Hoß, Reinhart: Untersuchungen zur Funktion und Spezifität pilzlicher Sekundärmetaboliten im Pathosystem ”Schwarze Sigatokakrankheit“ der Banane (Musa sp - Mycosphaerella fijiensis)

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Kapitel 5. Diskussion

Ausgehend von dem in der Einleitung formulierten Begründungszusammenhang für die vorliegende Arbeit sollen im folgenden Kapitel zunächst die Ergebnisse der experimentellen Untersuchungen zur Charakterisierung des pflanzlichen (Abschnitt 5.1) sowie des pilzlichen (5.2) Sekundärmetabolismus diskutiert werden. Die Frage nach der Spezifität und Funktion des 2,4,8-THT im Pathosystem Musa sp/Mf wird in Abschnitt 5.3 einer kritischen Bewertung unterzogen.

5.1. Charakterisierung der Wirtsreaktionen verschiedener Musa cv

Die experimentellen Untersuchungen an der pflanzlichen Komponente des Pathosystems waren auf die Nutzung verschiedener Musa cv zur Anzucht von Geweben zur Exposition mit dem Erreger bzw. dessen Metaboliten sowie der Gewinnung und Analyse sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe gerichtet. Zur Inokulation mit dem Erregerorganismus eignen sich differenzierte Blatt- oder undifferenzierte Kallusgewebe, zur Exposition gegenüber pilzlichen Extrakten und deren Fraktionen sind isolierte Strukturen der Wirkorte (Zellorganellen, Protoplasten, Zellsuspensionen) am besten geeignet.

Zur in vitro-Kultur der drei ausgewählten Bananensorten mit spezifischer Reaktion gegenüber dem Pathogen wurde auf der Basis von MS-Nährmedien die von Vuylsteke (1989) angegebene Wuchsstoffkonzentration gewählt. Diese zeigte neben einer insgesamt leicht verminderten Multiplikationsrate im Vergleich zu der von Okole (1995) angegebenen Zusammensetzung eine konstantere Vermehrungsrate bei moderater Kallusbildung und Verbräunung. Die Multiplikationsraten von 2.96 (Dominico Hartón) bis 3.71 (Yangambi km 5) Schößlingen pro transferiertem ”bud“ entsprachen über die gesamte Versuchsperiode von drei Jahren bei gleichbleibenden Inkubationsbedingungen den von Israeli et al (1995) für Sorten aus der Untergruppe Cavendish (Genom AAA) angegebenen. Die sukzessive Verminderung des Cytokiningehaltes von 20.0 (MS-Multiplikationsmedium) über 0.1 (MS-Regenerationsmedium) bis auf 0.0 (MS-Hardening) µM Benzylaminopurin (BAP) bei gleichzeitiger Erhöhung des Auxingehaltes im Regenerationsmedium führte zur vollständigen Differenzierung von Sproß- und Wurzelgewebe einzelner Bananenpflanzen nach dem ersten Umsetzen und zur Phototrophie zum Zeitpunkt des Überganges in die Bodenkultur. Hohe Transpirationsverluste durch die noch wenig entwickelte Kutikula wurden durch eine erhöhte Luftfeuchte (Plastikabdeckung) verhindert. Phänotypische Veränderungen traten in allen Stadien der Entwicklung auf, insbesondere bei der Sorte Dominico Hartón; die auffälligen ”off-type“-Einzelpflanzen wurden von der weiteren Nutzung in der Gewebekultur ausgeschlossen. Insgesamt führte die Anwendung der Musa sp-Gewebekultur zu einer gleichmäßigen Bereitstellung homogener Bananenpflanzen mit verschiedenen Reaktionen gegenüber Mf zur weite-


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ren Untersuchung physiologischer und biochemischer Leistungen der Wirtspflanze im Zusammenhang mit der Schwarzen Sigatokakrankheit.

