,19a
           
Peroxidase (DeltaE470/min/mg Prot.) 0,43a 0,48a 0,44a 0,40a 0,43a
           


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3.5. Vergleich der Proteinmuster

3.5.1. SDS-Elektrophorese

Die elektrophoretische Trennung wurde nur mit nicht inokulierten Sproß- und Wurzelextrakten durchgeführt, da das Pathogen selbst bereits eine Veränderung des Proteinmusters der Pflanze bewirkt. Es wurden die gleichen Varianten (1. Probennahmetermin) wie bei der Enzymaktivitätsbestimmung geprüft.

3.5.1.1. Proteinmuster des Sprosses

KF (0,1%) des Stammes FZB G und die HPLC-Subfraktion G3:

Nach der SDS-PAGE der Sproßextrakte konnten zwischen den mit den KF der logarithmischen-, der Übergangs- und der stationären Phase bzw. der HPLC-Subfraktion G3 behandelten Varianten keine Unterschiede in der Anordnung und Ausprägung der Proteinbanden beobachtet werden. Auch die stark pathogenunterdrückende HPLC-Subfraktion G3 zeigte trotz signifikant erhöhter ß-1,3-Glucanaseaktivität keine neuen oder verstärkt akkumulierten Proteinbanden, die auf eine Induktion derartiger PR-Proteine hinweisen könnten (Abbildung 43).

IPyA 10-10 - 10-6 M:

Auch die Behandlung mit Indol-3-pyruvatsäure (IPyA) und hier besonders die Anwendungskonzentration 10-7 M ließ keine Veränderungen im Proteinmuster der Tomatensämlingssprosse erkennen (Abbildung 43).

3.5.1.2. Proteinmuster der Wurzel

Da sich in den Proteinmustern der Sproßextrakte keine Unterschiede erkennen ließen, wurden die Wurzellextrakte elektrophoretisch getrennt, um auch hier mögliche Veränderungen auf der Proteinebene zu untersuchen.


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KF (0,1%) des Stammes FZB G und die HPLC-Subfraktion G3:

Die SDS-Gele der Wurzelextrakte zeigten erwartungsgemäß ein anderes Proteinmuster als die der Sproßextrakte. Es konnten jedoch keine Unterschiede zwischen den Behandlungsvarianten und der unbehandelten Kontrolle festgestellt werden (Abbildung 44).

IPyA 10-10 - 10-6 M:

Die IPyA-Behandlung führte ebenfalls zu keinen erkennbaren Unterschieden in den Proteinmustern der Tomatenwurzelextrakte (Abbildung 44).

Abbildung 43: Proteinbandenmuster von Tomatensämlingssprossen nach der Behandlung mit den KF, der HPLC-Subfraktion G3 und der IAA-Vorstufe IPyA.


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Abbildung 44: Proteinbandenmuster von Tomatensämlingswurzeln nach der Behandlung mit den KF, der HPLC-Subfraktion G3 und der IAA-Vorstufe IPyA.


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3.5.2. 2D - Elektrophorese

Da die Trennung in SDS-Gelen nur nach der Molekülgröße erfolgt, bestand die Möglichkeit, daß bestimmte Proteine mit einer gleichen bzw. sehr ähnlichen Molekülgröße sich in ein und derselben Bande anreichern und somit nicht zu unterscheiden sind. Eine Methode mit einer wesentlich größeren Trennschärfe für Proteine ist die 2-Dimensionale-Elektrophorese. Sie basiert auf der Tatsache, daß jedes Protein in einem elektrischen Feld einen bestimmten Punkt besitzt, an dem seine Nettoladung gleich Null ist, der Isoelektrische Punkt. Da der Isoelektrische Punkt und das Molekulargewicht zwei spezifische Charakteristika eines Proteins darstellen, wird mit der 2D - PAGE eine sehr hohe Trennschärfe erreicht.

Nach dieser Methode erfolgte die Trennung der gleichen Sproßextrakte wie unter 3.5.1.1 dargestellt.

Ein Standard-Proteingemisch (BIO-RAD) wurde unter identischen Bedingungen zur Eichung benutzt.

KF (0,1%) des Stammes FZB C und die Essigsäureethylester-Subfraktion G3:

Der Vergleich der Proteinspotmuster der Extrakte der KF-Varianten und der G3-Variante mit der unbehandelten Kontrolle zeigte auch nach der 2-dimensionalen Trennung keine Veränderungen bzw. Unterschiede, die auf Veränderungen der Proteinbiosynthese hinweisen könnten (Gel nicht dargestellt).

