Hoß, Reinhart: Untersuchungen zur Funktion und Spezifität pilzlicher Sekundärmetaboliten im Pathosystem ”Schwarze Sigatokakrankheit“ der Banane (Musa sp - Mycosphaerella fijiensis)

39

Kapitel 4. Ergebnisse

Die Darstellung der Ergebnisse folgt der in den vorangegangenen Kapiteln gewählten Gliederung in die Abschnitte zur Wirtspflanze, zum Pathogen und zum Pathosystem Musa sp/Mf. Dadurch soll die Zuordnung eigener Versuchsergebnisse zu den eingesetzten Materialien und Methoden sowie der Literaturübersicht erleichtert werden.

4.1. Wirtspflanze Musa sp

4.1.1. In vitro-Kultur von Musa sp

Die in vitro-Kultur von Musa cv diente dem Erhalt und der Vermehrung von Wirtspflanzen verschiedener Sorten, die eine unterschiedliche Reaktion gegenüber dem Erreger Mf und dessen Metaboliten aufweisen, sowie zur Gewinnung von Sekundärstoffen aus pflanzlichen Geweben und deren weiterer Untersuchung.

Zur Identifizierung geeigneter Sorten mit maximalen Vermehrungsraten wurden die Multiplikationsraten der Musa cv-Acquisitionen auf MS-Nährmedium mit unterschiedlicher Wuchsstoffkonzentration und -zusammensetzung bestimmt (siehe Anhang, Tabelle 13):

Abb. 4 Multiplikationsraten von Musa cv auf MS-Nährmedium mit unterschiedlicher Vitaminzusam-mensetzung drei Wochen nach Umsetzen (n = 12, Mittelwert ± SD)


40

Die Vermehrungsraten jedes abgetrennten und vereinzelt inkubierten Explantates (”bud“) lagen zwischen 1.5 und 4.0 Sproßtrieben, wobei die Variationen bei einigen Sorten (Yangambi km 5, Dominico Hartón, Moenang) insbesondere bei Zugabe der von Okole (1995) angegebenen Wuchsstoffzusammensetzung hohe Werte annahmen. Die Kriterien zur Auswahl der Sorten, die in der weiteren experimentellen Arbeit jeweils die bekannten Reaktionen gegenüber Mf repräsentieren sollten, waren hohe Multiplikationsraten in Verbindung mit dem geringen Auftreten unerwünschter Kallusbildung und Verbräunung.

Tab. 7 Charakteristika der in vitro-Kultur ausgewählter Musa cv nach drei Wochen Inkubationsdauer

Musa cv

Genom

Reaktion gegen-über Mf

Multiplikationsrate (MS-Medium nach Vuylsteke 1989)

Kallus-bildung

Verbräunung

Yangambi km 5

AAA

HR

3.71

+

+

Dominico Hartón

AAB

S

2.96

++

++

Cachaco

ABB

PR

3.00

-

+

- nicht aufgetreten, + wenig, ++ mittelmäßig

Bei einem dreiwöchigen Zyklus des Teilens und Umsetzens multipler Schößlinge auf frische Nährmedien wurde bei den gegebenen Licht- und Temperaturbedingungen keine Veränderung der Vermehrungsrate über einen Zeitraum von mehr als drei Jahren festgestellt. Wachstumsanomalien an differenzierten Geweben (kalloide Bereiche, Hypertrophien) traten verstärkt bei Dominico Hartón auf und wurden beim periodischen Umsetzen entfernt.

Die weiteren Stufen der in vitro-Kultur der vereinzelten Schößlinge werden in Abbildung 5 dargestellt: Zur Gewinnung von Musa-Ganzpflanzen wurden die differenzierten Sproßmeristeme auf MS-Regenerationsmedium gesetzt und entwickelten innerhalb von drei Wochen ein vollständiges Wurzelsystem; vor dem Auspflanzen (ex vitro) wurde auf dem Mineralstoff- und Saccharosereduzierten MS-Hardening-Medium der Übergang zur Photoautotrophie vollzogen. Morphologische Anomalien, die als somaklonale Variationen angesprochen wurden, traten nach dem Auspflanzen in Bodensubstrat auf; am häufigsten wurde bei Pflanzen im Drei- bis Vier-Blattstadium der Sorte Dominico Hartón das Phänomen der Gelbstreifung beobachtet.


41

Abb. 5 Morphologische Charakterisierung von Musa-Kulturen unter in vitro-Bedingungen:
a. Differenziertes Gewebe (”bud“) und kalloide Bereiche auf MS-Multiplikationsagar drei Wochen nach Umsetzen (Vergr. 20x, Balkenlänge = 1 mm)
b. Schoß- und Wurzelentwicklung auf MS-Regenerationsagar 3 Wochen nach Umsetzen
c. Nicht-embryogene Zellcluster in Flüssigkultur (Vergr. 400x, Balkenlänge = 100 µm)
d. Ex vitro-Pflanze 6 Wochen nach Umsetzen


42

Die Gewinnung von Einzelzell- und Kalluskulturen erfolgte aus frisch geschnittenem meristematischem Gewebe, das nach einer kurzen Phase zur Bildung von Abschlußgewebe in SH-Flüssigmedium (Kallusbildung) bzw. MS-Multiplikationsmedium (Zellsuspension) übertragen wurde. Bei der periodischen Evaluierung der Zellsuspensionen unter Anfärbung mit Evans Blue konnten lebende, sich teilende Einzelzellen beobachtet werden, diese waren jedoch in keiner der drei Musa-Sorten embryogen (Abbildung 5c).

Die Kalli in Flüssigkulturen wiesen bei einem Anfangsdurchmesser von > 5 mm einen sichtbaren Massezuwachs auf und wurden zur Inokulation mit Mf-Myzel auf geliertes SH-Medium umgesetzt (siehe Abschnitt 4.3.2, Abbildung 31).

4.1.2. Enzymaktivität der Phenylalanin-Ammoniumlyase (PAL)

Als zentrales Enzym am Übergang vom Primär- zum Sekundärstoffwechsel der Pflanze wurde die PAL-Aktivität durch UV-Absorption des entstehenden Produktes Zimtsäure (CA) gemessen. Die Elizitierung erfolgte mit dem Antibiotikum Kanamycin sowie durch Inokulation mit Mf-Myzel, wobei teilweise der Wirkstoff Trizyclazol® zugegeben wurde.

Die Ergebnisse der Vorversuche mit verschiedenen Methoden der Probenvorbehandlung und der UV-Messung bei unterschiedlichen Wellenlängen zeigten die Notwendigkeit einer intensiven Entfärbung der Pflanzenproben durch Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) oder Aktivkohle; die Messungen erfolgten bei den in wässerigem Puffer gemessenen Absorptionsmaxima der reinen Substanzen (CA: lambdamax = 272 nm, Proteinkomplex: lambdamax = 629 nm).

Abb. 6 PAL-Aktivität verschiedener Musa cv nach Inokulation mit Mf (n = 3, gleiche Buchstaben bezeichnen nichtsignifikante Unterschiede nach Duncan, p = 0.05)


43

Durch die Anwendung des Antibiotikums Kanamycin konnte keine Aktivierung von PAL nachgewiesen werden.

