Hoß, Reinhart: Untersuchungen zur Funktion und Spezifität pilzlicher Sekundärmetaboliten im Pathosystem ”Schwarze Sigatokakrankheit“ der Banane (Musa sp - Mycosphaerella fijiensis)

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Kapitel 3. Material und Methoden

Bei den im folgenden Kapitel beschriebenen Methoden der Versuche mit der Wirtspflanze Musa cv (Kapitel 3.1), dem Erreger Mf (3.2) und dem Pathosystem aus beiden Organismen bzw. deren Produkten (3.3) wird auf die im Anhang tabellarisch erfaßten Chemikalien und Geräte verwiesen. Soweit nicht anders angegeben, erfolgte die Anwendung gemäß Herstellerangaben und bestmöglicher Laborpraxis.

Die experimentellen Daten wurden in der kleinstmöglichen Versuchseinheit getrennt erhoben, wobei im Falle von biochemischen und physiologischen Kennwerten eine methodenbedingte Zusammenfassung der gleichbehandelten Wiederholungen zur Aufbereitung der Proben erfolgte. Die Messungen wurden in diesem Falle mindestens dreimal wiederholt, und die statistischen Parameter repräsentieren die Gesamtheit der gepoolten Stichproben.

Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS for Windows; die gewonnenen Meßwerte wurden im Bedarfsfalle transformiert, auf das Vorliegen von gegenseitiger Unabhängigkeit, Normalverteilung sowie Varianzhomogenität geprüft und sowohl deskriptiv als auch varianzanalytisch weiterverarbeitet (Sachs 1992). Bei Angaben zu signifikanten Unterschieden in multiplen bzw. Rangverfahren wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von alpha = 0.05 unterstellt.

3.1. Untersuchungen der Wirtspflanze Musa sp

3.1.1. In vitro-Kultur von Musa sp

Das Ausgangsmaterial der in vitro-Kultur von Musa sp verschiedener Sorten entstammte den Sammlungen des International Network for the Improvement of Bananas and Plantains (INIBAP) am International Transit Center (ITC) der Katholieke Universiteit Leuven, Belgien, sowie des Department of Plant Science der Obafemi Awolowo University (OAU) in Ile-Ife, Nigeria (Okole 1995). Die seit 1991 unter in vitro-Bedingungen kultivierten Musa cv sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Die Erhaltung und Multiplikation der Gewebekulturen und die Regeneration von Ganzpflanzen erfolgten nach den von Vuylsteke (1989) und Israeli et al (1995) zusammengefaßten Methoden. Die Zusammensetzung der flüssigen und gelierten Nährmedien ist im Anhang, Tabelle 13, aufgeführt, der pH-Wert wurde mit Kalilauge auf 5.7 eingestellt. Vitamine, Wuchsstoffe und Antioxidantien wurden dem autoklaviertem Medium nach Abkühlung durch einen Sterilfilter (0.22 µm) zugesetzt. Bei einer Temperatur von 26°C, einer Lichtintensität von 150 bis 200 µE m-2 s-1 und einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 16/8 Stunden wurden die Kulturen zur Multiplikation alle drei Wochen auf neue gelierte MS-Nährmedien in Petrischalen umgesetzt. Um die Gefahr somaklonaler Variationen zu vermindern, wurden die jeweils deutlich differenzierten Schößlinge (”buds“) selektiert, vereinzelt und unmittelbar auf neues Nähr-


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medium gesetzt. Nach Umsetzung auf Regenerationsmedium mit vermindertem Cytokinin- und erhöhtem Auxingehalt in Kulturgefäße von 350 ml erfolgte eine sechswöchige Inkubation unter gleichen Bedingungen bis zum Transfer auf Hardeningmedium ohne Zusatz von Wuchsstoffen und mit halbiertem Zucker- und Mineralstoffgehalt in Kulturgefäßen von 1000 ml. Nach Erreichen einer Wuchsshöhe von etwa 15 cm wurden die ex vitro-Pflanzen auf sterilisiertes Bodensubstrat (Einheitserde:Torf:humoser Sand:Bentonit 1:1:1:0.05) umgesetzt und in der Klimakammer die Luftfeuchte durch übergestülpte Polyethylentüten für weitere zwei bis drei Wochen auf annähernd 100 % gehalten. Der Hell-Dunkel-Rhythmus wurde auf 14/10 Stunden eingestellt, die Temperatur betrug 24°C, und die Lichtintensität auf der oberen Blattfläche erreichte etwa 250 µE m-2 s-1.