IPyA 10-10 - 10-6 M:

Die 2D-Trennung der mit IPyA behandelten Varianten zeigte bei den Konzentrationen 10-10, 10-8 und 10-6 M keine Veränderungen des Proteinmusters (Gele nicht dargestellt). Bei der Variante 10-7 M konnte jedoch ein deutlich vergrößerter Proteinspot im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle gefunden werden (Abbildung 45, Pfeilmarkierung). Das verstärkt exprimierte Protein besitzt eine Molmasse von ca. 34 kDa und einen Isoelektrischen Punkt (IP) im schwach sauren Bereich (IP 6,3).

Abbildung 45: Gegenüberstellung der Proteinspotmuster von Tomatensämlingssprossen einer unbehandelten Kontrollvariante (links) und einer mit der IAA-Vorstufe IPyA 10-7 M behandelten Variante (rechts). Ein vermutlich verstärkt akkumuliertes Protein ist mit einem Pfeil markiert (ca. 34 kDa, IP ca. 6,3).


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3.6. Direkte Wirkung der Testsubstanzen auf das Pathogen in vitro

3.6.1. KDA-Platten-Test

Die Versuchsmethodik der axenischen Nährlösungskultur der Tomatensämlinge war so angelegt, daß es zu keinem direkten Kontakt zwischen der jeweiligen Testsubstanz und dem Pathogen kommen sollte. Da aber selbst nach einem einmaligen Spülen der behandelten Sämlingswurzeln mit sterilem Aqua dest. nicht völlig auszuschließen ist, daß dennoch geringe Rückstände an den Wurzeln und den Reagenzröhrchen anhaften, wurden alle Testsubstanzen auf eine etwaige direkte antifungale Wirksamkeit untersucht. Trotz des starken Verdünnungs- bzw. Abwaschungseffektes durch die 10-tägige Kulturdauer und die Wurzelspülung wurden die gleichen Konzentrationen wie beim Ansatz der Pflanzentests geprüft. Lediglich bei den Substratversuchen konnte das direkte Zusammentreffen zwischen der Prüfsubstanz und dem Pathogen von vornherein nicht ausgeschlossen werden.

3.6.1.1. bakterielle KF

0,1%ige Anwendung:

Die Prüfung der KF der beiden B. subtilis-Stämme zeigte, daß mit zunehmender Fermentationsdauer auch der Anteil von antibiotisch bzw. antifungal wirksamen Substanzen im KF zunimmt. So hemmten die KF der log-Phase beider Stämme nicht das Myzelwachstum, jedoch aber die KF der Übergangs- und der stationären Phase. Das Landy-Medium übte in der 0,1%igen Konzentration keine Hemmwirkung auf das Pilzwachstum aus (Abbildung 46).


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Abbildung 46: Antifungale Wirkung der 0,1%igen KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G sowie des 0,1%igen Landy-Mediums (LM) auf das Myzelwachstum von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 5-tägiger KDA-Kultur (n = 4, Kontr. = 5,8 cm2, p le 0,05).

1%ige Anwendung:

Bei der 1%igen Anwendung zeigte sich deutlich die antifungale Wirkung der KF der stationären Phase. Beide Stämme hemmten hier signifikant das Myzelwachstum von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici gegenüber der Kontrolle. Erwartungsgemäß konnte auch bei den Varianten der Übergangsphase ein Anstieg der Hemmungsrate ermittelt werden. Die KF der log-Phase beider Stämme führten auch bei dieser Konzentration zu keiner Reduzierung des Pilzwachstums. Das Landy-Medium zeigte jedoch ein um 2,9 % gegenüber der Wasserkontrolle verringertes Myzelwachstum. Das Ergebnis ist in den Abbildungen 47 und 48 dargestellt.

Ein Stammunterschied in der antifungalen Wirksamkeit der KF konnte bei beiden Anwendungskonzentrationen nicht festgestellt werden.


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Abbildung 47: Antifungale Wirkung der 1%igen KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G sowie des 1%igen Landy-Mediums (LM) auf das Myzelwachstum von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 5-tägiger KDA-Kultur (n = 4, Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p le 0,05, Kontr. = 6,1 cm2, HSD = 20,3 %).

Abbildung 48: Antifungale Wirkung der 1%igen KF der Übergangs- und stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G auf das Myzelwachstum von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 5-tägiger KDA-Kultur.


