Hoß, Reinhart: Untersuchungen zur Funktion und Spezifität pilzlicher Sekundärmetaboliten im Pathosystem ”Schwarze Sigatokakrankheit“ der Banane (Musa sp - Mycosphaerella fijiensis)

Anhang A. Anhang

Verwendete Materialien und Geräte

Tab. 13 Nährstoffkonzentrationen der in vitro-Kultur von Musa sp (Vuylsteke 1989, Sigma 1994, Okole 1995)

Substanz

Einheit

Murashige und Skoog

Schenk und Hildebrandt

Makronährstoffe

Multiplikation

Regeneration

Hardening

Kallus

NH4

mM

10,3

10,3

5,7

2,6

K

mM

10,0

10,0

5,0

24,7

Mg

mM

0,75

0,75

0,38

1,6

Ca

mM

1,5

1,5

0,75

1,4

Na

mM

0,1

0,1

0,05

0,1

NO3

mM

19,7

19,7

9,85

24,7

PO4

mM

0,63

0,63

0,32

2,6

SO4

mM

0,85

0,85

0,43

1,7

Cl

mM

3,0

3,0

1,5

2,7

Mikronährstoffe

B

µM

100,0

100,0

50,0

81,0

Co

µM

0,1

0,1

0,05

0,1

Cu

µM

0,1

0,1

0,05

0,08

Fe

µM

100,0

100,0

50,0

47,0

J

µM

5,0

5,0

2,5

6,0

Mn

µM

100,0

100,0

50,0

59,0

Mo

µM

1,0

1,0

0,5

0,41

Zn

µM

30,0

30,0

15,0

3,5

Vitamine und Aminosäuren

(V)*

(O)*

Glycin

mM

0,026

0,026

0,026

0,026

0,026

Pyridoxin

mM

0,003

0,003

0,003

0,003

0,003

Nikotinsäure

mM

0,004

0,004

0,004

0,004

0,004

Thiamin HCl

mM

0,15

0,15

0,15

0,15

Myo-Inositol

mM

0,55

0,55

0,55

0,0

0,55

Ca-Panthothenat

µM

0,042

p-Aminobenzoesre

µM

0,007

Folsäure

µM

0,014

Riboflavin

µM

0,013

Cyanocobalamin

µM

0,006

Wuchsstoffe

BAP

µM

20,0

0,1

0,0

0,0

IAA

µM

100,0

0,0

0,0

10,0

NAA

µM

0,0

100,0

0,0

0,0

Dicamba

µM

0,0

0,0

0,0

20,0

Antioxidans

Ascorbinsäure

mM

0,28

0,28

0,28

0,28

Kohlenstoffquelle

Saccharose

mM

87,71

87,71

43,86

87,71

Geliermittel

Gelrit

g l-1

2,25

2,25

2,25

2,25

*Zusammensetzung der Vitamine nach Vuylsteke (1989) bzw. Okole (1995)

Tab. 14 Nährstoffkonzentrationen der in vitro-Kultur von Mf (Nirenberg 1976, Pinkerton und Strobel 1976)

