Dorn, Jana : Untersuchungen zu Einzel- und Kombinationswirkungen von ausgewählten anorganischen und organischen Schadstoffen beim Anbau verschiedener Pflanzenarten auf Rieselfeldboden

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Kapitel 3. Material und Methoden

Die nachfolgend beschriebenen Arbeiten waren Teil des Verbundprojektes<1> "Bodenökologische Untersuchungen zur Wirkung und Verteilung von organischen Stoffgruppen (PAK, PCB) in ballungsraumtypischen Ökosystemen" und vom Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie (BMBF) im Förderschwerpunkt "Ökotoxikologie" 1993 bis 1997 finanziert. Versuchsmaterial und angewandte Methoden wurden teilweise vom Projektträger (GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit) bzw. der Projektkoordination (Freie Universität Berlin) vorgegeben oder mit den anderen Teilprojekten abgestimmt.

3.1. Versuchsboden

Für die Untersuchungen wurde ein typischer, sandiger Rieselfeldboden mit geringer Schadstoffbelastung ausgewählt. Er wurde einer seit Mitte der 80iger Jahre stillgelegten und aufgelassenen Rieselfeldfläche aus dem Norden Berlins bis ca. 30 cm Tiefe entnommen und anschließend durch Sieben und Mischen homogenisiert. Dieser Boden mit der Bezeichnung Referenzboden (RefB) diente als Ausgangsboden für die Dotierungen mit den ausgewählten organischen Leitsubstanzen (Benzo(a)pyren [BaP] und 2,2’,5,5’ Tetrachlorbiphenyl [PCB 52 nach Ballschmiter und Zell, 1980]) sowie SM (Cadmium [Cd] und Kupfer [Cu]) bei allen Teilprojekten. Die nach der Homogenisierung ermittelten physikalischen und chemischen Kennwerte von RefB sind in Tab. 6 zusammengefaßt.

Tabelle 6: Physikalische und chemische Kennwerte des Referenzbodens

Referenzboden (RefB)

Sand / Ton / Schluff analog DIN 19683, Teil 2 (Gew. %)

92,6 / 3,1 / 4,3

pH analog DIN ISO 10390

5,3

Corg analog DIN 19684, Teil 2 (Gew. %)

1,7

Nt analog DIN ISO 11261 (Gew. %)

0,2

BaP* (mg/kg TS)

0,1

PCB 52* (mg/kg TS)

0,02

Cd* (mg/kg TS)

4,9

Cu* (mg/kg TS)

61,6

* Bestimmung siehe Abschnitt 3.5. bzw. 3.6.


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3.2. Dotierung des Versuchsbodens

Für die weiter beschriebenen Untersuchungen wurde der Referenzboden (RefB) sowohl einzeln mit BaP, PCB 52, Cd und Cu als auch mit Kombinationen dieser organischen Stoffe und SM jeweils in Höhe der entsprechenden Gehalte eines hochbelasteten Rieselfeldbodens Großbeeren (GB) angereichert (Tab. 7), auf dem schon in früheren Versuchen (Metz und Wilke, 1993) eine geringe Biomassebildung und hohe Schadstoffgehalte bei verschiedenen landwirtschaftlichen Fruchtarten nachgewiesen werden konnten.

Tabelle 7: Bezeichnung und Erläuterung der Versuchsvarianten

Variantenbezeichnung

Anreicherung des Referenzbodens (RefB) mit

RefB

-

RefB + PCB

PCB 52 auf 0,3 mg/kg TS (GB-Wert)

RefB + BaP

BaP auf 0,9 mg/kg TS (GB-Wert)

RefB + Cd

Cd auf 51,5 mg/kg TS (GB-Wert)

RefB + Cu

Cu auf 526 mg/kg TS (GB-Wert)

RefB + Cd, PCB

Cd und PCB 52 auf GB-Werte

RefB + Cu, PCB

Cu und PCB 52 auf GB-Werte

RefB + Cd, BaP

Cd und BaP auf GB-Werte

RefB + Cu, BaP

Cu und BaP auf GB-Werte

RefB + Cd, Cu, PCB

Cd, Cu und PCB 52 auf GB-Werte

RefB + Cd, Cu, BaP

Cd, Cu und BaP auf GB-Werte

RefB + Cd, Cu, PCB, BaP

Cd, Cu, PCB 52 und BaP auf GB-Werte

RefB + Cd, PCB, BaP

Cd, PCB 52 und BaP auf GB-Werte

RefB + Cu, PCB, BaP

Cu, PCB 52 und BaP auf GB-Werte

In einem Speziallabor des Institutes für ökologische Chemie der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft wurde 1 g PCB 52 nach Lösung in Aceton auf 2 kg Quarzsand verteilt, ebenso 4,25 g BaP. Die beiden organischen Wirkstoffe (krebserzeugendes Potential) konnten so über den jeweils erforderlichen Anteil an Quarzsand in die entsprechende Menge RefB eingemischt werden. Die SM wurden in Form leicht löslicher Acetatverbindungen zugegeben, um durch eine aktuell hohe Verfügbarkeit in der Bodenlösung sicht- bzw. meßbare Ein-