Die Gewinnung undifferenzierter Gewebe und Einzelzellsuspensionen stieß auf Schwierigkeiten, die im Verlauf der Arbeit nur teilweise überwunden werden konnten: So gelang die Kultivierung von Kallusgewebe der Sorten Yangambi km 5 und Cachaco durch Inkubation kalloider Basalbereiche aus der Meristemkultur in flüssigem SH-Medium unter Zusatz der Auxine NAA und Dicamba und die nachfolgende Überführung auf Festmedium gleicher Zusammensetzung; die Anwendung der gleichen Verfahren bei der Sorte Dominico Hartón führte allerdings zu rascher Verbräunung und anschließendem Absterben des Kallus. Ein vergleichbarer Effekt ist von Okole (1995) bei der Verwendung von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) als Auxinquelle bei der Kallusbildung beobachtet worden. Das Auftreten dieses Phänomens in Kalluskulturen von Dominico Hartón auf 2,4-D-freien Nährmedien weist auf die unterschiedliche Metabolisierung von Wuchsstoffen in verschiedenen Musa cv hin und erfordert weitere Untersuchungen zur Optimierung der Nährstoffversorgung in Bananen anderer genetischer Konstitution.

Die Kallusgewebe der HR- und der PR-Sorte konnten aber zur Inokulation mit Myzel des Erregers genutzt werden. Auf diese Weise gelang es, den Raum direkten Kontaktes zwischen Pathogen und Wirt vergleichend histologisch zu untersuchen: Bei Musa cv Yangambi km 5 verblieb das inokulierte Mf-Myzel oberflächlich ohne ausgedehntes Wachstum und die elektronenmikroskopischen Aufnahmen aus unteren Kallusbereichen zeigten nur wenige kollabierte Hyphen. Bei Cachaco bildete sich eine kompakte, weiter wachsende Myzelmasse mit funktionsfähigen Penetrationshyphen bis in die unteren Lagen des Kallus. Das Fehlen von Haustorien und der enge räumliche Zusammenhang zwischen Wirts- und Erregerzellen waren weitere Belege für die Bedeutung chemischer Interaktionen im Interzellularraum der Pflanze, die von Beveraggi et al (1993) aufgrund von Untersuchungen infizierten Blattgewebes festgestellt worden sind. Die ”dual culture“ zwischen Musa cv-Kallus und Mf-Myzel, die in der vorliegenden Arbeit nur ansatzweise experimentell genutzt wurde, war somit in der Lage, die Reaktionen innerhalb des Pathosystems in Blattgewebe als dem natürlichen Infektionsorgan zu reproduzieren und bietet die Möglichkeit, biochemische und pathophysiologische Untersuchungen ohne den Einfluß störender histologischer Faktoren oder chemischer Nebenprodukte aus chlorophyllhaltigen Zellen durchzuführen. Ob die Fähigkeit zur Synthese von Phytoalexinen auch in Kalluszellen aufrecht erhalten wird und welchen Einfluß die Zusammensetzung des Nährmediums darauf ausübt (Donovan et al 1990), bleibt weiteren Untersuchungen vorbehalten. Dabei ist auch die Möglichkeit zur zielgerichteten Transformation und Selektion somaklonaler Varianten mit agronomisch wünschenswerten Eigenschaften zu nutzen (Scowcroft et al 1983, Withers 1993). Die Ergebnisse der elektronenmikroskopischen Untersuchungen in den Sorten Yangambi km 5 und


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Cachaco bilden eine Bestätigung des von Beveraggi et al (1993) abgeleiteten Trophieverhältnisses zwischen Wirt und Pathogen in der ersten Phase der Interaktion und der Wirksamkeit pflanzenphysiologischer Faktoren bei der Abwehr gegen den Erreger, die auch im künstlichen Pathosystem aus Wirtskallus und Mf-Inokulum induzierbar sind. Obwohl die Auswertung der vorliegenden TEM-Untersuchung aufgrund der langen Inkubationsdauer keine Aussagen über die Geschwindigkeit der HR und damit deren Bedeutung als Ursache oder Begleiterscheinung der Abwehrreaktion (Gabriel 1989, Walton und Panaccione 1993) erlaubt, belegen die Verteilung und die Konstitution der Mf-Hyphen im Kallus von Musa cv Yangambi km 5 die auch von Sallé et al (1990) in infiziertem Blattgewebe formulierte Einschätzung eines frühen Absterbens der Erregerzellen in HR-Interaktionen.