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3.6.1.2. antibiotikafreie bakterielle KF

Von Interesse bei dieser Untersuchung war die Effizienz der durchgeführten Ausfällung der Lipopeptidantibiotika. Die antibiotikafreien KF wurden nur in der 1%igen Konzentration geprüft. Das Landy-Medium wurde einer analogen Ausfällungsprozedur unterzogen und in gleicher Konzentration getestet.

1%ige Anwendung:

Nach der Antibiotikaausfällung reduzierte sich die antifungale Wirkung der 1%igen KF der Übergangsphase auf Null bzw. bei den KF der stationären Phase um ca. 70 %. Die Behandlung mit dem Landy-Medium führte ebenfalls zu keiner Wachstumsverringerung des Pathogens. Die Effizienz der Lipopetidantibiotika-Ausfällung und gleichzeitig der Stellenwert dieser Substanzgruppe für die antifungale Wirkung wird besonders bei den KF der stationären Phase deutlich. Diese unterschieden sich nach der Ausfällung nicht mehr signifikant von der unbehandelten Kontrolle. Die Fungistasis dieser Varianten wurde auf ein Niveau reduziert, das der 0,1%igen Anwendung entspricht. Stammunterschiede konnten nicht festgestellt werden (Abbildung 49).

Abbildung 49: Wirkung der 1%igen KF der beiden B. subtilis-Stämme FZB C und G nach der Ausfällung der Lipopeptidantibiotika sowie des 1%igen, der gleichen Ausfällungsprozedur unterzogenen, Landy-Mediums (LM) auf das Myzelwachstum von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 5-tägiger KDA-Kultur (n = 4, p le 0,05, Kontr. = 5,4 cm2).


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3.6.1.3. Essigsäureethylester-Fraktion des KF und deren HPLC-Subfraktionen

Die Anwendung der Essigsäureethylester-Fraktion (G) deren HPLC-Subfraktionen G1-G6 und der Sub-Subfraktionen von G3 und G5+6 zeigten bei der 20%igen Applikation keine antifungale Wirkung auf das Myzelwachstum von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Bei der 40%igen Konzentration der HPLC-Subfraktionen G3 und G5+6 wurde ebenfalls keine Fungistasis beobachtet (Ergebnis nicht graphisch dargestellt).

3.6.1.4. Phytohormone

Die Prüfung der antifungalen Wirkung der Phytohormone und der IAA-Vorstufe IPyA in dem relevanten Konzentrationsbereich von 10-10 bis 10-4 M führte zu keiner Beeinträchtigung des Myzelwachstums. Bei den Indolderivaten IAA und IPyA konnte sogar eine geringe nicht signifikante Wachstumsbegünstigung festgestellt werden (Tabelle 22).

Tabelle 22: Wirkung der Indolderivate IAA und IPyA in verschiedenen molaren Konzentrationen auf das Myzelwachstum von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 5-tägiger KDA-Kultur (n = 4, p le 0,05).

    Indol-3-ylessigsäure (IAA) Indol-3-ylpyruvatsäure (IPyA)
  Kontr. 10-10 10-8 10-7 10-6 10-4 10-10 10-8 10-7 10-6 10-4
Prüfgröße abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
                       
Myzel- 5,1a 5,1a 5,3a 5,2a 5,4a 5,2a 5,2a 5,4a 5,4a 5,2a 5,1a
wachstum (100) (100,0) (103,9) (102,0) (105,9) (102,0) (102,0) (105,9) (105,9) (102,0) (100,0)
(cm2)                      

3.7. CD-Submerskultur-Test

3.7.1. bakterielle KF

Da die Pathogenanzucht für die Inokulation der Tomatensämlinge in Form einer Submerskultur erfolgte und die Inokulumdichte durch entsprechende Verdünnung des Anzuchtmediums erreicht wurde, sollte auch die Wirkung etwaiger Prüfsubstanzrückstände auf die Pathogenentwicklung unter diesen speziellen Bedingungen untersucht werden. In die


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Untersuchungen wurden nur die KF des B. subtilis-Stammes FZB G einbezogen. Es wurden die Konzentrationen 0,1 und 1 % geprüft.

0,1%ige Anwendung:

Die Kultivierung des Pathogens mit den 0,1%igen KF und den 0,1%igen Landy-Medium zeigte nach 8 Tagen, ähnlich dem KDA-Test, keine signifikante Wirkung auf die Myzeltrockenmasse und die Mikrokonidienproduktion. Dennoch war bei der Variante mit dem KF der stationären Phase die geringste Anzahl gebildeter Mikrokonidien gegenüber der unbehandelten Kontrolle feststellbar (Tabelle 23).