In der HR-Sorte Yangambi km 5 war die PAL-Aktivität gegenüber den beiden anfälligeren Sorten vor Inokulation deutlich erhöht. Im Verlaufe der Infektion stiegen die Aktivitäten aller drei Musa cv deutlich an und erreichten ihr Maximum 24 Stunden nach Inokulation, sanken aber innerhalb von 48 Stunden auf ihr ursprüngliches Niveau vor Inokulation und verbleiben bis zum Ende der Meßperiode bei Werten um 0.2 pkat mg-1Protein. Das Ausmaß der Aktivierung von PAL in Musa cv steigt also als Reaktion auf eine Inokulation mit dem Erreger Mf mit dem Grad der Resistenz gegenüber dem Pathogen.

Um den Einfluß des pilzlichen Sekundärmetaboliten 2,4,8-THT auf die pflanzliche Erkennungs- und/oder Abwehrreaktion zu untersuchen, wurde der für den Pentaketid-Metabolismus des Erregers wichtige Wirkstoff Tricyclazol® eingesetzt (siehe Kapitel 4.2.2). Die PAL-Aktivität in den beiden anfälligen Sorten Cachaco (PR) und Dominico Hartón (S) zeigte keine Veränderung gegenüber der inokulierten Kontrolle ohne den Wirkstoff; im Falle von Musa cv Yangambi km 5 konnte eine Aktivierung in höherem und anhaltenderem Maße festgestellt werden:

Abb. 7 PAL-Aktivität von Musa cv Yangambi km 5 nach Inokulation mit Mf und Applikation des Wirkstoffes Tricyclazol®(n = 3, gleiche Buchstaben bezeichnen nichtsignifikante Unterschiede nach Duncan, p = 0.05)


44

4.1.3. Sekundärmetaboliten zur Abwehr pilzlicher Erreger

Zur Extraktion von pflanzlichen Sekundärmetaboliten wurden verschiedene Verfahren angewandt, die die Gewinnung von Apoplastenflüssigkeit voraussetzten. Die in Kapitel 3.1.3 beschriebene Methode der Infiltration wässeriger Pufferlösung und nachfolgender Zentrifugation ergab allerdings nur minimale Ausbeuten (< 10 µl g-1 FW), die auch durch vermindertes Infiltrationsvakuum und erhöhte Zentrifugenbeschleunigung nicht wesentlich gesteigert werden konnten, so daß die ”facilitated diffusion method“ nach Keen (1978) zur Anwendung kam. Die so gewonnenen Rohextrakte wurden durch TLC getrennt und angefärbt bzw. mit einer Sporensuspension aus Cladosporium sp inokuliert, wobei folgende Substanzbande sichtbar wurden:

Abb. 8 Trennung von Sekundärmetaboliten verschiedener Musa cv (DH = Dominico Hartón, Y = Yangambi km 5, C = Cachaco) durch TLC nach Elizitierung mit Kanamycin

(= ohne Kanamycin-Behandlung, + = mit Kanamycin-Behandlung): a. Entwicklung mit Schwefelsäure, lambda = 254 nm; b. Nach Inkubation mit Cladosporium sp (4 dpi)

Die Trennung pflanzlicher Extrakte auf Silica unter Verwendung des TLC-Systems B (siehe Anhang, Tabelle 18) zeigte eine sehr dichte Abfolge von UV-absorbierenden Substanzen, die allerdings keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den drei Musa cv erkennen ließen. Nach Inokulation und der viertägigen Inkubation der entwickelten TLC-Platten mit einer Cladosporium sp-Sporensuspension in der feuchten Kammer wurde eine deutliche Zone verminderten Myzelwachstums im Extrakt von Yangambi km 5 nach Elizitierung sichtbar (Rf ˜ 0. 35), die auf das Vorhandensein antimikrobieller, postinfektionell gebildeter Substanzen hinweist. Diese wurden auf einer parallel entwickelten Platte detektiert, extrahiert und in das


45

HPLC-Sytem B (siehe Anhang, Tabelle 19) reinjiziert; dabei konnte ein deutlicher Peak bei tR = 15.82 min detektiert werden, der zwei Absorptionsmaxima (lambda = 215 und 280) aufweist:

Abb. 9 Chromatographische Kennwerte eines aus Musa cv Yangambi km 5 nach Elizitierung mit Kanamycin isolierten TLC-Spots (Rf = 0.35) mit antimikrobieller Wirkung:
a. Chromatogramm (lambda = 280 nm); b. UV-Spektrogramm (tR = 15.82 min)

4.2. Pathogen Mf

4.2.1. In vitro-Kultur

Die in vitro-Kultur von Mf diente der Gewinnung von Inokulationsmaterial für die Synthese metabolischer Produkte des Sekundärstoffwechsels sowie der Infektion von Musa cv. Die morphologischen Charakteristika von Myzel und Konidien sind in Abbildung 10 a und b dargestellt.


46

Abb. 10 Mf-Myzel unter in vitro-Bedingungen: a. Konidienträger (Vergr. 1500x, Balkenlänge = 20 µm); b. Konidiensuspension (Vergr. 600x, Balkenlänge = 50 µm)

Um die Produktion von Konidien zur Verwendung als natürliches Inokulum zu untersuchen, wurde ein frisch gewonnenes Isolat aus Honduras (Mf-HON) auf verschiedene Nährböden transferiert und die Anzahl der gebildeten Konidien periodisch bestimmt (Tabelle 8) und zur Gesamtmenge produzierter Konidien kumuliert (Abbildung 11).

Tab. 8 Periodische Produktion von Mf-Konidien auf verschiedenen Nährmedien

Tage nach Inokulation (dpi)

10

15

20

25

30

35

40

50

Nährboden

Anzahl produzierter Konidien (n 104 58 cm-²)

M-1D

2,7 a

4,6 a

4,8 a

8,5 a

4,2 a

3,4 a

1,8 a

1,8 a

Musa 50%

1,9 ab

2,2 ab

2,0 b

3,2 b

2,1 b

2,7 ab

1,3 a

0,5 c

GPA

1,8 ab

2,4 ab

1,5 bc

3,3 b

2,0 b

2,3 b

0,9 bcd

0,3 c

SNA

0,9 b

0,7 b

1,3 bc

2,7 bc

2,8 ab

2,7 ab

1,7 a

1,6 ab

Musa 12,5%

1,1 ab

0,9 b

0,8 bc

1,6 bcd

1,6 b

1,3 c

1,1 bcd

0,5 c

PDA

0,8 b

0,6 ab

1,0 bc

0,6 d

0,5 c

0,8 c

0,6 cd

0,3c

H2O

0,4 b

0,3 b

0,5 c

0,9 d

1,2 b

1,2 c

1,2 abc

0,6 b

Anmerkungen: n = 4, gleiche Buchstaben innerhalb einer Spalte verweisen auf nichtsignifikante Unterschiede (H-Test nach Kruskal und Wallis, alpha = 0.05)


47

Abb. 11 Konidienproduktion (kumuliert aus Daten der Tabelle 8) von Mf auf verschiedenen Nährmedien im Verlaufe der Inkubationsperiode

Die Produktion von Konidien ist in starkem Maße abhängig von der Zusammensetzung des verwendeten Nährmediums, wobei auf dem komplexen Substrat M-1D in der Phase zwischen 10 und 35 dpi die höchste Produktion erreicht wurde. Auf dem unter Verwendung von Bananenblattextrakten ohne weitere Nährstoffquellen zubereiteten Medium wurde eine konzentrationsabhängige (Musa 50% >> Musa 12.5%) Konidienproduktion ermittelt, die aber ebenso wie auf GPA und SNA deutlich unter dem auf M-1D erreichten Niveau verblieb. Insgesamt ist die starke Abnahme produzierter Konidien auf allen getesteten Nährböden zum Ende des Versuchszeitraumes offensichtlich. Aus diesem Grund wurden die Inokulationen flüssiger Nährmedien sowie die Infektion von Musa-Blattgewebe mit Myzelpräparationen durchgeführt.