Die Gewinnung embryogener Zellsuspensionen zur Bestimmung toxikologischer Kennwerte verschiedener Musa cv gegenüber Sekundärmetaboliten des Erregers konnte nicht in hinreichendem Maße erreicht werden, da die suspendierten Zellen zwar lebend und über einen längeren Zeitraum teilungsfähig blieben, aber auch nach Umsetzen auf Nährböden mit veränderter Wuchsstoffzusammensetzung keinerlei Organo- oder Embryogenese zeigten. Nach Panis und Swennen (1993) ist ein wichtiger Faktor für das Wachstum embryogener Zellsuspensionen eine hohe Inokulumdichte, die bei den eigenen Versuchen mit den drei genannten Musa cv nicht erreicht werden konnte. Die Ergebnisse von Novak et al (1989) und Dhed´a et al (1991) zeigten, daß nur bei einigen Sorten diploider und heterozygoter triploider Musa sp sehr geringe Regenerationsraten (<< 20 %) möglich sind. Die Anwendung standardisierter Versuchsprotokolle auf verschiedene Bananensorten zur Untersuchung der Interaktion mit Mf ist jedoch von weiteren diesbezüglichen Erfolgen unter Einbeziehung unterschiedlicher Wuchsstoffkombinationen abhängig.

Die Bestimmung der Enzymaktivitäten im Zusammenhang mit einer Mf-Infektion erfolgte beispielhaft an dem zentralen Enzym Phenylalanin-Ammoniumlyase (PAL), das den Metabolismus vom Substrat L-Phenylalanin des Primärstoffwechsels zum Produkt trans-Zimtsäure (CA) des Sekundärmetabolismus katalysiert (Mansfield 1983). Die angewendete Methode der direkten Messung von CA während der Inkubation kann unter der Voraussetzung einer mehrfachen Reinigung der Proben zur Entfärbung als geeignet bezeichnet werden, da die Zunahme der Adsorption bei 272 nm über einen Zeitraum von mehreren Stunden gleichmäßig verlief und auf eine konstante Umsetzung des Substrates hinwies; damit lag eine Enzymkinetik 0. Ordnung vor (Mohr und Schopfer 1992). Die Darstellung der Enzymaktivität auf die Bezugsgröße Proteingehalt ermöglichte den Vergleich zwischen den verschiedenen Musa cv.

Die Ergebnisse der Messungen zeigten die Aktivierung von PAL innerhalb von 10 Stunden nach Inokulation in allen drei Bananensorten und stellen damit die früheste in planta meß-


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bare Reaktion dar. Dieser Wert dürfte mit der Zeitspanne der Penetration pilzlicher Hyphen durch die Stomata und der Elizitierung pflanzlicher Reaktionen übereinstimmen. Nach Dixon und Lamb (1990) erreicht die Transkription von PAL-kodierenden Genen in Bohnen-Zellsuspensionen schon 1.3 h und die Enzymaktivität 6-8 h nach Elizitorbehandlung maximale Werte. Die höchste Aktivität bei Musa sp wird jeweils 24 dpi erreicht und nimmt mit steigendem Grad der Resistenz gegenüber dem Erreger Mf zu (Yangambi km 5 > Cachaco > Dominico Hartón). Das bedeutet, daß postinfektionelle Reaktionen unmittelbar nach der Penetration der Stomata aktiviert werden und die Pathogenese vom weiteren Verlauf der Interaktion zwischen Musa sp und Mf abhängt, die zu kompatiblen oder inkompatiblen Wirt-Pathogenverhältnissen führt. Dabei ist die PAL-Aktivierung proportional zu dem Grad der Resistenz gegenüber dem Erreger. Die Tatsache, daß eine Steigerung der Aktivierung von PAL durch den Einsatz des Wirkstoffes Tricyclazol® nur in inokulierten Musa cv Yangambi km 5 nachgewiesen werden konnte, kann als weiterer Beleg für den engen Zusammenhang von 2,4,8-THT und der Induktion von Abwehrmechanismen gewertet werden, der in Abschnitt 5.3 diskutiert wird.