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zel- und Kombinationseffekte zu erzielen. Eine homogene Verteilung (analytisch nachgewiesen) der zugeführten Schadstoffe konnte durch den Einsatz eines Betonmischers erreicht werden. Die Herstellung der in Tab. 7 aufgeführten 13 Anreicherungsvarianten von RefB erfolgte nach ein und demselben Fließschema (Abb. 2) analog Reese-Stähler et al. (1995). Entsprechende Arbeitsschutz- und Sicherheitsvorkehrungen (Gesichtsmaske mit Staubfilter, Schutzanzug) wurden getroffen. Pro Anreicherungsvariante mußten 140 kg kontaminierter Boden hergestellt werden.

Abbildung 2: Fließschema der Kontamination

3.3. Bodenbiologische Meßgrößen

Unmittelbar nach der Kontamination sowie nach anschließender dreimonatiger Alterung (Lagerung der Böden im Freien unter Feuchthaltung) wurden bei allen 14 Versuchsvarianten (vgl. Tab. 7) bodenbiologische Parameter wie Kohlendioxidfreisetzung (CO2-Freisetzung


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abgewandelt nach Isermeyer, 1952), Cellulosezersetzung (abgewandelt nach Unger, 1960) und Stickstoffmineralisierung (N-Mineralisierung über colorimetrische Bestimmung nach TGL 25428/03 Anonym, 1987) bestimmt. Außerdem erfolgten Keimversuche unter Anwendung des Keimrollentests (Lampeter, 1982) in modifizierter Form mit Silomais und Sommerroggen zur Vorabeinschätzung des vom kontaminierten Boden ausgehenden Gefährdungspotentials.

3.3.1. Kohlendioxidfreisetzung

In Abwandlung zu der Isermeyer-Methode beschrieben in Alef (1991) wurde das während der Inkubation einer Bodenprobe in einem geschlossenen System in Natronlauge aufgefangene CO2 nicht mit Salzsäure zurücktitriert, sondern mittels Leitfähigkeitsmeßgerät (Microprocessor Conductivity Meter LF 539, Wissenschaftlich Technische Werkstätten) wurde die Änderung der elektrolytischen Leitfähigkeit der Natronlauge nach Reaktion mit dem gebildeten CO2 ermittelt. Diese Leitfähigkeitsänderung ist direkt proportional zur CO2-Konzentration.

3.3.2. Cellulosezersetzung

Zur Bestimmung der Cellulosezersetzung im Labor (beschrieben in Fiedler, 1973) wurde eine Petrischale mit einer Bodenprobe bis zur Hälfte gefüllt. Auf diesen Boden kam ein bei 105 °C vorgetrockneter und ausgewogener Rundfilter (_ 9 cm), der sich zwischen zwei Gazescheiben befand. Der Rundfilter wurde mit einer lockeren Bodenschicht abgedeckt und nach einer Bebrütungsdauer von 21 Tagen bei 25 °C im Klimaschrank wurde die Filterpapierscheibe aus der Schale genommen, bei 105 °C getrocknet und gewogen und somit die Menge an unzersetzt gebliebener Cellulose bestimmt.

3.3.3. Stickstoffmineralisierung

Die Bestimmung von Nitrat-N (NO3-N) und Ammonium-N (NH4-N) im Prozeß der N-Mineralisierung (Nmin) erfolgte nebeneinander im 1 N KCl-Bodenauszug (20 g Boden / 100 ml Lösung) am kontinuierlichen Analysenautomaten (ADM 300, Vierkanalsystem, Methodenblatt vom 14.9.79 des VEB MLW Prüfgeräte-Werk Medingen). Die NH4-N-Bestimmung beruht dabei auf der Indophenolblaumethode, wobei NH4-Ionen mit Salicylat in Gegenwart von Natriumhypochlorid zu einer blaugefärbten Indophenylverbindung reagieren. Die Nitratbestim-


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mung erfolgt durch Reduktion des NO3- mittels Hydrazin zu NO2-, das in saurer Lösung mit Naphthylamin zu einem roten Azofarbstoff umgesetzt wird. Am ADM 300 war eine kontinuierliche automatische Analyse von der Probennahme über die Reaktion und das Durchflußcalorimeter bis hin zur Registrierung der Meßwerte möglich.