Die mineralische Düngung erfolgte mit Hakaphos Blau (3.5 g l-1) als periodische Gabe in flüssiger Form (Israeli et al 1995).

Tab. 5 Sortenbezeichnungen, Genom, Reaktion gegenüber Mf, Herkunft und Genbank-Sammlung der im FG Phytomedizin der HU Berlin kultivierten Musa cv (Stover und Simmonds 1987, Okole 1995, INIBAP 1997)

Sorte (ITC-Nr.)

Genom

Reaktion gegenüber Mf

M.f.

Herkunft

Genbank

Yangambi km 5 (1123)

AAA

HR

Guadeloupe

INIBAP

Williams (0400)

AAA

S

Australien (?)

OAU

Petite Naine

AAA

S

Karibik (?)

INIBAP

Dominico Hartón (0644)

AAB

S

Kolumbien

INIBAP

N4

AAB

nicht bekannt

nicht dokumentiert

nicht dokumentiert

Bobby Tannap

AAB

S

Kamerun

OAU

U12

AAB

nicht bekannt

nicht dokumentiert

nicht dokumentiert

18 Rouge French

AAB

S

nicht dokumentiert

INIBAP

Njock Kon

AAB

S

nicht dokumentiert

INIBAP

Cachaco (0643)

ABB

PR

Kolumbien

INIBAP

Moenang

ABB

PR

nicht dokumentiert

INIBAP

Fougamou

ABB

PR

nicht dokumentiert

OAU

Nakitengwa (1180)

ABB

PR

nicht dokumentiert

INIBAP

Tjaulagada

AB

S

Java

OAU


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Zur Etablierung von Kalluskulturen wurden die basalen Bereiche der Meristeme mit beginnender Kallusbildung auf Multiplikationsmedium abgetrennt und auf SH-Medium mit hohem Auxingehalt übertragen. Der Transfer der entwickelten Kalli in Flüssigmedien erfolgte nach Erreichen einer Größe von etwa 1.0 cm Durchmesser. Alle Kallusgewebe wurden im Dunkeln bei 26°C gehalten, die Flüssigkulturen wurden mit etwa 90 rpm bewegt.

Zellsuspensionen wurden nach Dhed´a et al (1991) direkt aus meristematischem Gewebe bzw. nach Novak et al (1989) aus Kalli in Flüssigmedien gewonnen. Die Nährstoffzusammensetzung entspricht der im Anhang, Tabelle 13 für Kalluskulturen nach Schenk und Hildebrandt angegebenen.

Sowohl Kalluskulturen als auch Zellsuspensionen wurden lichtmikroskopisch auf ihre Vitalität und Embryogenität untersucht. Die Anfärbung erfolgte mit Evans Blue, welches die lebende Zellwand nicht durchdringt und somit nur vitale Zellen transparent erscheinen läßt.

Gelegentlich auftretende Kontaminationen wurden mit Natriumhypochlorid (2.0 %, 30 Sekunden) zur Oberflächensterilisierung und nachfolgendem Transfer auf gelierte Nährböden mit folgenden Antibiotika kontrolliert: Penicillin G (110.0 µM), Streptomycinsulfat (34.3 µM), Chlortetracyclin-Hydrochlorid (19.4 µM).