Die flächenhafte Ausdehnung von Mf auf Nährböden ist auch bei Verwendung von Konidien als Inokulumquelle nur sehr gering (Abbildung 12), das Myzel wächst vielmehr kompakt in vertikaler Richtung mit hellgrauen bis dunkelbraunen Lufthyphen und sehr dunklem Grundmyzel.


48

Abb. 12 Myzelverteilung von Mf-HON auf verschiedenen Nährböden (50 dpi)

Der Wirkstoff Trizyclazol® bewirkt in steigenden Dosen (10 und 1000 µM) eine je nach Mf-Isolat unterschiedliche Verfärbung des unmittelbar dem Myzel anliegenden Nährbodens (Abbildung 13); die intensivste Verfärbung wurde bei den Isolaten HON, 294 und 309 festgestellt. Der Biomassezuwachs ist auf dem mit 1000 µM Tricyclazol® enthaltendem PDA bei allen Isolaten deutlich reduziert.

Abb. 13 Myzelwachstum von Mf-Isolaten und Farbreaktion auf PDA mit verschiedenen Konzentrationen von Trizyclazol® (oben: ohne; Mitte: 10; unten: 1000 ppm Tricyclazol)


49

Der Zuwachs an Trockenmasse sowie der pH-Wert bei Inkubation von Mf in flüssigem M-1D- Nährmedium wiesen folgende Entwicklung in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen auf:

Abb. 14 Entwicklung der Myzeltrockenmasse im Verlauf der Inkubation von Mf -NIG in M-1D-Nährmedium bei Verwendung unterschiedlicher Kulturgefäße (System A: flaches Kulturgefäß, Luftaustausch, gute Durchmischung; System B: Rundkolben, Luftabschluß, geringe Durchmischung); n = 4, Inokulationsgewicht = 225 mg.

Abb. 15 Entwicklung des pH-Wertes im Verlauf der Inkubation von Mf -NIG in M-1D-Nährmedium bei Verwendung unterschiedlicher Kulturgefäße (System A, B: siehe Abbildung 14; Kontrolle: nicht inokuliert); n = 4, Inokulationsgewicht = 225 mg.


50

Bezüglich des Einsatzes von 10 µM Tricyclazol® ist keine Beeinflussung der Trockenmassezunahme oder des pH-Wertes von Mf-Nährsuspensionen feststellbar. Bei geringer Luftversorgung zeigt die Zunahme der Trockenmasse einen annähernd linearen Verlauf bis zum Ende der Inkubationsperiode, wohingegen eine intensivere Versorgung mit Luft zu einer starken Zunahme in den ersten 18 Tagen führt. Die Myzelmasse am Ende der Inkubationsperiode übersteigt das Inokulumgewicht bei geringer Luftzufuhr um den Faktor 100, mit intensiver Luftzufuhr um den Faktor 200. Der pH-Wert der Kulturfiltrate sinkt ohne weitere Luftzufuhr in der ersten Phase der Inkubation um pH 0.5, bei Gefäßen mit Luftaustausch steigt der pH-Wert auf bis zu 7.7 am Ende der Inkubationsperiode von 45 Tagen.

4.2.2. Sekundärmetaboliten des Pentaketid-Biosyntheseweges

4.2.2.1. Probenaufbereitung durch TLC, SPE und HPLC

Die Gesamtausbeute an nicht weiter verdampfbarem Rohextrakt von Mf betrug nach 35 Tagen zwischen 35 bis 38 mg l-1 bei dreimaliger Extraktion mit Ethylacetat (1:1 v/v). Die Auftrennung der Rohextrakte erfolgte zunächst durch TLC (System A, siehe Anhang, Tabelle 17), wodurch eine Quantifizierung einzelner Substanzen allerdings nicht in hinreichendem Maße erreicht werden konnte.

Abb. 16 Trennung von Rohextrakten aus Mf-Kulturfiltraten durch TLC (System A):
a. Tageslicht (mit Auswertungsnotizen); b. UV-Licht, lambda = 254 nm

Um die Substanzen des Pentaketid-Biosyntheseweges ohne aufwendige und verlustbehaftete Transfers von der TLC-Silicaschicht in die HPLC zu erfassen, wurde eine Methode der Festphasenextraktion (SPE) zur Aufreinigung der Proben entwickelt: Die Ergebnisse der getesteten Systeme mit unterschiedlichen stationären und mobilen Phasen sind in Abbildung 17 dargestellt.


51

Abb. 17 Elution der Pentaketidmetaboliten 1,5-DHN und Juglon zur Bewertung der untersuchten Festphasensyteme (ODS = Oktadecylsilan, CN-U = Cyanopropylsilan, NH2 = Aminopropyl-silan, SiOH = Silica): Anteil wiedergewonnener Substanzen in den verschiedenen Stufen der Festphasenextraktion (¦ 1,5-DHN, ¦ Juglon); weitere Angaben im Text

Zur Methodenentwicklung wurden die beiden Testsubstanzen 1,5-Dihydroxynaphtalin (1,5-DHN) und Juglon aufgrund ihrer Retentionszeiten im HPLC-System A (siehe Anhang, Tabelle 19: tR [1,5-DHN] = 10.9 min, tR [Juglon] = 18.6 min) als repräsentativ für die relevanten Pentaketidmetaboliten aus Mf ausgewählt. Dabei erwies sich das Normalphasensystem unter Verwendung von Aminopropylsäulen (NH2) als geeignet für die weitere Analyse, da beide Substanzen in der letzten Elutionsstufe gemeinsam mit der mobilen Phase Methanol eluiert wurden. Alle folgenden Ergebnisse wurden unter Anwendung von SPE-NH2 durchgeführt, wobei im Anschluß an die Auswaschung mit Hexan die Analyte sofort mit Methanol eluiert wurden. Eine synoptische Darstellung der Gewinnung, Reinigung, Trennung und Weiterverwendung der Mf-Metaboliten aus Kulturfiltraten ist im Anhang (Abbildung 45) enthalten.

Die folgende Tabelle faßt die Ausbeute an Rohextrakten und ausgewählten Metaboliten in den verschiedenen Stufen der Aufbereitung zusammen.


52

Tab. 9 Gewinnung von Rohextrakten aus Nährlösungen von Mf-CAM und Gehalt ausgewählter Sekundärmetaboliten in verschiedenen Stufen der Probenaufbereitung

Extraktionsschritt

Rohextrakt

2,4,8-THT

Juglon

mg l-1

kum. %

µg l-1

kum. %

µg l-1

EtOAc 1

23,7

66,4

246,4

95,3

1,1

EtOAc 2

7,1

86,4

11,8

99,7

n.n.