Ob die von Luis et al (1993, 1996) beschriebenen Phytoalexine aus Musa acuminata über den PAL-abhängigen Shikimat- oder Phenylpropanbiosyntheseweg metabolisiert werden, läßt sich aus den Ergebnissen nicht ableiten. Nach Hahlbrock (1988) und Freytag und Hahlbrock (1992) besteht ein enger Zusammenhang zwischen dem hypersensitiven Zelltod (HR) in unmittelbarer Nähe der pilzlichen Penetrationsorgane und der systemischen Aktivierung von Abwehrmechanismen durch benachbarte Gewebe; Phytoalexine können auch toxisch auf pflanzliche Zellen wirken und somit eine hypersensitive Nekrotisierung verursachen. Király (1980) weist in diesem Zusammenhang auf die teleologische Erklärung des Konzeptes hin, das eine ”Opferung“ weniger eigener Zellen zur ”Rettung“ des gesamten pflanzlichen Organismus beinhaltet. Der Zusammenhang zwischen HR und Abwehrmechanismen könnte im Falle des vorliegenden Pathosystems Schwarze Sigatokakrankheit durch die Wirkung des 2,4,8-THT in toxischen Dosen bei der Sorte Yangambi km 5 eine Rolle spielen.

Die Gewinnung von Sekundärstoffen aus dem Interzellularraum des Blattgewebes verschiedener Musa cv wurde durch das Vorhandensein hochviskoser Verbindungen aus den Milchröhren erschwert, die die Anwendung konventioneller Extraktionsverfahren nicht erlaubte; alternativ wurde die von Keen (1978) beschriebene ”facilitated diffusion method“ angewendet, bei der die zu untersuchenden Analyte in großen Volumina Lösungsmittel auftreten und entsprechend extrahiert werden mußten. Die gewonnenen Substanzen wurden durch TLC getrennt und auf ihre Wirksamkeit gegenüber Pilzsporen bzw. als Kulturfiltrat auf die Wirkung gegenüber dem Mf-Sekundärmetabolismus untersucht. Die dabei isolierte Substanz, die eine Hemmung von Pilzwachstum bewirkte, wurde HPL-chromatographisch und UV-spektrographisch charakterisiert, die Daten lassen allerdings keine Übereinstimmungen


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mit den von Luis et al (1993, 1996) veröffentlichten Strukturdaten der von dieser Arbeitsgruppe isolierten Phytoalexine erkennen. Möglicherweise entsprechen die postinfektionellen Metaboliten aus Yangambi km 5 einer der von Mourichon et al (1990) isolierten Substanzen, die die Keimung und das Längenwachstum der Keimschläuche von Mf hemmten. Die weitere Untersuchung der isolierten Substanzen erfordert die Identifizierung der chemischen Struktur, deren Metabolismus in der Wirtspflanze sowie die Bestimmung der Wirkungen auf die natürlichen Infektionorgane des Erregers Mf.

5.2. Untersuchung des pilzlichen Sekundärstoffwechsels

Die Voraussetzungen zur analytischen Bestimmung von Pentaketidmetaboliten aus Mf zur Charakterisierung des pilzlichen Sekundärstoffwechsels wurden durch die Entwicklung einer geeigneten Methode zur Extraktion und Aufbereitung der Kulturfiltrate sowie der chromatographischen Auswertung der so gewonnenen Extrakte geschaffen.

Das zur Bearbeitung der vorliegenden Fragestellung entwickelte Verfahren der Probenaufbereitung orientierte sich an der Gewinnung maximaler Ausbeuten an 2,4,8-THT als wichtigem Naphtochinonderivat für die Pathogenese von Mf auf Musa sp sowie weiterer pilzlicher Metaboliten zur Analyse mittels der HPLC. Auf der Basis der Arbeiten von Greenblatt und Wheeler (1986) wurden mehrere alternative Verfahren unter Einbeziehung verschiedener mobiler und stationärer Phasen untersucht. Die daraus entwickelte Methode der Festphasenextraktion (SPE) an Aminopropylsäulen (NH2) und einphasigem Spülen mit Hexan vor der Elution der Analyte mit Methanol hat gegenüber anderen Verfahren der Probenaufbereitung mehrere Vorzüge: Im Vergleich zu der von Stierle et al (1991) angewendeten Methode der Gelfiltration liegen die Analyte in einem geringen Lösungsmittelvolumen konzentriert vor, außerdem sind die gute Reproduzierbarkeit und der geringe Gerätebedarf zu erwähnen. Gegenüber der von Okole (1995) angewendeten TLC sind die geringeren Transferverluste sowie die Erfassung geringster Substanzmengen zur direkten Injektion in die HPLC hervorzuheben. Damit erfüllt die Probenvorbereitung durch SPE-NH2 und die daran anschließende analytische und/oder präparative RP-HPLC die von Stierle (1992) formulierte Grundphilosophie, daß jeder Schritt eines Trennungsschemas einen anderen Mechanismus nutzen sollte, in diesem Fall zuerst die hydrophile (SPE) und folgend die apolare Wechselwirkung (HPLC) der Analyte an der Festphase.