3.1.2. Bestimmung der Enzymaktivität von PAL

Phenylalanin-Ammoniumlyase (PAL) wird als zentrales Enzym zur Metabolisierung von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen beschrieben, die zur Abwehr mikrobieller Erreger bedeutsam sind (Mansfield 1983, Dixon 1986): Das aus der Enzymreaktion hervorgehende Produkt Zimtsäure (CA) bildet die Ausgangssubstanz für die Synthese von Cumarinen durch den Shikimat-Biosyntheseweg und den Aufbau phenolischer Verbindungen (Flavone, Isoflavonderivate) durch den Phenylpropan-Biosyntheseweg. Zur Bestimmung der Aktivität von PAL wurde das aus dem Substrat L-Phenylalanin umgesetzte Produkt CA photometrisch gemessen. Diese Vorgehensweise basiert auf der Methode von Lamb (zit. nach Edwards und Kessmann 1992) und wurde folgendermaßen modifiziert: Die Entnahme von etwa 500 mg FW pro Probe erfolgte mit dem Korkbohrer, als Pufferlösung wurde 50 mM Tris-HCl + 14 mM 2-Mercaptoethanol (1500 µl g-1FW) bei 4°C zugegeben. Die Probe wurde unmittelbar nach der Gewinnung in eisgekühlten Mörsertiegeln mit säuregereinigtem Quarzsand homogenisiert und zur Reinigung bei 8150 g, 12 min, 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde geteilt zur Bestimmung des Protein- (s. u.) sowie des CA-Gehaltes; zur Fällung von unerwünschten Pflanzenfarbstoffen wurde dreimal mit Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP 10 mg, 15 h in 0.1% BSA bei 4°C vorgequollen) je 2 min auf Eis inkubiert und je 5 min bei 2100 g zentrifugiert (Leidreiter 1995). Der Überstand wurde im Verhältnis 1:9 (Substratsättigung) mit 12.1 mM L-Phenylalanin versetzt und bei 272 nm in UV-Küvetten während der Inkubation bei 40°C photometrisch in


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Intervallen von 5 min gemessen. Zur Kontrolle diente eine parallele Inkubation von Pflanzenprobe mit D-Phenylalanin. Die Erhöhung der Absorption von CA in einem Zeitraum zwischen 45 und 75 min Inkubationsdauer diente der Berechnung der jeweiligen PAL-Aktivität in Katal (pkat mg-1 Protein).

Die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes erfolgte nach Bradford (1976) unter Verwendung von BSA als Eichstandard. Die Endkonzentration der Farblösung betrug 0.01% (v/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 in 4.7% (v/v) EtOH und 8.5 % (v/v) Phosphorsäure. Die gepufferte Probe wurde in einem Verhältnis zugesetzt, das einem Proteingehalt <100 µg entspricht; die Extinktion des entstehenden Farbkomplexes war proportional zur Konzentration der Gesamtproteine und wurde bei 629 nm (Raumtemperatur) gemessen.

Der Quotient aus PAL-Aktivität und Proteingehalt beschreibt den Umsatz von Substrat und ergibt die Enzymaktivität in pkat mg-1Protein.

3.1.3. Gewinnung von Sekundärmetaboliten aus Musa-Blattgewebe

Zur biochemischen Charakterisierung des Kontaktraumes von Erreger und Wirt wurde der Apoplast von Musa-Blattgewebe verschiedener Sorten extrahiert, chromatographisch getrennt und im Biotest auf die Wirkung gegenüber pilzlichen Organismen geprüft.

Als biogener Stressor zur Anregung pflanzlicher Abwehrmechanismen wurde nach Luis et al (1993) das Antibiotikum Kanamycin eingesetzt (10 mg ml-1 + 0.05% [v/v] Tween 80), das auf die ribosomale Proteinbiosynthese wirkt.

Die Gewinnung der interzellulären Flüssigkeit erfolgte mit verschiedenen Methoden, die sowohl eine direkte Zentrifugation als auch eine Vakuuminfiltration von Blattgewebe und anschließende chemische Extraktion mit apolaren Lösungsmitteln umfaßte. Nach De Wit und Spikman (1982) wurden Blattstücke parallel zur Aderung in speziellen Röhrchen mit Siebvorsatz plaziert und 10 min bei 3000 g zentrifugiert. Um den bei der nachfolgenden Analyse störenden Ausfluß der Milchröhren zu binden, wurden Zentrifugenröhrchen mit einem Molekularfilter von 100´000 Da eingesetzt. In Weiterentwicklung der ”drop-diffusate method“ wurde von Keen (1978) die ”facilitated diffusion method“ beschrieben, die aus der Vakuuminfiltration von Blattstücken in alkoholischer Lösung (40% [v/v] EtOH, 15 ml g-1 FW) bei 250 mbar und der nachfolgenden Behandlung von 4 h auf dem Rotationsschüttler besteht; die gewonnene alkoholische Lösung wurde vakuumverdampft und mit EtOAc dreimal extrahiert. Die Trennung der Rohextrakte erfolgte mit TLC der Systeme B und C (siehe Anhang, Tabelle 18).

