Anhang A. Anhang

Verwendete Materialien und Geräte

Tab. 13 Nährstoffkonzentrationen der in vitro-Kultur von Musa sp (Vuylsteke 1989, Sigma 1994, Okole 1995)

Substanz	Einheit	Murashige und Skoog				Schenk und Hildebrandt
Makronährstoffe		Multiplikation		Regeneration	Hardening	Kallus
NH4	mM	10,3		10,3	5,7	2,6
K	mM	10,0		10,0	5,0	24,7
Mg	mM	0,75		0,75	0,38	1,6
Ca	mM	1,5		1,5	0,75	1,4
Na	mM	0,1		0,1	0,05	0,1
NO3	mM	19,7		19,7	9,85	24,7
PO4	mM	0,63		0,63	0,32	2,6
SO4	mM	0,85		0,85	0,43	1,7
Cl	mM	3,0		3,0	1,5	2,7
Mikronährstoffe
B	µM	100,0		100,0	50,0	81,0
Co	µM	0,1		0,1	0,05	0,1
Cu	µM	0,1		0,1	0,05	0,08
Fe	µM	100,0		100,0	50,0	47,0
J	µM	5,0		5,0	2,5	6,0
Mn	µM	100,0		100,0	50,0	59,0
Mo	µM	1,0		1,0	0,5	0,41
Zn	µM	30,0		30,0	15,0	3,5
Vitamine und Aminosäuren		(V)*	(O)*
Glycin	mM	0,026	0,026	0,026	0,026	0,026
Pyridoxin	mM	0,003	0,003	0,003	0,003	0,003
Nikotinsäure	mM	0,004	0,004	0,004	0,004	0,004
Thiamin HCl	mM	0,15	0,15	0,15	0,15
Myo-Inositol	mM	0,55	0,55	0,55	0,0	0,55
Ca-Panthothenat	µM		0,042
p-Aminobenzoesre	µM		0,007
Folsäure	µM		0,014
Riboflavin	µM		0,013
Cyanocobalamin	µM		0,006
Wuchsstoffe
BAP	µM	20,0		0,1	0,0	0,0
IAA	µM	100,0		0,0	0,0	10,0
NAA	µM	0,0		100,0	0,0	0,0
Dicamba	µM	0,0		0,0	0,0	20,0
Antioxidans
Ascorbinsäure	mM	0,28		0,28	0,28	0,28
Kohlenstoffquelle
Saccharose	mM	87,71		87,71	43,86	87,71
Geliermittel
Gelrit	g l-1	2,25		2,25	2,25	2,25

*Zusammensetzung der Vitamine nach Vuylsteke (1989) bzw. Okole (1995)

Tab. 14 Nährstoffkonzentrationen der in vitro-Kultur von Mf (Nirenberg 1976, Pinkerton und Strobel 1976)

Substanz	Einheit	H2O	SNA	PDA	GPA	M-1-D	Musa
Makronährstoffe
KHPO4	mM		7,4
Ca (NO3)2	mM					1,2
KNO3	mM		9,9			0,79
KCl	mM		6,71			0,87
MgSO4	mM		4,16			3,0
NaH2PO4	mM					0,14
NH4-Tartrat	mM					27,1
Mikronährstoffe
FeCl3	µM					7,4
MnSO4	µM					30,0
ZnSO4	µM					8,7
H3BO3	µM					2,2
KJ	µM					4,5
Kohlenstoffquellen
Glucose	mM		1,11		110,9
Saccharose	mM		0,58			87,71
Sonstige Zusatzstoffe
Myo-Inositol	mM					2,77
Thiamin	mM					0,74
PD-Broth	g l-1			12,0
Pepton	g l-1				5,0
Bananenblatt	g FW l-1						1000,0
Kokoswasser	ml l-1					12,0
Geliermittel
Gelrite	g l-1	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0	15,0