Zur Beurteilung der Reinheit des nach der HPLC-Trennung weiterverwendeten 2,4,8-THT zur Anwendung auf Musa cv ist auf die grundsätzliche Problematik bei der Gewinnung von Naturstoffen hinzuweisen: Nach Yoder (1980) können scheinbar homogene Toxinpräparate vor allem aus Verunreinigungen (”contaminants“) bestehen, so daß beispielsweise ein Präparat mit scheinbar hoher biologischer Aktivität von 10-8 M aus 99 % Verunreinigung und 1 %


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Toxin bestehen kann. Die Bestandteile des aus Mf-Kulturfiltraten isolierten 2,4,8-THT sind nach Trennung auf TLC durch MS und GC-MS-Koppelung ermittelt worden: Dabei wurden unter den gegebenen Bedingungen ein Anteil von 14.78 % bei einer Masse von m/z = 194.05 ermittelt, verglichen mit einem Anteil von 13.4 % für 2,4,8-THT bei Stierle et al (1991). 4.62 % wurden bei m/z = 176 bestimmt und entsprechen verschiedenen Strukturisomeren von Dihydroxy-tetralon (Produkt der Wasserabspaltung von 2,4,8-THT). Die gleiche Probe weist nach Derivatisierung in der Gaschromatographie mit anschließender Massenspektrometrie mehrere Nebenpeaks auf, die das Vorhandensein methodenbedingter Begleitstoffe aus dem Kulturfiltrat (pilzliche Subtanzen oder Nährstoffe), Lösungsmittelrückständen oder im Verlauf der Extraktion gelösten Stoffen aus Dichtungs- und Verpackungsmaterialien in unbestimmter Größenordnung belegen. Für die Reinheit des 2,4,8-THT nach HPLC-Reinjektion, das in den Dosis-Wirkungsversuchen auf Blattgewebe verwendet wurde, ist der Anteil von durchschnittlich 90 % (UV-Detektion) als befriedigend anzusehen, wobei über die Menge und Wirkung der übrigen Substanzen (einschließlich der bei der gewählten Wellenlänge nicht detektierbaren) naturgemäß keine Aussagen getroffen werden können.

Die Gewinnung nichtverdampfbarer Rückstände nach zweimaliger Extraktion der Kulturfiltrate lag unter den gegebenen Bedingungen mit 35 mg l-1 über den von Upadhyay et al (1990) angegebenen, verblieb allerdings deutlich unterhalb der von Stierle et al (1991) erreichten Ausbeute von 90 mg l-1. Die von den Autoren angegebenen Ergebnisse enthalten jedoch keine detaillierten Angaben zu den Bedingungen der Inokulation, Inkubation und Rohextraktgewinnung. Einzelauswertungen der durch mehrmalige Extraktion gewonnenen Fraktionen zeigten jedoch, daß die Substanzen des Pentaketidbiosyntheseweges über eine sehr hohe Extraktionseffizienz verfügen (Nernst´sche Konstante K2,4,8-THT = 19), so daß schon bei zweimaliger Extraktion mit Ethylacetat 99.7 % des 2,4,8-THT in die apolare Phase übergehen, im Gegensatz zu einer Ausbeute von nur 86.4 % der gesamten nichtverdampfbaren Rückstände; im Hinblick auf die vorliegende Fragestellung ist somit die gewählte Extraktionsmethode als angemessen zu betrachten.