3.3.4. Keimrollentest

Beim Keimrollentest wurden Filterpapierstreifen (60 cm Länge und 20 cm Breite bei Sommerroggen bzw. 60 cm Länge und 30 cm Breite bei Silomais) mit einem wäßrigen Bodenauszug (Boden : Lösungsverhältnis = 1 : 1; 30 min schütteln; 24 h stehen lassen) befeuchtet. Anschließend erfolgte darauf die Verteilung von 25 Körnern Sommerroggen bzw. 20 Körnern Silomais 5 cm von der Oberkante, mit dem Embryo nach unten zeigend. Die Körner wurden mit einem 5 cm breiten, ebenfalls angefeuchteten Filterpapierstreifen abgedeckt. Der untere Teil der Keimrolle erhielt noch einen Folienstreifen, um nach dem Zusammenrollen auf ca. 4 cm Durchmesser ein seitliches Durchwachsen der Wurzeln zu verhindern. Diese Rolle kam in eine Polyethylentüte und dazu noch ca. 2 ml vom wäßrigen Bodenauszug. Die Lagerung der Keimrollen erfolgte in einem Klimaschrank bei 20 °C. Wichtig war hierbei eine mehrmalige Feuchtekontrolle. Die Auswertung der Rollen erfolgte erstmals nach 4 und dann nach 8 Tagen. Die längste Wurzel (Hauptwurzel) bzw. die Nebenwurzeln wurden gemessen bzw. gezählt.

3.4. Durchführung der Pflanzentests

Nach Einfüllen des vorbereiteten Bodens in Mitscherlichgefäße (6 kg Boden/Gefäß) wurden Roggen (Secale cereale) und Mais (Zea mays) jeweils dreijährig (1994-1996) sowie Kartoffeln (Solanum tuberosum) zweijährig (1994-1995) auf den 14 Versuchsvarianten (Tab. 7) mit je 4 Wiederholungen geprüft (Anzahl Pflanzen/Gefäß: Roggen = 15, Kartoffeln = 1 und Mais = 4) .

Parallel liefen Gefäße, in denen die Pflanzen auf dem kombiniert hochbelasteten Rieselfeldboden GB (Schadstoffgehalte waren Zielgrößen der Aufdotierung von RefB) und einem unbelasteten Vergleichsboden mit der Bezeichnung NB untersucht wurden. Diese dienten aber nur als indirekter Vergleich hinsichtlich Ertragsbildung und Schadstoffaufnahme der Pflanzen, aufgrund der verschiedenen physikalischen und chemischen Bodenparameter von GB und NB (Tab. 8) gegenüber RefB (Tab. 6) und dessen Anreicherungsvarianten.


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Tabelle 8: Physikalische und chemische Kennwerte des hochbelasteten Rieselfeldbodens GB und des unbelasteten Vergleichsbodens NB

gewertet.-->

GB

NB

Sand / Ton / Schluff analog DIN 19683, Teil 2 (Gew. %)

79,6 / 7,2 / 13,2

81,9 / 5,6 / 12,5

pH analog DIN ISO 10390

4,9

5,0

Corg analog DIN 19684, Teil 2 (Gew. %)

7,1

0,8

Nt analog DIN ISO 11261 (Gew. %)

0,7

0,1

BaP* (mg/kg TS)

0,9

0,1

PCB 52* (mg/kg TS)

0,3

< 0,01

Cd* (mg/kg TS)

51,5

< 1,0

Cu* (mg/kg TS)

526,0

24,6

* Bestimmung siehe Abschnitt 3.5. bzw. 3.6.

Die verwendeten Pflanzensorten sowie die Aussaat- bzw. Erntetermine in den drei Versuchsjahren sind in Tab. 9 aufgeführt.

Tabelle 9: Versuchspflanzen, Sorten und Aussaat- bzw. Erntetermine im Versuch

gewertet.-->

Pflanzenart

Sorte

Aussaat

Ernte

Versuchsjahr 1994

Sommerroggen

Sorom

22.03.94

02.08.94

Mais

LG 24.30 (FAO 350)

27.04.94

05.09.94

Kartoffel

Ponto

20.04.94

08.08.94

Versuchsjahr 1995

Winterroggen

Borellus

29.09.94

17.07.95

Mais

LG 24.30 (FAO 350)

02.05.95

29.08.95

Kartoffel

Solar

03.04.95

02.08.95

Versuchsjahr 1996

Winterroggen

Borellus

04.10.95

05.08.96

Mais

LG 24.30 (FAO 350)