Tab. 15 Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung	Zulieferer	Eigenschaften
SPE-Kartuschen	Varian Bond-Elut Sep-Pak	Aminopropyl NH1210-2014, 100 mg Cyanopropyl CN 1210-2008, 100 mg Octadecyl C18-OH1210-2065, 100 mg Silica, 500 mg
Filterpapier	Schleicher und Schüll Sartorius Faust	Faltenfilter 595½, f 150 mm, F* 160 s Faltenfilter 2048½, f 38.5 cm, F* 135 s Membranfilter aus reg. Zellulose RC 58, f 13 mm, Porengröße 0.2 µm Membranfilter aus Polyamid, f 45 mm, Porengröße 0.2 µm Sterilfilter aus Zellulosemischester, Porengröße 0.22 µm
HPLC-Säule	Muder und Wochele	Nucleosil 100 C 18, 5 µm
HPLC-Vorsäule	Muder und Wochele	Nucleosil 100 C 18, 5 µm
Zentrifugen-Ultrafilter	Restek	molekularer Cut-off: 100´000 Da

*Filtrationszeit nach Herzberg

Tab. 16 Chemikalien und Substrate

Common name	Systematischer o. alternativer Name	Zulieferer
BAP	6-Benzylaminopurin	Sigma B 9395
BSA	bovines Serumalbumin, Fraktion V	Merck 1.12018
Chlortetracyclin-Hydrochlorid		Sigma C-4881
Coomassie Brilliantblau G 250		Merck 1.02082
Bentonit	enth. >50% Monmorillonit, >15% Illit	Neudorff
Dicamba	3,6-Dichlor-2-Methoxybenzoesäure	Serva 19320
D-Phenylalanin	D-2-Amino-3-Phenylpropionsäure	Sigma P1751
1,5-Dihydroxynaphtalin	1,5-Naphtalindiol	Aldrich D 11,560-6
Einheitserde	ED 73	Gebr. Patzer GmbH
Evans Blue	Direct Blue 53	Sigma E 2129
Gelrite		Duchefa G 1101
Glycin	Aminoessigsäure	Sigma G 6143
Hakaphos Blau	Standardnährsalz 15-10-15-2
Kalilauge	KOH	Merck 5021
IAA	Indol-3-Essigsäure	Sigma I 2886
Juglon	5-Hydroxy-1,4-Naphtochinon	Sigma J 0500
Kanamycin A		Sigma K 4000
Kaliumdihydrogenphosphat	KH2PO4 purum p.a.	Fluka 60230
NAA	-Naphtalenessigsäure	Sigma N 0640
Natriumchlorid	NaCl 99.5%	Heraeus 007010
Natriumhypochlorid	NaOCl 12% Cl	Roth 9062.1
Natronlauge	NaOH 1N	Merck 9956
L-Phenylalanin	L-2-Amino-3-Phenylpropionsäure	Sigma P 2126
2-Mercaptoethanol		Merck 805740
Myo-Inositol		Serva 26310
Ortho-Phosphorsäure	H3PO4 85%	VEB-Chemie Apolda
Penicillin G	Benzylpenicillin (Natriumsalz)	Sigma
Polyvinylpolypyrrolidon	PVPP	Sigma P 6755
Saccharose		Serva 35580
Schwefelsäure 95 - 97%	H2SO4 p.a.	Merck 1.00731
Streptomycinsulfat		Sigma S-6501
Thiamin-HCl	Vitamin B1	Serva 36020
trans-Zimtsäure	3-Phenylpropionsäure	Sigma C 6004
Tricyclazol®	5-Methyl-1,2,4-triazolo(3,4-b)Benzothiazol	Dow Elanco
Tween 80		Difco 3118-15-6
Lösungsmittel
Acetonitril HPLC-rein		Baker 0917
Chloroform p.a.		Merck 7386
Diethylether z.A.		Merck 1.00921
Essigsäureanhydrid z.A.		HUB-Chemie
Ethanol unverg.		HUB-Chemie
Ethylacetat p.a.		Merck 8037
Methanol p.a.		Merck 1.06009
n-Hexan p.a.		Merck 1.04367
Wasser HPLC-rein		Baker 4218