Substanz

Einheit

H2O

SNA

PDA

GPA

M-1-D

Musa

Makronährstoffe

KHPO4

mM

7,4

Ca (NO3)2

mM

1,2

KNO3

mM

9,9

0,79

KCl

mM

6,71

0,87

MgSO4

mM

4,16

3,0

NaH2PO4

mM

0,14

NH4-Tartrat

mM

27,1

Mikronährstoffe

FeCl3

µM

7,4

MnSO4

µM

30,0

ZnSO4

µM

8,7

H3BO3

µM

2,2

KJ

µM

4,5

Kohlenstoffquellen

Glucose

mM

1,11

110,9

Saccharose

mM

0,58

87,71

Sonstige Zusatzstoffe

Myo-Inositol

mM

2,77

Thiamin

mM

0,74

PD-Broth

g l-1

12,0

Pepton

g l-1

5,0

Bananenblatt

g FW l-1

1000,0

Kokoswasser

ml l-1

12,0

Geliermittel

Gelrite

g l-1

15,0

15,0

15,0

15,0

15,0

15,0

Tab. 15 Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung

Zulieferer

Eigenschaften

SPE-Kartuschen

Varian Bond-Elut

Sep-Pak

Aminopropyl NH1210-2014, 100 mg

Cyanopropyl CN 1210-2008, 100 mg

Octadecyl C18-OH1210-2065, 100 mg

Silica, 500 mg

Filterpapier

Schleicher und Schüll

Sartorius

Faust

Faltenfilter 595½, f 150 mm, F* 160 s

Faltenfilter 2048½, f 38.5 cm, F* 135 s

Membranfilter aus reg. Zellulose RC 58, f 13 mm, Porengröße 0.2 µm

Membranfilter aus Polyamid, f 45 mm, Porengröße 0.2 µm

Sterilfilter aus Zellulosemischester, Porengröße 0.22 µm

HPLC-Säule

Muder und Wochele

Nucleosil 100 C 18, 5 µm

HPLC-Vorsäule

Muder und Wochele

Nucleosil 100 C 18, 5 µm

Zentrifugen-Ultrafilter

Restek

molekularer Cut-off: 100´000 Da

*Filtrationszeit nach Herzberg

Tab. 16 Chemikalien und Substrate

Common name

Systematischer o. alternativer Name

Zulieferer

BAP

6-Benzylaminopurin

Sigma B 9395

BSA

bovines Serumalbumin, Fraktion V

Merck 1.12018

Chlortetracyclin-Hydrochlorid

Sigma C-4881

Coomassie Brilliantblau G 250

Merck 1.02082

Bentonit

enth. >50% Monmorillonit, >15% Illit

Neudorff

Dicamba

3,6-Dichlor-2-Methoxybenzoesäure

Serva 19320

D-Phenylalanin

D-2-Amino-3-Phenylpropionsäure

Sigma P1751

1,5-Dihydroxynaphtalin

1,5-Naphtalindiol

Aldrich D 11,560-6

Einheitserde

ED 73

Gebr. Patzer GmbH

Evans Blue

Direct Blue 53

Sigma E 2129

Gelrite

Duchefa G 1101

Glycin

Aminoessigsäure

Sigma G 6143

Hakaphos Blau

Standardnährsalz 15-10-15-2

Kalilauge

KOH

Merck 5021

IAA

Indol-3-Essigsäure

Sigma I 2886

Juglon

5-Hydroxy-1,4-Naphtochinon

Sigma J 0500

Kanamycin A

Sigma K 4000

Kaliumdihydrogenphosphat

KH2PO4 purum p.a.

Fluka 60230

NAA

alpha-Naphtalenessigsäure

Sigma N 0640

Natriumchlorid

NaCl 99.5%

Heraeus 007010

Natriumhypochlorid

NaOCl 12% Cl

Roth 9062.1

Natronlauge

NaOH 1N

Merck 9956

L-Phenylalanin

L-2-Amino-3-Phenylpropionsäure

Sigma P 2126

2-Mercaptoethanol

Merck 805740

Myo-Inositol

Serva 26310

Ortho-Phosphorsäure

H3PO4 85%

VEB-Chemie Apolda

Penicillin G

Benzylpenicillin (Natriumsalz)

Sigma

Polyvinylpolypyrrolidon

PVPP

Sigma P 6755

Saccharose

Serva 35580

Schwefelsäure 95 - 97%

H2SO4 p.a.

Merck 1.00731

Streptomycinsulfat

Sigma S-6501

Thiamin-HCl

Vitamin B1

Serva 36020

trans-Zimtsäure

3-Phenylpropionsäure

Sigma C 6004

Tricyclazol®

5-Methyl-1,2,4-triazolo(3,4-b)Benzothiazol

Dow Elanco

Tween 80

Difco 3118-15-6

Lösungsmittel

Acetonitril HPLC-rein

Baker 0917

Chloroform p.a.

Merck 7386

Diethylether z.A.

Merck 1.00921

Essigsäureanhydrid z.A.

HUB-Chemie

Ethanol unverg.

HUB-Chemie

Ethylacetat p.a.

Merck 8037

Methanol p.a.

Merck 1.06009

n-Hexan p.a.

Merck 1.04367

Wasser HPLC-rein

Baker 4218

Tab. 17 Geräte

Bezeichnung

Zulieferer und Typenbez.