Alternativ erfolgte die Nutzung der nach Vakuumverdampfung gewonnenen wässerigen Lösung als Substrat zur Inkubation von Mf, um deren Einfluß auf den pilzlichen Sekundär-


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stoffwechsel zu untersuchen: Dazu wurde die Lösung auf 3 ml g-1 FW eingestellt und die Nährstoffe gemäß M-1D-Flüssigmedium (siehe Anhang, Tabelle 14) zugefügt. Das weitere Vorgehen erfolgte wie in den Abschnitten 3.2.1 und 3.2.2 beschrieben.

Die Entwicklung der TLC-Platten wurde mit 5.0 %iger Schwefelsäure (v/v) in 95 % (v/v) EtOH vorgenommen. Zur Identifizierung biologisch aktiver Substanzen wurden die entwickelten TLC-Platten nach dem Verdampfen von Lösungsmittelrückständen mit sterilem SNA-Flüssigmedium bis zur Sättigung besprüht und eine Sporensuspension von Cladosporium sp (108 Sporen ml-1) aufgetragen; die Inkubation erfolgte vier Tage unter Dauerlicht bei 26°C in der feuchten Kammer (Smith 1982). Fehlende oder nur gering ausgebildete Keimschläuche indizierten Hemmwirkungen durch pflanzliche Metaboliten; die entsprechenden Zonen wurden aus den parallel entwickelten, nicht inokulierten oder inkubierten TLC-Platten herausgelöst und HPL-chromatographisch unter den Bedingungen der Systeme A und B (siehe Anhang, Tabelle 19) charakterisiert.

3.2. Untersuchungen des Pathogens Mf

3.2.1. In vitro-Kultur von Mf

Das Ausgangsmaterial zur in vitro-Kultur von Mf wurde in verschiedenen Anbauregionen von natürlich infizierten Musa-Pflanzen unter Feldbedingungen gewonnen (Okole 1995). Folgende Isolate wurden kontinuierlich seit 1991 unter kontrollierten Bedingungen kultiviert:

Tab. 6 Bezeichnungen und Herkünfte der Isolate von Mf

Bezeichnung

Herkunftsregion

isoliert aus (Musa cv):

  • 294

West Samoa

nicht dokumentiert

  • 309

Papua Neuguinea

Cavendish (AAA)

  • 743

Tonga

T8 (AAAA)

  • 750

Tonga

T8 (AAAA)

  • CAM

Kamerun

Bobby Tanap (AAB)

  • HON

Honduras

nicht dokumentiert

  • NIG

Nigeria

Agbapa (AAB)

  • OSHO

nicht dokumentiert

nicht dokumentiert

Zur in vitro-Kultur von Mf wurden Nährmedien verschiedener Zusammensetzung und Konsistenz verwandt (siehe Anhang, Tabelle 14). Die Erhaltung der Kulturen erfolgte auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) mit einer Umsetzung auf frische Nährböden im Abstand von 21 Tagen. Zur Produktion und Gewinnung pilzlicher Metaboliten wurden Flüssigmedien auf der Basis des


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von Filner für die Kultur von Nicotiana tabacum entwickelten Mediums M-1D, modifiziert durch eine Zugabe von Kokoswasser nach Pinkerton und Strobel (1976), verwendet. Der pH-Wert wurde bei allen Medien mit Natronlauge auf 5.7 eingestellt.

Der Wirkstoff Trizyclazol® wurde zur Beeinflussung des pilzlichen Pentaketidmetabolismus (siehe Literaturübersicht, Abschnitt 2.3) eingesetzt, um durch die spezifische Hemmung von Reduktasen eine verstärkte Synthese des 2,4,8-THT zu erwirken. Die Zugabe des in 2.0 % EtOH gelösten Wirkstoffes erfolgte durch Sterilfilter nach Abkühlung des Nährmediums.

Bei der Inkubation von Flüssigmedien wurden ein Hell-Dunkel-Rhythmus von 12 Stunden und eine Lichtintensität von 180 µE m-2 s-1 etabliert. Die Flüssigmedien wurden mit 10 Myzelstücken von etwa 40 mm² Grundfläche pro Liter Nährlösung inokuliert. Zur Variation der Sauerstoffversorgung wurden verschiedene Kulturgefäße (Rund- und Erlenmeyerkolben mit luftdichtem Deckel und einem Verhältnis von Nährlösung zu Luftvolumen von 1:1; flache Kulturgefäße mit luftdurchlässigem Verschluß und einem Volumenverhältnis von 1:2) eingesetzt. Je nach Verhältnis von Grundfläche des Kulturgefäßes zum Volumen wurde eine Schüttelfrequenz von 40 bis 100 rpm auf dem Rotationsschüttler gewählt. Die Nährmedien aus infiltrierten Bananenblättern (siehe Abschnitt 3.1.3) wurden im Verhältnis 1:3 (FW/v) verdünnt und autoklaviert.