EtOAc 3

3,1

94,9

0,77

100,0

n.n.

% des Gesamtgehaltes im Rohextrakt

SPE: NH2

98 - 100

90 - 95

TLC: Silica

40 - 50

n.n.

HPLC-Reinjektion

88 - 96

n.n. = nicht nachgewiesen

Der Übergang des Analyten 2,4,8-THT aus der wässerigen in die organische Phase betrug K (Nernst´sche Konstante) = 19; aufgrund dieses Ergebnisses wurden die Mf-Kulturfiltrate zweimal mt EtOAc extrahiert und damit 99.7 % des gesamten in der Probe enthaltenen Metaboliten 2,4,8-THT gewonnen.

Die nachfolgend dargestellten HPL-Chromatogramme von Mf-Extrakten nach SPE-NH2 sowie die spektrographischen Kennwerte von 2,4,8-THT belegten die methodische Validität sowie den Reinheitsgrad der verwendeten Substanzen.


53

Abb. 18 HPL-Chromatogramme eines Mf-Extraktes nach SPE-NH2 :
a. Inokulierte Nährsuspension (ÄÄÄÄ) und nicht inokulierte Kontrolle (-------) nach 45 Tagen Inkubation;
b. Ergebnis der Subtraktion (inokuliert minus Kontrolle)


54

Tab. 10 Peakbericht des HPL-Chromatogrammes (Abbildung 18b) aus Mf-Extrakten mit identifizierten Substanzen und chromatographischen Kennwerten

Abb. 19 HPL-Chromatogramm und spektrale Kennwerte von 2,4,8-THT:
a. UV-Spektrogramm von 2,4,8-THT (UV-Scan des HPLC-Detektors, ca. 20 % MeCN);
b. Peakreinheit nach Reinjektion von tR = 9.45min


55

Die weiteren isolierten Metabolite aus Mf-Rohextrakten sowie die Produkte der Thiele-Winter-Reaktion aus Juglon wurden anhand ihres Retentionsverhaltens und ihres UV-Absorptionsspektrums den in folgender Tabelle genannten Substanzen zugeordnet:

Tab. 11 Chromatographische und photometrische Charakterisierung von Hydro- und Naphto-chinonen des Pentaketid-Metabolismus von Mf

Substanz

Summenformel

MW

TLC

HPLCc .

lambdamax .

Da

Rf

tR

(ki)d

alphae

(nm)

2,4,8-Trihydroxytetralon

C10H10O4

194

0.34a

9.45

3.5

214, 260, 331

1.46

Flaviolin

C10H6O5

206

-

12.8

5.1

275, 325

1.02

3-Hydroxyjuglon

C10H6O4

190

0.40b

13.2

5.2

240, 280, 420

1.23

2-Hydroxyjuglon

C10H6O4

190

0.67b

15.6

6.4

285,425

1.23

Juglon

C10H6O3

174

0.87a

18.6

7.9

250, 330, 428

a TLC-System A (siehe Anhang, Tabelle 18)

b TLC-System D (siehe Anhang, Tabelle 18)

c HPLC-System A (siehe Anhang, Tabelle 19)

d Kapazitätsfaktorberechnung ki = ti - t0 / t0 , mit t0 = 2.10 min (Thioharnstoff)

e Selektivitätskoeffizient alpha = k2 / k1 (k2>k1)

4.2.2.2. Massenspektrometrische Identifikation

Die weitere Zuordnung der durch TLC oder HPLC getrennten Substanzen der Mf-Rohextrakte erfolgte durch Massenspektrometrie (MS) sowie deren Kopplung mit Gaschromatographie (GC-MS).

Nach TLC-Trennung, Wiederaufnahme in Lösungsmittel und Vakuumverdampfung mehrerer Substanzflecken konnte die in TLC-System A bei Rf = 0.34 detektierte Fraktion als 2,4,8-Trihydroxytetralon (2,4,8-THT) mit einer Masse (m/z) von 194.05 und einer Ausbeute von 14.8 % identifiziert werden; weitere deutliche Massepeaks, etwa bei m/z = 176.0, können als Fragmente des 2,4,8-THT (Wasserabspaltung) interpretiert werden (siehe Abbildung 20).

Eine weitere Auftrennung und MS-Bestimmung des durch TLC vorgereinigten Extraktes erfolgte durch die Koppelung GC/MS nach Derivatisierung der Substanzen mit BSTFA. Dabei entstanden die in Abbildung 21 detektierten Fragmente des 2,4,8-THT.


56

Abb. 20 Massenspektrogramm bei 160°C (t = 2.2 min) eines TLC-Spots (Rf = 0.34) aus Mf-Rohextrakten

Abb. 21 Massenspektrogramm der GC/MS-Kopplung bei tR = 8.95 (Probe mit BSTFA derivatisiert, TLC-getrennt) aus Mf-Rohextrakten

Durch die Anwendung von MS und deren Kopplung mit GC konnte die Identifizierung der Substanzen, die hinsichtlich ihres HPLC-Retentionsverhaltens sowie ihrer UV-spektralen Kennwerte mit den Angaben in der Literatur übereinstimmten, bestätigt werden. Darüber hinaus haben die ermittelten Massenspektren das Vorhandensein von methodenbedingten Fragmenten sowie von Nebenprodukten unbestimmter Art und Menge erwiesen, die bei der Interpretation zu berücksichtigen sind.


57

4.2.2.3. Gehalte an Pentaketid-Metaboliten von Mf unter in vitro-Bedingungen

Zur Charakterisierung der verschiedenen Mf-Isolate mit erwiesener Pathogenität gegenüber anfälligen Sorten von Musa sp wurden diese in flüssigem M-1D-Nährmedium ohne weitere Luftzufuhr inkubiert und ihr Endgehalt an 2,4,8-THT bestimmt. Die einer Behandlung zugeordneten Wiederholungen (n = 3) wurden zur Extraktion, Probenaufbereitung und Analyse der pilzlichen Substanzen zusammengefaßt und mehrmals HPL-chromatographisch quantifiziert, wobei die chromatographische Abweichung vom Mittelwert jeweils < 5 % verblieb. Der ermittelte Gehalt an ausgewählten Sekundärmetaboliten wurde auf die Trockenmasse des Pilzes bzw. auf das Inkubationsvolumen der Nährlösung auf molarer Basis bezogen:

Abb. 22 2,4,8-THT-Gehalt (µg g-1 DW) und -Konzentration (nM) in Kulturfiltraten verschiedener Mf -Isolate nach 45 Tagen Inkubationsdauer mit M-1D-Nährlösung

In allen geprüften Mf-Isolaten wurde 2,4,8-THT nachgewiesen, wobei unterschiedliche Konzentrationen nach einer Inkubationsdauer von 45 Tagen bei den Mf-Isolaten 294 und HON zwischen 205 und 786 nM ermittelt wurden. In Abhängigkeit von dem Zuwachs an Myzelmasse, die bei den Isolaten 294 und 309 deutlich erhöht war, wurden 2,4,8-THT-Gehalte zwischen 25 (Mf-294) und 375 (Mf-OSHO) µg g-1 DW nachgewiesen.