Tab. 17 Geräte

Bezeichnung	Zulieferer und Typenbez.	Eigenschaften
Festphasenextraktion	Baker spe-12G Nr. 7018-94	12 Positionen
HPLC -Pumpen	Irica 871	Doppelkolbensystem
-Entgasung	Erma CR Inc./ERC-3512	Online
-UV/Vis-Detektor	BarSpec Chrom-A-Scope No. 1970	190-370nm (Deuterium) 360-700nm (Halogen)
-Säulenofen	MTS Ingenieurbüro HA 2030	22-45°C, Wasserkühlung
-Probenaufgabeventil	Rheodyne 7125	Probenschleife 20 µl
-Mischkammer	ERC	für Hochdruckgradient
-Steuersystem	BarSpec Data System Version 1.2
-Säule mit Vorsäulenkartusche	Muder und Wochele	ID 250 (+10) x 4,0 mm
Inkubationsschüttler	Bühler SM 25 digi Inkubationshaube TH 25	Beleuchtung 15 W
Kühlbrutschränke	Rubarth Apparate GmbH	Beleuchtung 2 x 20 W
Kühlzentrifuge mit Ausschwingrotor	Jouen GR 20 22	max. 8150 g, min. 4°C
Mikroskopkamera	Zeiss Jena 100
Pflanzenwuchsschrank	Heraeus-Vötsch HPS 1500	max. 400 µEinstein m-2s-1 max. 70% RH bei 25°C
pH-Meter mit Elektrode	Orion Research 701A Mettler Toledo InLab 422	digital, pH .001 pH 0-14, 0-80°C
Präzisionswaage	Sartorius 2002 MP1	d=0.1 mg
Rotationsverdampfer -Vakuumsystem -Wasserbad -Senkrechtkühler -Diagonalkühler mit Auto-Hub	Büchi B-172, B-173, KVW-Technik 800 Büchi B-480, Heidolph WB 2000 Büchi Heidolph VV 2000
Spektralphotometer -Küvettenwechsler 12x -UV-Küvetten -Inkubationsbad	Kontron 922 Kontron 900 Hellma 104-QS, Halbmikro LKB 2219	190 - 900 nm 2 x 6
Stereomikroskop SV8	Zeiss Jena	Vergrößerung 8 - 64x
Trockenschrank	Memmert UM 500
Ultra-Turrax mit Dispergierwerkzeug	T 25 S25N-18G	24000 rpm
Universalmikroskop Axioplan	Zeiss Jena	Vergrößerung 25 - 1000x
Vakuumfiltration mit Membranfilter	Schleicher und Schüll Sartorius	1000 ml
Vertikalstrombank	Steag LF-RF 06.15	1500 m³ h-1

Methoden

Tab. 18 TL-chromatographische Systeme

	System A (Stierle et al 1991)	System B (Keen 1978)	System C (Luis et al 1993)	System D (Singh et al 1969)
Mobile Phase	CHCl3:MeOH 9:1	Hexan:EtOAc:MeOH 60:40:1	Et2O:Hexan 3:1	Et2O
Entwicklungszeit (min)	90	90	75	12
Probenaufgabe (µl)	--------------------------------------------------10 ----------------------------------------------
Stationäre Phase	-------------------------------------Silica 60 F254, 20 x 20 cm---------------------------------
Entwicklung	Vertikalkammer, eindimensional, H2SO4 (5.0% in EtOH), Trocknung 110°C

Tab. 19 HPL-chromatographische Systeme

	System A (Greenblatt und Wheeler 1986)	Sytem B (Edwards und Kessmann 1992)
Mobile Phase	MeCN:50 mM KH2PO4 13.4 - 43.5% in 18 min, 1.2 ml min-1	MeCN:50 mM KH2PO4 15 - 65% in 45 min, 0.8 ml min-1
Detektion (nm)	254	280
Probenaufgabe	Rheodyne, 20 µl Probenschleife
Stationäre Phase	C 18 Nucleosil, 250 x 4 cm, 5 µm ODS, Vorsäule 10 x 4 cm, Säulentemperatur 32°C

Abb. 45 Material und Methoden der Gewinnung von Sekundärmetaboliten aus Mf-Flüssigkulturen (A, dicke schwarze Pfeile), Applikation von pilzlichen Substanzen auf Blattgewebe verschiedener Musa cv (B, dünne schwarze Pfeile) und Nutzung pflanzlicher Extrakte zur Inkubation des Pilzes (C, farbige durchgezogene Pfeile)

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