Die Inkubation der Pilzisolate auf gelierten Medien erfolgte bei 26°C unter Leuchtstoffröhren mit 250 µE m-2 s-1 mit periodischer Umsetzung alle 21 Tage. Zur Gewinnung von sporulierenden in vitro-Kulturen wurden infizierte, nicht nekrotisierte Musa-Blattstücke ausgeschnitten, in Ethanol (50 %) oberflächensterilisiert, mehrmals in sterilem Wasser gewaschen und auf SNA-Nährböden mit Antibiotikazusatz bei 25°C inkubiert (Kreisel und Schauer 1987). Die aus dem auswachsenden Myzel zu gewinnenden Konidien wurden zur weiteren Kultivierung auf PDA übertragen und dienten als Inokulumquelle im Versuch zur Konidienproduktion auf verschiedenen Nährmedien. Die Beimpfung erfolgte mit einer Suspension von 106 Konidien ml-1. Die Konidien wurden durch Überstauen der Petrischale mit sterilem Aq. dest. + 0.05% (v/v) Tween 80 und mehrmaligem Schaben mit sterilem Objektträger über das Myzel gewonnen. Die Zählung erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer bei Konidiendichten von < 2.5 106 Sporen ml-1.

Die Bestimmung der Myzeltrockenmasse wurde nach Filtern über Faltenfilter (Schleicher und Schüll 595½) und anschließender Trocknung (24 Stunden) bei 104°C durchgeführt (Kreisel und Schauer 1987). Die Messung des pH-Wertes in den periodisch entnommenen Proben von 1.0 ml erfolgte mit einer Mettler Toledo-Elektrode in Eppendorf-Reaktionsgefäßen.


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3.2.2. Untersuchung der Sekundärmetaboliten des Pentaketid-Biosyntheseweges

3.2.2.1. Extraktion und Probenaufbereitung

Zur Extraktion von Sekundärmetaboliten des Pentaketid-Biosyntheseweges kamen die von Stipanovic und Bell (1977) sowie Stierle et al (1991, 1992) beschriebenen Methoden zur Anwendung. Bei Beendigung der Inkubationsperiode nach dem jeweils angegebenen Zeitraum wurde das Myzel mit dem Ultra-Turrax T25 bei 25´000 rpm, 1 min homogenisiert. Zur Extraktion der pilzlichen Metaboliten aus dem Myzel erfolgte die Zugabe von Methanol im Verhältnis 1:1 und eine Behandlung (24 h) bei 4°C auf dem Rotationsschüttler. Nach Filtration durch Faltenfilter 595½ und Vakuumverdampfung auf ca. ¼ des Ausgangsvolumens wurde Kochsalz bis zur Sättigung (ca. 30 g 100 ml-1) zugegeben. Die Extraktion der apolaren Substanzen erfolgte durch zweimaliges Schütteln der wäßrigen Phase mit EtOAc im Scheidetrichter; nach Trennung der Phasen wurde das apolare Lösungsmittel abgenommen, über Membranfilter aus Polyamid (0.22 µm) vakuumfiltriert und mit Na2SO4 dehydrogeniert und gereinigt. Das Volumen wurde durch Vakuumverdampfung auf 5 ml l-1 Ausgangsvolumen eingeengt.

Die Probenaufbereitung erfolgte mit Festphasenröhrchen (SPE) unter Verwendung folgender stationärer und mobiler Phasen: Die Normalphasenmaterialien Cyanopropyl- (CN-U) und Aminopropylsilan (NH2) sowie Silica (SiOH) wurden apolar mit Ethylacetat konditioniert, mit Hexan gewaschen und mit Ethylacetat und Methanol eluiert, die Umkehrphasen Octadecyl- (C-18) und Cyanopropylsilan polar mit Methanol und folgend Wasser konditioniert, mit Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert (jeweils 5.0 ml pro Extraktionsschritt).