29.04.96

26.08.96

Als Düngergaben erhielten die Gefäße einheitlich 1 g N (als NH4NO3), 0,5 g P (als KH2PO4) und 1 g K (teils in KH2PO4 enthalten, Rest als K2SO4). Der GB-Boden bildete hier eine Ausnahme mit der Hälfte Stickstoffdüngung und ohne Phosphorgabe aufgrund seiner hohen Ausgangsgehalte (Pges im Boden GB = 0,4 Gew. %; im Boden RefB = 0,2 Gew. %). Die N-Gabe war in Grund- und Kopfdüngung geteilt. Die N-Kopfdüngung erfolgte nach der Bestockung


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des Getreides bzw. nach 20 cm Wuchshöhe der beiden anderen Versuchspflanzen. Die Feuchteversorgung war für alle Varianten im Versuch konstant (etwa 60 % der Wasserkapazität).

Bei der Ernte der Versuchspflanzen (Termine Tab. 9) erfolgte zunächst eine Trennung in oberirdische und unterirdische Biomasse. Die Wurzeln bzw. Knollen (nicht geschält) wurden mechanisch gereinigt, gründlich gewaschen, ausgewogen und dann grob zerkleinert. Das Kartoffelkraut mußte vor dem Wiegen nicht mehr gereinigt, dafür aber zerkleinert werden. Die oberirdische Biomasse von Roggen bzw. Mais konnte nach ihrer Aufteilung in die einzelnen Pflanzenorgane (Stroh, Korn bzw. Stengel, Blatt, Kolben) und anschließender Grobzerkleinerung, für die Ertragsbestimmung ausgewogen werden. Für den Roggensproß wurden vorher noch Bestandesbonituren (Wuchshöhe und Kornzahl je Ähre) vorgenommen.

Zur Analytik der organischen Schadstoffe in einem Fremdlabor (siehe Abschnitt 3.6.) mußte das Probenmaterial zwischenzeitlich bei -18 °C eingefroren werden. Für die SM-Bestimmung wurden die grobzerkleinerten Wurzeln bzw. Knollen sowie das Kartoffelkraut und die oberirdischen Pflanzenteile von Roggen und Mais bei 60 °C vorgetrocknet, mit einer Schwingscheibenmühle gemahlen und anschließend bei 105 °C für die Trockensubstanzbestimmung getrocknet.

3.5. Bestimmung der Schwermetallgehalte in Boden- und Pflanzenmaterial

Zum Zeitpunkt des Füllens der Gefäße (d.h. vor der 1. Aussaat) und dann immer jeweils vor der nächsten darauffolgenden Vegetationsperiode wurden die mobilen und leicht nachlieferbaren SM-Anteile im Boden der Versuchsvarianten durch stufenweise Extraktion mit 1M NH4NO3 und 1 M NH4-Acetat (Boden : Lösungsverhältnis von 1 : 2,5) nach Zeien und Brümmer (1989) erfaßt. Der erste Extraktionsschritt ist analog DIN 19730.

Auf eine Bestimmung der königswasserlöslichen SM-Gesamtgehalte gemäß DIN ISO 11466 im Boden nach einjähriger Vegetation konnte verzichtet werden, da während dieses Zeitraumes der SM-Entzug durch Pflanzen so gering war, daß eine Veränderung im Boden unter Berücksichtigung der durch Probennahme und -aufbereitung sowie durch die Analytik verursachten Streuung, meßtechnisch nicht erfaßbar gewesen wäre, nur der SM-Gesamtgehalt im Boden nach dreijähriger bzw. bei Kartoffeln nach zweijähriger Versuchsdurchführung wurde ermittelt.

Mit den Untersuchungen der einzelnen Pflanzenorgane auf SM (2 g Pflanzenmaterial nach


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trockener Veraschung bei 380 °C im Muffelofen mit 20 ml 1M HNO3 aufgeschlossen) konnte deren Transfer und Lokalisierung organspezifisch zum Zeitpunkt der Ernte erfaßt werden.

Die SM-Bestimmung in den jeweiligen Extraktions- bzw. Aufschlußlösungen erfolgte mittels AAS-Flammentechnik (Gerät: Perkin Elmer). Die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen sind in Tab. 10 aufgeführt.