Ebenso ist die von Stierle et al (1991) angegebene Inkubationsperiode von 28 Tagen zur Erreichung hoher Mf-Massezuwächse geeignet und orientiert sich am Wachstumsverhalten des Pilzes auf festen Nährmedien. Die eigenen Untersuchungen hierzu zeigten jedoch, daß das Myzelwachstum in Flüssigkulturen neben der Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Nährmediums auch durch die Inkubationsbedingungen wie Luftzufuhr und Durchmischungsintensität beeinflußt werden, wohingegen die Konzentrationen der Petaketidmetaboliten schon nach 12 Tagen Inkubation nicht mehr wesentlich gesteigert werden konnten. Der anhaltende Massezuwachs geht nicht mit einem Zuwachs der Substanzausbeute einher bzw. wird durch verstärkten Abbau der Metaboliten kompensiert.


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Insgesamt zeigten die Ergebnisse der Untersuchungen an fünf geprüften Mf-Isolaten einen zwar unterschiedlichen Endgehalt an 2,4,8-THT, es wurden aber keine im Hinblick auf den Pentaketidmetabolismus defizienten Isolate identifiziert. Die untersuchten Isolate waren jedoch - soweit bekannt - aus natürlich infizierten Musa sp gewonnen worden (Okole 1995). Sollte die Pathogenität des Erregers gegenüber anfälligen Bananen von der Fähigkeit zur Synthese von 2,4,8-THT abhängen, dürften diesbezüglich defiziente Mf-Stämme auf natürlich infizierten Musa sp nicht auftreten, so daß eine Gewinnung entsprechender Isolate an deren Mutagenese und zielgerichtete Selektion gebunden ist.

Die Studien von Wheeler (1983) über den Melaninmetabolismus in Pilzen lassen das Vorliegen des Pentaketidbiosyntheseweges auch in Mf erwarten, obwohl Pilze dieser Gattung daraufhin nicht untersucht worden sind. Unter den gegebenen experimentellen Bedingungen konnten in Nährlösungen von Mf die Naphtochinone Juglon, 3-HJ und Flaviolin sowie das Hydrochinon 2,4,8-THT nachgewiesen und quantifiziert werden. Während die Konzentrationen von Juglon und 3-HJ im Verlaufe der Inkubationsperiode auf sehr niedrigem Niveau verblieben, zeigten die Metabolite 2,4,8-THT und Flaviolin eine parallele Entwicklung mit Maximalwerten 12 Tage nach Inokulation in physiologisch relevanten Konzentrationen und Konzentrationen mit starken Schwankungen bis zum Ende der Beobachtungsperiode nach 45 Tagen. Diese Ergebnisse deuten auf eine fortgesetzte Metabolisierung und den gleichzeitigen Abbau von 2,4,8-THT durch Oxidation zu 3-HJ und/oder Dehydrierung zu 1,4,5-Trihydroxynaphtalen (Wheeler und Stipanovic 1985) hin, die durch eine Veränderung der Sauerstoffzufuhr im Nährmedium allerdings unbeeinflußt blieb. Die Abfolge von reduzierenden und oxidierenden Schritten im Pentaketidmetabolismus und die Beobachtung autoxidativer Prozesse (Stipanovic und Bell 1977) neben enzymgeregelten Syntheseleistungen (Viviani et al 1993) zeigten die Komplexität des untersuchten Stoffwechselsystems.

Das Zwischenprodukt Juglon wurde unter in vitro-Bedingungen, auch unter Verwendung von spezifischen Wirkstoffen, nur in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen, die unter in vivo-Bedingungen keine physiologisch wirksame Größenordnung erreichte. Dieses Ergebnis widerspricht damit der von einzelnen Autoren (Okole 1995) geäußerten Vermutung, die Spezifität untersuchter Fraktionen und Substanzen könnte durch die Wirkung des Juglon als Verunreinigung in geringen Mengen maskiert werden.

Die Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen von Mf unter Anwendung des Wirkstoffes Tricyclazol® zeigten dessen Einfluß auf die Pigmentierung des Myzels und den Gehalt an verschiedenen Pentaketidmetaboliten: Unabhängig von der Pigmentierung des Luftmyzels verschiedener Mf-Isolate führt Tricyclazol® zu einer intensiven Braunfärbung des PDA-Nährmediums und bei einer Dosis von 1.0 mM zu einer deutlichen Verminderung des Massewachstums. Die Intensität der Braunfärbung war positiv korreliert mit der Steigerung des


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Gehaltes an 2,4,8-THT in verschiedenen Isolaten des Erregers, so daß der von Natural (1990) abgeleitete positive Zusammenhang zwischen der Pigmentierung und der Toxinproduktion von Mf durch die hier vorgenommene Betrachtung einzelner Metaboliten bestätigt werden konnte.