Zur Entwicklung einer für die vorliegende Untersuchung geeigneten Probenaufbereitung wurden die Standardsubstanzen 1,5-DHN und Juglon eingesetzt, deren Retentionszeiten unter HPL-chromatographischen Bedingungen (siehe Abschnitt 4.2.2.1, Tabelle 10) einem weiten Bereich pilzlicher Metaboliten aus den Rohextrakten von Mf entsprechen; die eingesetzte Substanzmenge betrug jeweils 10µg 20µl-1 Probenvolumen (Lösungsmittel: EtOAc bei apolarer, MeOH bei polarer Konditionierung).

3.2.2.2. Dünnschicht- und HPL-Chromatographie

Der weiteren Auftrennung der Rohextrakte bzw. der mit SPE behandelten Substanzgemische diente der Einsatz chromatographischer Verfahren, die eine Quantifizierung der pilzlichen Metaboliten und deren Weiterverwendung im Biotest ermöglichte.

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde dabei grundsätzlich in der Normalphase unter Anwendung von Silica 60 mit Fluoreszensfaktor 254 nm und verschiedenen mobilen Phasen durchgeführt (siehe Anhang, Tabelle 18): Zur Auftrennung der Rohextrakte von Mf wurde das System A mit Chloroform:Methanol 10:1 (Stierle et al 1991) eingesetzt. Die im UV-Licht


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identifizierbaren Substanzflecke wurden von der Oberfläche entfernt und zur weiteren Charakterisierung durch HPLC und Massenspektrometrie (MS) in EtOAc (zweimalige Extraktion) aufgenommen.

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) erfolgte an der Umkehrphase (RP) mit Octadecylsilan (ODS) als stationärer und einem Gradientensystem aus MeCN und Wasser mit Kaliumphosphatpuffer (50 mM) als mobiler Phase (Greenblatt und Wheeler 1986); die pilzlichen Metaboliten wurden mit einem linearen Gradienten von 13.4 bis 43.5 % MeCN in 18 min unter den gewählten chromatographischen Bedingungen (System A, siehe Anhang, Tabelle 19) getrennt und bei 254 nm detektiert. Die entsprechenden Fraktionen bei den jeweiligen Retentionszeiten wurden manuell gesammelt, durch Vakuumverdampfung von polaren Lösungsmittelkomponenten befreit und mit EtOAc reextrahiert. Die Kalibrierung der quantifizierten Substanzen erfolgte mit kommerziellem Juglon bzw. im Falle des 2,4,8-THT durch wiederholtes Sammeln der Fraktion bei tR = 9.45 min, Reextraktion, gravimetrische Bestimmung des nicht verdampfbaren Rückstandes und Reinjektion in die HPLC. Die Absorptionsspektren der verschiedenen Substanzen wurden mit dem UV-Detektor unter den jeweiligen chromatographischen Bedingungen (Lösungsmittelzusammensetzung bei der jeweiligen Retentionszeit) aufgenommen. Die Berechnung der quantitativen Parameter erfolgte mit dem Barspec Data System (BDS) bzw. nach Unger (1989).

Zur Gewinnung nicht verfügbarer Pentaketid-Metaboliten wurde die Thiele-Winter Acetoxylation zur Synthese von Naphtochinonen angewandt (Merck1996). Dabei wurde Juglon in Essigsäureanhydrid gelöst und mit konzentrierter Schwefelsäure katalytisch zu 1,2,4,5- und 1,3,4,5-Tetraacetoxynaphtalen hydroxyliert; durch anschließende Oxidation im basischen Milieu entstanden jeweils 2- und 3-Hydroxyjuglon (Singh et al 1969). Die Trennung beider Substanzen erfolgte im TLC-System D (siehe Anhang, Tabelle 19). Die Bestimmung der Retentionszeiten im HPLC-System A ermöglichte die Zuordnung von Substanzpeaks aus Mf-Proben.

3.2.2.3. Massenspektrometrie und Gaschromatographie

Die Bestimmung der Molekulargewichte verschiedener Fraktionen der Rohextrakte von Mf erfolgte massenspektrometrisch durch das Fachinstitut der HU Berlin für Angewandte Analytik und Umweltchemie. Die mit Hilfe der TLC getrennten und konzentrierten Fraktionen wurden lösungsmittelfrei und underivatisiert im Massenspekrometer HP 5995A bei einer Anfangstemperatur von 20°C und einem linearen Temperaturanstieg von 64°C min-1 gemessen. Die Ionisierung erfolgte durch Elektronenimpakt mit 70 eV.