Um die Dynamik der in vitro-Synthese von 2,4,8-THT zu untersuchen, wurden Nährsuspensionen des Mf-Isolates NIG inkubiert und die Konzentrationen weiterer Metabolite des Pentaketid-Biosysntheseweges (Flaviolin, 2-HJ und Juglon) nach unterschiedlicher Inkubationsdauer bestimmt (siehe Abbildung 23).


58

Abb. 23 Konzentrationen verschiedener Pentaketid-Metaboliten in Kulturfiltraten von Mf-NIG im Verlauf der Inkubationsdauer in M-1D-Nährlösung

2,4,8-THT war innerhalb von sechs Tagen nach Inokulation nachweisbar und erreichte schon nach zwölf Tagen Inkubationsdauer ein Maximum von 1050 pM. Flaviolin als Zwischenprodukt des Pentaketidmetabolismus zeigte die gleiche Dynamik von hohem Anfangsgehalt und leichtem Absinken auf wechselnde Werte im Verlaufe der Inkubation. Die beiden Zwischenprodukte 2-Hydroxyjuglon (2-HJ) und Juglon wurden im gesamten Untersuchungszeitraum nur in sehr geringen Mengen (Juglon < 8 nM) nachgewiesen. Die Inkubation in verschiedenen Kulturgefäßen mit unterschiedlicher Durchmischung und erhöhter Luftzufuhr hatte keine feststellbare Wirkung auf die Gehalte an untersuchten Metaboliten.

Zur Steigerung des Gehaltes an 2,4,8-THT in Mf-Nährsuspensionen wurde der Wirkstoff Tricyclazol® in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Die 2,4,8-THT-Konzentrationen der Kulturfiltrate verschiedener Mf-Isolate unter Zugabe von 53.2 µM wurden in Beziehung gesetzt zu den Ergebnissen ohne Einsatz des Wirkstoffes (siehe Abbildung 24):


59

Abb. 24 Prozentuale Gehalte (mg g-1DW) und Konzentrationen (nM) an 2,4,8-THT in Nährsuspen-sionen verschiedener Mf-Isolate bei Anwendung von 53.2 µM Tricyclazol nach 45 Tagen Inkubationsdauer in M-1D-Nährlösung, relativ zur unbehandelten Kontrolle

Alle Mf-Isolate reagierten auf die Anwendung des Wirkstoffes Tricyclazol® mit einer Erhöhung der 2,4,8-THT-Konzentration im Kulturfiltrat und des Gehaltes bezogen auf die Trockenmasse. Bei Isolat 294 stieg die Konzentration um den Faktor 14, wohingegen in den anderen Isolaten eine Verdoppelung bis Verdreifachung ermittelt wurde. Das Ausmaß der gesteigerten 2,4,8-Konzentration bei Mf-294 war auch das Ergebnis der nur geringen Konzentration des Metaboliten in Kulturfiltraten ohne den Wirkstoff (siehe Abbildung 22).

In Abhängigkeit von der Tricyclazol®-Konzentration wiesen die Gehalte an Pentaketid-Metaboliten den in Abbildung 25 dargestellten Verlauf auf. Die Konzentrationen von 2,4,8-THT und Flaviolin in der Nährlösung stiegen mit zunehmender Tricyclazol®-Dosis bis 1000 µM an, bei weiterer Erhöhung auf 2000 µM war keine weitere Steigerung der Konzentrationen an Pentaketid-Metaboliten zu erreichen. Die beiden Zwischenprodukte 2-HJ und Juglon zeigten keine Veränderung bei den untersuchten Wirkstoffkonzentrationen und verblieben auf dem ohne Tricyclazol®-Zugabe erreichten Niveau.


60

Abb. 25 Konzentrationen verschiedener Pentaketid-Metaboliten in Nährsuspensionen von Mf-294 bei verschiedenen Dosen des Wirkstoffes Tricyclazol® nach 45 Tagen Inkubationsdauer in M-1D-Nährlösung

Die Wirkung von Tricyclazol®-Behandlungen auf die Konzentrationen von 2,4,8-THT und Flaviolin ließ einen Zusammenhang zwischen beiden Metaboliten vermuten, der durch die

lineare Regressionsgerade y = 0.24 + 0.82 x

beschrieben wird. Der Korrelationskoeffizient zwischen den Gehalten betrug r² = 0.894 (siehe Abbildung 26).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß in allen untersuchten Mf-Isolaten unter in vitro-Bedingungen der Pentaketidmetabolit 2,4,8-THT nachgewiesen werden konnte. Durch den Einsatz des Wirkstoffes Tricyclazol® war darüber hinaus eine bedeutende Steigerung der 2,4,8-THT-Konzentration festzustellen. Auch der Gehalt des Zwischenproduktes Flaviolin wurde durch den Wirkstoff gesteigert und legte einen engen Zusammenhang im Pentaketid-Biosyntheseweg zwischen beiden Metaboliten nahe. Die beiden Zwischenprodukte 2-HJ und Juglon waren nur in geringen Mengen nachweisbar und konnten durch Tricyclazol® in den untersuchten Konzentrationen nicht gesteigert werden.


61

Abb. 26 Korrelation zwischen den Konzentrationen von Flaviolin und 2,4,8-THT in Kulturfiltraten von Mf (Mittelwert ± Konfidenzintervall 95 %)

4.3. Interaktion Musa cv - Mf

4.3.1. Symptomentwicklung in Musa cv-Blattgewebe nach Mf-Inokulation

Zur Charakterisierung der Interaktion zwischen verschiedenen Musa cv und Mf-Isolaten unter den beschriebenen Bedingungen eines künstlichen Inokulationssystems wurde Myzelsuspension auf die Unterseite einer Blatthälfte aufgetragen und eine hohe Luftfeuchte sichergestellt. Die Bonitur der Krankheitssymptome erfolgte periodisch auf der Grundlage der von Fullerton und Olsen (1995) aufgestellten Stadien und orientierte sich an den jeweils am weitesten fortgeschrittenen Symptomen auf der inokulierten Blattspreite (Abbildung 27 und 28).


62

Abb. 27 Symptomausprägungen der Schwarzen Sigatokakrankheit auf inokulierten Blatthälften von Musa cv Yangambi km 5 (oben: 16 dpi, Stadium 1) und Dominico Hartón (zweite von oben: 25 dpi, Stadium 2; zweite von unten: 32 dpi, Stadium 3; unten: 40 dpi, Stadium 4); Stadien nach Fullerton und Olsen (1995)


63

Abb. 28 Entwicklung der Krankheitssymptome auf verschiedenen Musa cv nach Inokulation mit Myzel des Mf-Isolates NIG unter Klimakammer-Bedingungen (Mittelwerte, n = 5)

Die empfindliche Sorte Dominico Hartón wies erste Symptome auf der Blattunterseite ab dem 12. Tag nach Inokulation (dpi) auf, die sich bis 32 dpi zu einer flächendeckenden Chlorose und beginnender Nekrotisierung auf Blattober- und Unterseite entwickelten. Das Absterben von Blattgewebe erfaßte bis 50 dpi fast die gesamte Blattspreite, war aber in diesem Stadium unter den gegebenen Bedingungen auch von der natürlichen Seneszens mitbeeinflußt. Die resistente Sorte Yangambi km 5 zeigte eine ähnliche Anfangsentwicklung bis etwa 28 dpi, wobei kleinräumige nekrotische Läsionen (Durchmesser < 3 mm) auftraten, die durch die Skalierung von Fullerton und Olsen (1995) jedoch nicht erfaßt wurden; danach verblieben die Flecke ohne weitere Ausdehnung. Bei der partiell resistenten Sorte Cachaco verlief die Pathogenese insgesamt langsamer als bei Dominico Hartón und führte erst nach 21 dpi zu ersten Symptomen; das chlorotische Stadium 3 wurde erst nach 45 dpi erreicht, die sich entwickelnden Nekrosen gingen in die altersbedingte Seneszens über.