Eigenschaften

Festphasenextraktion

Baker spe-12G Nr. 7018-94

12 Positionen

HPLC

-Pumpen

Irica Sigma871

Doppelkolbensystem

-Entgasung

Erma CR Inc./ERC-3512

Online

-UV/Vis-Detektor

BarSpec Chrom-A-Scope No. 1970

190-370nm (Deuterium)

360-700nm (Halogen)

-Säulenofen

MTS Ingenieurbüro HA 2030

22-45°C, Wasserkühlung

-Probenaufgabeventil

Rheodyne 7125

Probenschleife 20 µl

-Mischkammer

ERC

für Hochdruckgradient

-Steuersystem

BarSpec Data System Version 1.2

-Säule mit Vorsäulenkartusche

Muder und Wochele

ID 250 (+10) x 4,0 mm

Inkubationsschüttler

Bühler SM 25 digi Inkubationshaube TH 25

Beleuchtung 15 W

Kühlbrutschränke

Rubarth Apparate GmbH

Beleuchtung 2 x 20 W

Kühlzentrifuge mit Ausschwingrotor

Jouen GR 20 22

max. 8150 g, min. 4°C

Mikroskopkamera

Zeiss Jena 100

Pflanzenwuchsschrank

Heraeus-Vötsch HPS 1500

max. 400 µEinstein m-2s-1 max. 70% RH bei 25°C

pH-Meter mit

Elektrode

Orion Research 701A

Mettler Toledo InLab 422

digital, pH .001

pH 0-14, 0-80°C

Präzisionswaage

Sartorius 2002 MP1

d=0.1 mg

Rotationsverdampfer

-Vakuumsystem

-Wasserbad

-Senkrechtkühler

-Diagonalkühler mit Auto-Hub

Büchi B-172, B-173, KVW-Technik 800

Büchi B-480, Heidolph WB 2000

Büchi

Heidolph VV 2000

Spektralphotometer

-Küvettenwechsler 12x

-UV-Küvetten

-Inkubationsbad

Kontron 922

Kontron 900

Hellma 104-QS, Halbmikro

LKB 2219

190 - 900 nm

2 x 6

Stereomikroskop SV8

Zeiss Jena

Vergrößerung 8 - 64x

Trockenschrank

Memmert UM 500

Ultra-Turrax mit Dispergierwerkzeug

T 25

S25N-18G

24000 rpm

Universalmikroskop Axioplan

Zeiss Jena

Vergrößerung 25 - 1000x

Vakuumfiltration mit

Membranfilter

Schleicher und Schüll

Sartorius

1000 ml

Vertikalstrombank

Steag LF-RF 06.15

1500 m³ h-1

Methoden

Tab. 18 TL-chromatographische Systeme

System A

(Stierle et al 1991)

System B

(Keen 1978)

System C

(Luis et al 1993)

System D

(Singh et al 1969)

Mobile Phase

CHCl3:MeOH

9:1

Hexan:EtOAc:MeOH 60:40:1

Et2O:Hexan 3:1

Et2O

Entwicklungszeit (min)

90

90

75

12

Probenaufgabe (µl)

--------------------------------------------------10 ----------------------------------------------

Stationäre Phase

-------------------------------------Silica 60 F254, 20 x 20 cm---------------------------------

Entwicklung

Vertikalkammer, eindimensional, H2SO4 (5.0% in EtOH), Trocknung 110°C

Tab. 19 HPL-chromatographische Systeme

System A

(Greenblatt und Wheeler 1986)

Sytem B

(Edwards und Kessmann 1992)

Mobile Phase

MeCN:50 mM KH2PO4 13.4 - 43.5%

in 18 min, 1.2 ml min-1

MeCN:50 mM KH2PO4 15 - 65%

in 45 min, 0.8 ml min-1

Detektion (nm)

254

280

Probenaufgabe

Rheodyne, 20 µl Probenschleife

Stationäre Phase

C 18 Nucleosil, 250 x 4 cm, 5 µm ODS,

Vorsäule 10 x 4 cm, Säulentemperatur 32°C

Abb. 45 Material und Methoden der Gewinnung von Sekundärmetaboliten aus Mf-Flüssigkulturen (A, dicke schwarze Pfeile), Applikation von pilzlichen Substanzen auf Blattgewebe verschiedener Musa cv (B, dünne schwarze Pfeile) und Nutzung pflanzlicher Extrakte zur Inkubation des Pilzes (C, farbige durchgezogene Pfeile)


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