Zur weiteren Analyse wurde die TLC-Fraktion mit dem Retentionsfaktor (Rf) = 0.34, die durch Nachweis mit MS die Substanz 2,4,8-THT enthielt, gaschromatographisch aufgetrennt und durch Kopplung mit MS die Molekulargewichte bestimmt. Die Derivatisierung erfolgte mit


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N,O-Bis-Silyl-trifluoracetamid (BSTFA) und führte zu folgenden Reaktionen (Molekulargewichte [Da] in Klammern):

2,4,8-THT (194) + BSTFA

rarr Tris-trimethylsiloxy(TMS)-tetralon (410),

rarr Tris-dimethylsiloxy(DMS)-tetralon (395),

sowie weitere silylierte Tetralonverbindungen (MW = 320, 305, 294) und die Fragmente funktioneller Gruppen von BSTFA (MW = 147, 75, 74, 73).

3.3. Untersuchungen der Wirt-Pathogeninteraktionen

3.3.1. Inokulation von Blattgewebe mit Pilzmyzel

Als Ausgangsmaterial zur Inokulation der Wirtspflanze mit dem Erreger dienten die aus der Gewebekultur in Boden überführten Musa-Ganzpflanzen (siehe Abschnitt 3.1) sowie das auf geliertem PDA wachsende Myzel von Mf (Abschnitt 3.2).

Da die Konidienproduktion unter in vitro-Bedingungen rasch abnimmt (siehe Abschnitte 2.3 und 4.2.1) und Sporen somit als Inokulumquelle nicht zur Verfügung standen, wurde eine Myzelsuspension von 0.3 g FW ml-1 Wasser + 0.05 % (v/v) Tween 80 auf die Blattunterseite aufgetragen (Jones 1995). Zur Aufrechterhaltung einer nahezu 100 %igen Wassersättigung der Luft wurden bis 7 dpi Polyethylentüten über die entsprechenden Blattflächen gestülpt.

Inokuliert wurde jeweils das jüngste voll entfaltete Blatt von Musa-Pflanzen mit einer Stengelhöhe von mindestens 20 cm bzw. 6 Wochen nach Überführung aus der in vitro- in die Bodenkultur. Die Bedingungen in der Klimakammer entsprachen während der gesamten Periode der Infektion 24°C, RH 70 % und einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 14/10 Stunden.

Die Bonitur der Krankheitssymptome erfolgte periodisch anhand des von Fullerton und Olsen (1995) entwickelten Schemas, dessen Stadien in Abhängigkeit von der Zeit zu einer Skala mit fünf Graden zur Klassifizierung der pilzlichen Virulenz sowie der pflanzlichen Reaktion führte (siehe Kapitel 2.4).

Die Behandlung des Wirt-Pathogensystems unter in vitro-Bedingungen mit dem Wirkstoff Tricyclazol® erfolgte in Übereinstimmung mit der Empfehlung zur Anwendung als systemisches Fungizid gegen Pyricularia oryzae im Reisanbau (Herr Kühn, Dow Elanco, pers. Mittlg.): Die Aufwandmenge der aktiven Substanz (750 mg l-1) entspricht 4.0 mM und wurde vor der Inokulation des Pilzmyzels auf die gesamte Pflanze (alle Blätter, Ober- und Unterseite) appliziert (Wasser + 0.05 % [v/v] Tween 80). Da die Aufnahmerate des Wirkstoffes durch Musa sp, die Verteilung in der Pflanze sowie die mögliche Metabolisierung und Transferrate zum Mf -Myzel als unbekannte Größen betrachtet werden müssen, wurde das Inokulum unmittelbar nach Auftragen auf die Blattunterseite nochmals mit Tricyclazol® besprüht.


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3.3.2. Mikroskopische Untersuchungen von infizierten Musa-Kalli

Zur Nutzung homogener Zellformationen des Pathosystems Musa sp/Mf wurden Kalli verschiedener Sorten nach der in Abschnitt 3.1.1 beschriebenen Methode gewonnen und in Wägeschälchen mit 30 mm Höhe ungefähr 3 Wochen bei 26°C im Dunkeln vorgezogen. Die Inokulation erfolgte mit Myzel des Erregers auf die Oberfläche des Kallus (Donovan et al 1990). Die Inkubation wurde bei 26°C im Hell/Dunkelrhythmus von 16/8 Stunden durchgeführt.