Damit ist die unter Feldbedingungen ermittelte Reaktion der untersuchten Musa cv gegenüber dem Erreger Mf auch unter kontrollierten Bedingungen in der Klimakammer und unter Verwendung von Myzel als Inokulumquelle reproduzierbar. Die Klassifizierung der drei verwendeten Sorten in die Phänotypen S (anfällig), PR (teilweise resistent) und HR (hochgradig resistent, Hypersensitivitätsreaktion) bildete die Grundlage für die weitere experimentelle Untersuchung der Wirtsreaktionen.


64

Die Symptomausprägung bei Inokulation mit den Mf-Isolaten CAM, OSHO, 294 und 309 wies keine signifikanten Unterschiede zum dargestellten Krankheitsverlauf bei Mf-NIG auf. Ausgewählte Isolate wurden während der gesamten Untersuchungsperiode in Abständen auf ihre Pathogenität und Virulenz gegenüber Musa sp überprüft, ohne eine Veränderung des pilzlichen und pflanzlichen Materials unter in vitro-Bedingungen festzustellen.

Bei der Anwendung des Wirkstoffes Tricyclazol® auf Mf-inokulierte Musa cv unter in vivo-Bedingungen in der praxisüblichen Konzentration von 4.0 mM traten folgende Symptome auf:

Abb. 29 Symptomausprägung auf Musa cv Cachaco 8 dpi mit Mf-Myzel: a. Anwendung von 4.0 mM Tricyclazol® auf inokulierte Blatthälfte; b. Kontrolle (inokuliert ohne Tricyclazol)

Bei allen drei mit Mf-Myzel inokulierten Musa cv führte die Anwendung von Tricyclazol unter in vivo-Bedingungen zu einer Nekrotisierung weiter Teile der Blattspreite innerhalb von 8 dpi (Abbildung 30). Die Symptome beschränkten sich dabei nicht nur auf die behandelte Blatt-spreite, sondern waren auch auf der gegenüberliegenden Seite der Mittelrippe deutlich ausgeprägt. Auf dem rasch abgestorbenen Blattgewebe kam es zu keiner Entwicklung des Pilzes, so daß es trotz der nekrotischen Symptome in allen drei Bananensorten nicht zur Pathogenese kam.


65

Abb. 30 Entwicklung der Krankheitssymptome auf verschiedenen Musa cv nach Inokulation mit Myzel des Mf-Isolates NIG unter Klimakammer-Bedingungen (Mittelwerte, n = 4) bei Anwendung des Wirkstoffes Tricyclazol® (4.0 mM, im Vergleich inokulierte Kontrolle ohne Wirkstoff)


66

4.3.2. Mikroskopische Untersuchungen infizierter Musa-Kalli

Zur histologischen Charakterisierung des Kontaktraumes zwischen pilzlichem Myzel und pflanzlichem Gewebe wurden Kalli der Sorten Yangambi km 5 und Cachaco oberflächlich inokuliert (Mf-Isolat NIG) und gemeinsam inkubiert. Dabei zeigte das Myzel auf Cachaco ein deutliches Wachstum auf der Oberfläche des Kallus und bildete weitreichende Hyphen in den tieferliegenden Bereichen. Das Mf-Inokulum auf Yangambi km 5 dagegen wuchs nur sehr langsam und verblieb als oberflächlich aufliegendes Polster auf dem Kallus.

Die licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen der Kalli zeigten den engen räumlichen Kontakt zwischen den Pilzhyphen und den pflanzlichen Zellen: Die intakten Zellwände von beiden Organismen lagen dabei sehr dicht beieinander, ohne sich jedoch gegenseitig erkennbar zu beeinträchtigen (Abbildung 32): Im Falle der Sorte Cachaco nahm die Nekrotisierung des Kallus, ausgehend von der Inokulationsstelle des Myzels, langsam zu, wobei die Pilzhyphen auch in Bereichen abgestorbener Wirtszellen ihre Funktionsfähigkeit erhielten (Abbildung 32 a, b: Zellkern, Mitochondrien, Glycogen und Lipide sichtbar). Bei Yangambi km 5 bildeten die nekrotischen Zellen unterhalb des Pilzmyzels nur eine schmale Schicht, unterhalb der nur noch wenige kollabierte Hyphenzellen nachweisbar waren (Abbildung 32 c, d).

Abb. 31 Mf-inokulierter Kallus von Musa cv Cachaco nach 3 Wochen Inkubationszeit:
a. Gesamtansicht (Vergr. 10x, Balkenlänge = 1 mm);
b. Semidünnschnitt des Kontaktbereiches Kallus/Mf (Vergr. 200x, Balkenlänge = 100 µm)

Die Untersuchungen konnten an Kalli der Sorte Dominico Hartón nicht durchgeführt werden, da deren umfangreiche Verbräunung nach kurzer Inkubationszeit auch ohne Inokulation mit Mf keine hinreichende Voraussetzung zur Nutzung als Substrat für das Pilzmyzel bot.


67

Abb. 32 TEM Mf-inokulierter Kalli von Musa cv Cachaco (a, b) und Yangambi km 5 (c, d)

>

(Cz Kalluszelle; F Pilzhyphe; Gy Glykogen; L Lipid; M Mitochondrien; My Pilzmyzel; N Nukleus; PW pflanzliche Zellwand; Vergr. 13´000x, Balkenlänge 1 µm)


68

4.3.3. Einfluß von Mf-Extrakten und -Metaboliten auf Musa cv

Um den Einfluß ausgewählter Sekundärstoffe des pilzlichen Metabolismus auf verschiedene Musa cv und deren Funktion und Spezifität innerhalb der Pathogenese zu untersuchen, wurden die pflanzlichen Gewebe mit verschiedenen Mf-Extrakten sowie deren Fraktionen nach Auftrennung durch SPE und HPLC behandelt. Jede Behandlung erfolgte unter Anwendung der ”leaf-puncture-wound overlay technique“ auf dem jüngsten Blatt von 4 Bananenpflanzen in jeweils dreifacher Wiederholung; der Durchmesser der entstehenden nekrotischen Flecke wurde nach 48 Stunden vermessen.

Abb. 33 Anwendung der ”leaf-puncture-wound overlay technique“ (Stierle et al 1991, 1992) auf Musa sp: a. Feuchte Kammer zur Inkubation; b. nekrotische Flecken durch Juglon in verschiede-nen Konzentrationen auf Musa cv Dominico Hartón (K = Kontrolle, n = 3)

Zunächst wurden die aus den Kulturfiltraten von Mf gewonnenen Rohextrakte ohne weitere Fraktionierung verwendet; der Gehalt an 2,4,8-THT im Rohextrakt entsprach ungefähr 5 mM, Juglon war mit HPLC nicht nachweisbar (Abbildung 34).