Tabelle 23: Antifungale Wirkung der 0,1%igen KF des B. subtilis-Stammes FZB G sowie des 0,1%igen Landy-Mediums auf das Myzelwachstum und die Mikrokonidienproduktion von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 8-tägiger CD-Submerskultur (n = 4, p le 0,05).

  Kontr. Landy-Medium Kulturfiltrate
Prüfgröße     log-Ph. Ü-Ph. ES-Ph.
  abs. abs. abs. abs. abs.
  (%) (%) (%) (%) (%)
           
Myzel- 16,5a 16,7a 15,8a 17,9a 16,0a
trockenmasse (100) (101,2) (95,8) (108,5) (97,0)
(mg)          
           
Mikrokonidien 2,5x107a 2,3x107a 2,4x107a 2,8x107a 2,2x107a
(Stück/ml) (100) (92,0) (96,0) (112,0) (88,0)

1%ige Anwendung:

Die 1%ige Anwendungskonzentration zeigte bei den Varianten der Übergangs- und der stationären Phase eine deutliche Verringerung der Myzeltrockenmasse und der Mikrokonidienproduktion. Das KF der stationären Phase reduzierte signifikant die Myzeltrockenmasse und die Anzahl der Mikrokonidien. Das Landy-Medium und das KF der logarithmischen Phase bewirkten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle keine Veränderung der geprüften Parameter. Das Ergebnis ist in Abbildung 50 dargestellt.


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Abbildung 50: Wirkung der 1%igen KF des B. subtilis-Stammes FZB G sowie des 1%igen Landy-Mediums (LM) auf die Myzeltrockenmasse (TM) und die Mikrokonodienproduktion (MK) von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 8-tägiger CD-Submerskultur (n = 4, p le 0,05, TM HSD = 15,6 %, MK HSD = 25,7 %).

3.7.1.2. Wirkung der bakteriellen KF auf die Fusarinsäure-Produktion des Pathogens

Aufgrund der Tatsache, daß keine Trennung der Mikrokonidien vom Anzuchtmedium erfolgte und demzufolge im Anzuchtmedium enthaltene Pilzmetaboliten, wenn auch verdünnt, mit an die Pflanzenwurzel gelangten, konnten diese nicht vollständig unberücksichtigt bleiben. Zumal Fusarium spp. als potente Fusarinsäure-Produzenten bekannt sind (DAVIS 1969, SMITH & GRACA SOUSADIAS 1993, BACON et al. 1996).

Es wurden nur Varianten aus der Submerskultur analysiert. Hierbei zeigte sich, daß in allen untersuchten Proben das Phytotoxin Fusarinsäure bei einer Retentionszeit von ca. 13 min detektiert werden konnte. Der Extrakt der Kontrolle enthielt Fusarinsäure in einer Konzentration von 393,8 mg/l (Abbildung 52). Die Varianten mit KF-Zusatz der logarithmischen Phase, der Übergangsphase und der stationären Phase des B. subtilis-Stammes FZB G unterschieden sich mit 397,1, 424,9 bzw. 443,8 mg/l nicht signifikant von der unbehandelten Kontrolle. Auch zwischen den Behandlungen mit den KF konnte im Gegensatz zu den Parametern Myzeltrockenmasse und Mikrokonidienproduktion keine Abnahme des Fusarinsäure-Gehaltes durch den KF-Zusatz festgestellt werden. Selbst das KF der stationären Phase führte, entgegen dem Trend, zu keiner Verringerung der Toxinproduktion des


102

Pathogens (Abbildung 53). In dieser Variante konnte sogar die höchste Konzentration von Fusarinsäure ermittelt werden. Der Pilz ist offensichtlich in der Lage, trotz signifikant reduziertem Myzelwachstum seine Toxinproduktion auf einem weitgehend unveränderten Niveau zu halten.


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Abbildung 51: HPLC-Chromatogramm des Fusarinsäure-Standards.

Abbildung 52: HPLC-Chromatogramm des Extraktes der unbehandelten Kontrolle aus der Submerskultur von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 8-tägiger Kultivierung.

Abbildung 53: HPLC-Chromatogramm des Extraktes aus der Submerskultur von Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici nach 8-tägiger Kultivierung mit 1%igem B. subtilis-KF der stationären Phase.


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