Die mikroskopischen Untersuchungen erfolgten an Musa/Mf-Präparaten, die unmittelbar nach Auftreten der ersten Symptome an der Kallusoberfläche gewonnen wurden. Die Vorbereitung der Proben sowie die Elektronenmikroskopie wurden im Fachgebiet Pflanzenernährung der HU Berlin durchgeführt und bestanden in der Fixierung in 1% Osmiumsäure, Entwässerung in aufsteigender Acetonreihe und Einbettung in Epoxydharz (Frau Ortmann, pers. Mittlg.). Die lichtmikroskopischen Analysen wurden an Semidünnschnittpräparaten (2 µm Schichtdicke) mit dem Durchlicht-Universalmikroskop Axioplan ohne weitere Anfärbung durchgeführt. Die Ultradünnschnitte (50 - 80 nm Schichtdicke) wurden am Ultramikroton zur weiteren Untersuchung am Transmissionselektronenmikroskop (TEM) Zeiss EM 9 (Beschleunigungsspannung 60 kV, Auflösung 1.5 nm) hergestellt und mit Uranylacetat und Bleicitrat kontrastiert.

3.3.3. Applikation von Mf-Metaboliten in Musa-Blattgewebe

Zur Charakterisierung der Wirkungen von Mf-Metaboliten auf verschiedene Musa cv in der Zone primären Kontaktes zwischen Wirt und Pathogen wurde die ”leaf-puncture-wound overlay technique“ in Anlehnung an Molina und Krausz (1989) und Stierle et al (1991, 1992) angewandt. Diese bestand im Durchstoßen des Blattgewebes mit einer sterilen Nadel und der darauffolgenden Applikation der in 5 % (v/v) EtOH gelösten Metaboliten auf die Blattoberfläche. Teilweise wurde die pflanzliche Kutikula mt Hexan entfernt, um die Oberflächenspannung zu vermindern und die Kontaktfläche zu erhöhen. Die behandelten Blattstellen wurden beidseitig mit Petrischalen luftdicht verschlossen, um Transpirationsverluste zu vermeiden, und in der Klimakammer unter gegebenen Bedingungen (siehe Abschnitt 3.1) einer maximalen Strahlung ausgesetzt, da Licht sich als für die Symptomausprägung entscheidender Faktor herausstellte. Die Auswahl des zu behandelnden Gewebes orientierte sich an der größtmöglichen Homogenität aller in den Versuch einbezogenen Pflanzen verschiedener Musa cv, insbesondere im Hinblick auf das Alter der Gesamtpflanze, das physiologische Alter des Blattgewebes und des Ernährungs- und Wasserversorgungszustandes (Yoder 1981). Jede Punktierung wurde dreimal in den Interkostalfeldern jedes Blattes wiederholt, und die Anzahl der Pflanzen pro Variante betrug n = 3. Die eingesetzte Höchstkonzentration wurde schrittweise verdünnt bis zur Lösungsmittelkontrolle (5 % Ethanol). Zur besseren Vergleichbar-


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keit der physiologischen Wirkungen verschiedener Metabolite erfolgte die Angabe der Konzentration als molare Größe.

Alternativ wurde die von Lepoivre und Acuna (1990) beschriebene ”leaf disk infiltration technique“ angewandt, die durch den Einsatz der Vakuuminfiltration die Einwirkung pilzlicher Metaboliten auf pflanzliches Gewebe verbessern soll. Dazu wurden jeweils 20 Blattstücke von circa 0.64 cm² mit dem Korkbohrer ausgestanzt, bei 500 mbar mit der Probensubstanz in 2 %iger ethanolischer Lösung infiltriert, für 24 Stunden bei 25°C auf dem Rotationsschüttler inkubiert und nach dem Filtern in jeweils 10 ml destilliertem Wasser nochmals 24 Stunden inkubiert. Die Messung der Leitfähigkeit stellte ein Maß für den Elektrolytverlust zerstörter Zellen dar. Als Kontrollen dienten durch Kryoklastik (-20°C) abgetötete Zellgewebe bzw. ethanolische Lösung (2 %) ohne Substanz.


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