69

Abb. 34 Nekrotische Flecken auf Blattgewebe verschiedener Musa cv 48 Stunden nach Anwendung von Mf-Rohextrakten mit der ”leaf-puncture-wound overlay technique“

Die durch die ethanolische Lösung (5 % v/v) und die mechanische Beanspruchung bedingte Verletzung verblieb bei allen Sorten unter 0.5 mm pro ”puncture“. Die angewendeten Rohextrakt-Konzentrationen zeigten eine deutliche Dosis-Wirkungsbeziehung in allen drei Musa cv, allerdings wies die PR-Sorte Cachaco eine im Vergleich zu beiden anderen Sorten leicht geringere Sensitivität auf. Die Größe der nekrotischen Flecken einerseits und der HPL-chromatographisch ermittelte Gehalt an 2,4,8-THT andererseits waren Hinweise für das Vorhandensein weiterer Nekrose-induzierender Substanzen in den Rohextrakten.

Zur Untersuchung der Spezifität weiterer Mf-Substanzen gegenüber Musa cv wurde die in der SPE-Probenvorbereitung gewonnene Fraktion der Spülung mit Hexan, die die apolaren Bestandteile des Rohextraktes enthielt, ebenfalls auf die Blätter der drei Sorten appliziert; im Extrakt waren keine Pentaketid-Metaboliten aus Mf nachweisbar (Abbildung 35).


70

Abb. 35 Nekrotische Flecken auf Blattgewebe verschiedener Musa cv 48 Stunden nach Anwendung von Mf-Extrakten aus der SPE-Spülung (Hexan) mit der ”leaf-puncture-wound overlay technique“

Die Wirkung der durch Hexanspülung gewonnenen Extrakte war bei gleichen Konzentrationen wie die der Rohextrakte durch ein deutlich geringeres Ausmaß an Nekrosen gekennzeichnet. Die Sorten Dominico Hartón und Yangambi km 5 wiesen in der angewendeten Höchstdosis von 100 µg 5 µl-1 höhere Sensitivitäten gegenüber dem applizierten Extrakt auf als Cachaco.

Zur Untersuchung ausgewählter Mf-Sekundärmetaboliten wurden die in der SPE-Aufreinigung durch Elution mit Methanol gewonnenen Extrakte durch HPLC fraktioniert und die beiden Substanzen 2,4,8-THT und Juglon getrennt appliziert. 2,4,8-THT wies einen Reinheitsgrad von 88 bis 96 % (w/v) auf (Detektion bei lambda = 254 nm), bei Juglon werden vom Hersteller ”approx. 95 %“ angegeben. Aus den Ergebnissen der Anwendung von 2,4,8-THT in verschiedenenen Konzentrationen auf die drei Musa cv (Abbildung 36) ließen sich sortenspezifische Dosis-Wirkungsbeziehungen ableiten, die in Abbildung 37 und Tabelle 12 dargestellt sind.


71

Abb. 36 Nekrotische Flecken auf Blattgewebe verschiedener Musa cv 48 Stunden nach Anwendung von 2,4,8-THT aus Mf-Rohextrakten mit der ”leaf-puncture-wound overlay technique“ (Applikationsmenge jeweils 5 µl)

Abb. 37 Dosis-Wirkungsbeziehungen von 2,4,8-THT auf verschiedene Musa cv und sortenspezifische Konzentrationen zur Erzeugung eines nekrotischen Fleckes von 1.0 mm Durchmesser


72

Die nekrotische Wirkung des 2,4,8-THT bei Anwendung der ”leaf-puncture technique“ auf Blattgewebe war ab einer Konzentration von 0.1 mM (Tropfenvolumen 5 µl) nachweisbar. Die Beziehung zwischen Dosis und Wirkung war bei der anfälligen Sorte Dominico Hartón stärker ausgeprägt als bei der HR- bzw. PR-Sorte Yangambi km 5 und Cachaco. Die folgende Tabelle faßt die Parameter der potenzierten Regressionsgleichung sowie die sortenspezifischen Selektivitätsindizes (Wirkung von Substanzen auf anfällige vs resistente Pflanzengewebe, Wheeler 1981) für die Anwendung von 2,4,8-THT auf die drei Musa cv zusammen:

Tab. 12 Statistische Kennwerte der Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen 2,4,8-THT und Blattnekrosen auf den verschiedenen Musa cv

Musa cv

Konstante

(a)

Steigungs-faktor

(b)

Korrelations-koeffizient

(r²)

Standard-abweichung

(SD)

Selektivitäts-Index

(Wheeler 1981)

Dominico Hartón

-0.337

0.133

0.682

0.224

-

Cachaco

-0.425

0.106

0.366

0.171

4.47

Yangambi km 5

-0.359

0.087

0.667

0.133

7.44

Potenzierte Regression: ln (y) = a + b ln (x), mit x = 2,4,8-THT (mM), y = Blattnekrose (Durchmesser[mm])

Ein Vergleich des Steigungsfaktors (b-Wert) zeigte einen geringeren Anstieg der Dosis-Wirkungsbeziehung bei zunehmenden Konzentrationen des Mf-Metaboliten 2,4,8-THT in der Reihenfolge Dominico Hartón, Cachaco und Yangambi km 5, der auf eine abnehmende Sensitivität resistenter Musa cv gegenüber hohen Konzentrationen hinwies. Beispielhaft ist die Dosis zur Erzeugung einer Nekrose von 1.0 mm Durchmesser extrapoliert: Dominico Hartón (12.5 mM) vs Cachaco (55.9 mM) vs Yangambi km 5 (93.0 mM). Die Selektivitätsindizes von Dominico Hartón gegenüber der PR- bzw. HR-Sorte entsprachen 4.47 bzw. 7.44.

Die Applikation von Juglon (siehe Abbildung 38) führte ab 0.5 mM zu deutlichen nekrotischen Wirkungen. Ebenso wie im Falle des 2,4,8-THT weist die Sorte Yangambi km 5 im Vergleich zu Dominico Hartón und Cachaco eine geringere Steigung der Dosis-Wirkungsbeziehung auf, der bei einer Konzentration von 500 mM am stärksten ausgeprägt war. Die Selektivitätsindizes verblieben aber deutlich unterhalb von 10.


73

Abb. 38 Nekrotische Flecken auf Blattgewebe verschiedener Musa cv 48 Stunden nach Anwendung von Juglon mit der ”leaf-puncture-wound overlay technique“ (Applikationsmenge jeweils 5 µl)

Beide Pentaketide aus Mf (2,4,8-THT und Juglon) verursachten bei gleicher Konzentration (auf molarer Basis) Blattflecken vergleichbarer Ausdehnung. Hinsichtlich der Wirtsspezifität gegenüber Mf- Metaboliten waren Unterschiede zwischen verschiedenen Musa cv feststellbar, wobei die resistente Sorte Yangambi km 5 eine geringere Sensitivität gegen 2,4,8-THT (Abbildung 36) und vor allem gegen Juglon (Abbildung 38) aufwies. Die geringere Empfindlichkeit von Yangambi km 5 gegenüber Mf-Metaboliten wurde bei höheren Konzentrationen der untersuchten Pentaketide besonders deutlich.