Tabelle 10: Bestimmungs- und Nachweisgrenzen für Cadmium und Kupfer mit Flammen-AAS

gewertet.-->

Bestimmungsgrenze (mg/kg TS)

Nachweisgrenze (mg/kg TS)

Cd in Boden / Pflanze

1,0 / 1,5

0,5 / 1,0

Cu in Boden / Pflanze

1,0 / 1,5

0,5 / 1,0

3.6. Bestimmung der PCB 52- und BaP-Gehalte in Boden- und Pflanzenmaterial

Die organischen Schadstoffe in den Boden- und Pflanzenproben wurden am Institut für Landschaftsbau der Technischen Universität Berlin bestimmt. In Abb. 3 ist das Analysenschema hierfür dargestellt.

Abbildung 3: Schema der Bestimmung von PCB und PAK in Boden- und Pflanzenmaterial


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Die pflanzenart- und pflanzenorganspezifischen Bestimmungs- und Nachweisgrenzen für BaP und PCB 52 sind in Tab. 11 aufgeführt.

Tabelle 11: Bestimmungs- und Nachweisgrenzen für die organischen Stoffe

gewertet.--> gewertet.-->

Bestimmungsgrenze (µg/kg TS)

Nachweisgrenze (µg/kg TS)

PCB 52

im Boden

5

1,2

in Wurzel / Knolle

10

1,8

im Stroh / Stengel

10

1,2

im Blatt / Kraut

5

2,5

im Kolben

5

1,7

im Korn

5

0,5

BaP

im Boden

50

0,9

in Wurzel / Knolle

25

1,4

im Stroh / Stengel

10

0,9

im Blatt / Kraut

10

1,9

im Kolben

10

1,2

im Korn

10

0,4

3.7. Durchführung des pH-Versuchs

Da die Versuchspflanze Kartoffel im 3. Jahr nicht mehr geprüft wurde (aufgrund zu geringer Biomassebildung auf vielen Versuchsvarianten) standen die Gefäße für die Untersuchung des pH-Einflusses zur Verfügung. Der Boden wurde einer Aufkalkung unterzogen (erforderliche Menge CaCO3 unter Mischen zugeführt) und so der pH-Wert bei ausgewählten Versuchsvarianten (nähere Erläuterung hierzu siehe Ergebnisabschnitt 4.5.) von 5,3 auf 7,0 erhöht. Anschließend konnte durch die Aussaat von Winterroggen (Sorte Borellus) auf den Aufkalkungsvarianten parallel zu den ungekalkten Varianten im Versuch (3. Vegetationsjahr), ein Vergleich hinsichtlich SM-Verfügbarkeit für Pflanzen im Boden, Ertrag und SM-Aufnahme von Pflanzen gezogen werden.

3.8. Freilandbeprobungen

Zur Überprüfung der Ergebnisse hinsichtlich Schadstoffgehalte der Pflanzen aus den Gefäßversuchen wurden Boden- und Pflanzenproben von Rieselfeldflächen eingeholt. Die beiden be-


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zugsrelevanten Flächen waren dabei einmal die schwachbelastete Rieselfläche, von der der Versuchsboden RefB entnommen wurde und die hochbelastete Rieselfläche GB, deren Schadstoffgehalte als Zielgrößen für die Aufdotierungen von RefB dienten.

Von der RefB-Fläche wurde die dort dominante Quecke mit Boden und von der GB-Fläche Weizen mit Boden entnommen. Die Bodenbeprobung erfolgte mittels Bohrstock in ca. 30 cm Tiefe. Die Pflanzen wurden mit einem Spaten bis zu einer Tiefe von 25 cm ausgegraben und dann der an den Wurzeln haftende Boden abgeschüttelt. Anschließend konnte die Quecke und der Weizen in oberirdische und unterirdische Biomasse zerlegt werden.

Die Wurzeln wurden mechanisch gereinigt sowie gründlich gewaschen und anschließend wie auch der Sproß von Quecke und Weizen analog den Proben aus den Gefäßversuchen zur SM-, PCB 52- bzw. BaP-Analytik vorbereitet (vgl. mit Abschnitt 3.4.).

3.9. Statistische Bewertung der Daten

Bei der Auswertung der gewonnenen Daten zu bodenbiologischen Parametern, Biomasseerträgen und Schwermetallgehalten der Pflanzen wurden Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsvarianten mit dem multiplen t-Test bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % und 1 % auf Signifikanz geprüft. Signifikante Unterschiede sind entweder mit x, xx bzw. y, yy (bei 5 %, 1 %) gekennzeichnet oder die Grenzdifferenz LSD 0,05 und LSD 0,01 ist aufgeführt.


Fußnoten:
<1>

Zusammenarbeit der Biologischen Bundesanstalt Berlin, der Freien Universität Berlin, der Humboldt Universität zu Berlin, der Rheinisch-Westfälisch Technischen Hochschule-Aachen und der Technischen Universität Berlin


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