Um den Einfluß der Blattmorphologie der verschiedenen Musa cv auf die nekrotische Wirkung durch pilzliche Metaboliten zu vermindern, wurde die ”leaf-disk infiltration technique“ nach Lepoivre und Acuna (1990) angewendet (Abbildung 39). Die Leitfähigkeit der nach 24 Stunden Inkubation mit Blattstücken verschiedener Musa cv gemessenen Lösungen diente als Maß für die irreversible Schädigung der Zellen im Gewebe und zeigte die in Abbildung 40 dargestellten Ergebnisse.

Die Messung der Leitfähigkeit in Probelösungen bis zu der Höchstkonzentration von 28.8 M Juglon zeigte bei allen Musa cv Maximalwerte deutlich unterhalb der durch Kälteeinwirkung hervorgerufenen Zellzerstörungen. Dabei konnte bei Dosen über 288 mM keine wesentliche Erhöhung bzw. sogar eine leichte Verminderung der Leitfähigkeit ermittelt werden. Die Sensitivität der Sorte Yangambi km 5 war in allen angewendeten Dosen höher als die der beiden anderen Musa cv; Cachaco zeigte sich gegenüber hohen Juglonkonzentrationen vergleichsweise insensitiv, wohingegen die Mf-anfällige Dominico Hartón eine Zunahme der Leitfähigkeit bis zu der angewendeten Höchstdosis von Juglon aufwies.


74

Abb. 39 Nekrose auf Blattstücken verschiedener Musa cv nach Einwirkung von Juglon unter Anwendung der ”leaf-disk infiltration technique“ (Lepoivre und Acuna 1990)

>

Abb. 40 Leitfähigkeit verschiedener Musa cv nach Vakuuminfiltration und Inkubation mit Juglon-lösungen verschiedener Konzentrationen

Insgesamt belegten die Ergebnisse der Versuche unter Anwendung verschiedener Applikationstechniken mit isolierten Mf-Metaboliten die starke Abhängigkeit der Wirkungen auf Blattgewebe von der angewendeten Methode.


75

4.3.4. Einfluß von Musa cv auf Mf-Metaboliten

Zur Untersuchung der Wirkungen von Pflanzeninhaltsstoffen auf den Sekundärmetabolismus von Mf wurde der Interzellularraum des nichtinfizierten Blattgewebes verschiedener Musa cv durch Vakuuminfiltration extrahiert und die gewonnenen wässerigen Kulturfiltrate als Nährlösung für den Pilz angesetzt (vgl. Abschnitte 3.1.3 und 3.2.1). Damit wurde unter in vitro-Bedingungen ein System etabliert, das dem trophischen Verhältnis des Pilzes zum Zeitpunkt der Inokulation und beginnenden Infektion im Interzellularraum nahekommt und die Wirt-Pathogeninteraktionen in dieser ersten Phase des Zusammentreffens reflektiert; die gewählte Mf-Inkubationsdauer von 12 Tagen bildete die notwendige Zeitspanne zum Nachweis pilzlicher Metaboliten in der Nährlösung. Die durch den Pilz hervorgerufenen postinfektionellen Reaktionen der Pflanze konnten durch die Wahl der pflanzlichen Extrakte aus präinfektionellem Blattgewebe ausgeschlossen werden.

Die chromatographische Analyse der aus Musa cv gewonnenen und nach Inkubation mit Mf extrahierten Kulturfiltrate, die pflanzliche und pilzliche Substanzen enthielten, wurde durch die erhöhte Peakdichte und die dadurch verursachte fehlende Basislinientrennung beeinträchtigt. Der pilzliche Sekundärmetabolit 2,4,8-THT konnte aber mit hinreichender Sicherheit getrennt und quantifiziert werden; die in den untersuchten Behandlungen festgestellten Konzentrationen des Mf-Metaboliten 2,4,8-THT (siehe folgende Abbildung) ermöglichten eine eindeutige Interpretation der Ergebnisse.

Abb. 41 Konzentration des Sekundärmetaboliten 2,4,8-THT im Kulturfiltrat von Mf-309 nach 12 Tagen Inkubation mit Blattextrakten verschiedener Musa cv

Das Mf-Kulturfiltrat, das auf der Basis von Blattextrakten von Musa cv Yangambi km 5 hergestellt wurde, wies mit 2660.9 nM die höchste Konzentration an 2,4,8-THT nach 12 Tagen Inkubationsdauer auf. In den Kulturfiltraten der Sorte Cachaco wurden Konzentrationen von


76

1713.6 nM und bei der anfälligen Dominico Hartón von 58.0 nM bestimmt. Im Vergleich dazu entsprach die 2,4,8-THT-Konzentration in der Kontrolle (M-1D-Nährlösung ohne Pflanzenextrakte) 29.38 nM. Die Konzentrationen anderer Mf-Metaboliten in den Behandlungen entsprach denjenigen der Kontrolle. Die ermittelten Myzeltrockenmassen in den verschiedenen Behandlungen am Ende der Inkubationsperiode entsprachen der Kontrolle und wiesen auch untereinander keine signifikanten Unterschiede auf.

Zur Untersuchung der weiteren Interaktionen zwischen Musa cv Yangambi km 5 und Mf-Metaboliten wurden die zu extrahierenden Blätter zuvor mit Kanamycin als Induktor von Abwehrmechanismen behandelt (siehe Abschnitt 3.1.3), so daß die mit dem Erreger inkubierten pflanzlichen Extrakte postinfektionell wirksame Stoffwechselprodukte enthielten:

Abb. 42 Konzentration des Sekundärmetaboliten 2,4,8-THT im Kulturfiltrat von Mf-309 nach 12 Tagen Inkubation mit Blattextrakten vor und 24 bzw. 48 Stunden nach Behandlung von Musa cv Yangambi km 5 mit Kanamycin

Im Vergleich zu dem Gehalt an 2,4,8-THT in Mf-Nährlösungen, die aus Musa cv Yangambi km 5 vor Elizitierung gewonnen wurden, wiesen die Kulturfiltrate, die nach Behandlung mit Kanamycin (24 bzw. 48 Stunden nach Elizitierung) extrahiert und inkubiert wurden, deutlich geringere Gehalte des pilzlichen Metaboliten auf.

Die fördernde Beeinflussung des 2,4,8-THT-Stoffwechsels durch resistente Musa cv war nach den in Abbildung 42 dargestellten Ergebnissen also auf das Vorhandensein präinfektioneller Mechanismen zurückzuführen, deren Wirkung im Verlaufe der postinfektionellen Abwehrreaktion nachließ. 48 Stunden nach erfolgter Elizitierung gewonnene Extrakte aus Musa cv Yangambi km 5 bewirkten 2,4,8-THT-Konzentrationen in inkubierten Mf-Kulturfiltraten, die den aus der anfälligen Sorte Dominico Hartón gewonnennen Extrakten bzw. der Kontrolle ohne Zusatz von Blattextrakten entsprachen.


[Titelseite] [Einleitung] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [Bibliographie] [Anhang] [Danksagung] [Selbständigkeitserklärung]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Dec 21 12:51:20 1999