Der Einsatz von Tricyclazol® ging auf die von Stierle et al (1991) formulierte Hypothese zurück, der Wirkstoff könne die Produktion von 2,4,8-THT und damit die Pathogenität des Erregers Mf gegenüber der Wirtspflanze Musa sp steigern. Unter in vitro-Bedingungen führte die Anwendung von Tricyclazol® bis zu einer Konzentration von 1.0 mM zu einer Steigerung des Gehaltes an 2,4,8-THT um das bis zu 15fache; die Gehalte an Flaviolin entwickelten sich parallel dazu, während die beiden Naphtochinone Juglon und 3-HJ keine Veränderung gegenüber der unbehandelten Kontrolle zeigten. Diese Ergebnisse bestätigen zunächst das Vorliegen des von Wheeler und Stipanovic (1985) bestimmten Pentaketidbiosyntheseweges in pilzlichen Organismen, wobei aus den genannten methodischen Gründen 2-HJ nicht nachweisbar war. Ebenso wie von Tokousbalides und Sisler (1979) nach Tricyclazol®-Behandlung bei Verticillium dahliae festgestellt, führte die Hemmung der 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphtalin-Reduktase zu einer Akkumulation von Flaviolin und der Steigerung des Metabolismus über Juglon und andere Zwischenprodukte zu 2,4,8-THT. Eine Hemmung des Reduktionsschrittes von 3-HJ zu 2,4,8-THT, wie von Wheeler und Stipanovic (1985) bei Wangiella dermatitidis festgestellt, konnte für Mf nicht nachgewiesen werden.

In diesem Zusammenhang ist auch der Einfluß von Blattextrakten verschiedener Musa cv auf den Metabolismus von Mf zu diskutieren: Eine deutliche Steigerung des Gehaltes an 2,4,8-THT wurde durch die Inkubation des Erregers in Nährsubstraten erreicht, die aus der HR- und PR-Sorten Yangambi km 5 und Cachaco gewonnen wurden. Diese Förderung des pilzlichen Metabolismus durch Substanzen aus Musa cv war am deutlichsten in Substraten, die präinfektionell in Blattgewebe resistenter Wirtspflanzen gewonnen wurden. Die fördernde Wirkung von pflanzeneigenen Substanzen auf den Pentaketidstoffwechsel von Mf war damit vergleichbar den Ergebnissen von Pinkerton und Strobel (1976) innerhalb des Pathosystems Zuckerrohr/Bipolaris sacchari: Die Autoren untersuchten Blattfiltrate verschiedener Sorten und isolierten aus der anfälligen Zuckerrohrsorte 51-NG97 einen als Serinol identifizierten Aktivator, der unter in vitro-Bedingungen die Synthese des wirtsspezifischen Toxins Helminthosporosid förderte. Im Gegensatz zu den bei Musa sp/Mf gefundenen Ergebnissen wurde Serinol aber nur bei der anfälligen, nicht bei der resistenten Sorte gefunden. Das bedeutet für die vorliegende Fragestellung, daß aktivierende Substanzen aus dem Wirtsgewebe resistenter Musa cv sortenspezifische Wirkungen auf den pilzlichen Metabolismus ausüben und dadurch wiederum Abwehrmechanismen der Pflanze induzieren. Das Ergebnis dieser Interaktion führt zur Inkompatibilität zwischen Wirtspflanze und Erreger. Dabei sind im Falle des Serinol folgende Mechanismen der Aktivierung des pilzlichen Stoffwechsels diskutiert worden


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(Pinkerton und Strobel 1976), die auch im inkompatiblen Wirt-Pathogenverhältnis Musa cv/Mf wirksam werden können: (1) Als Vorstufe des 2,4,8-THT, da auch pflanzliche Organismen über den Acetat-Polymalonat-Biosyntheseweg verfügen (Mansfield 1983); (2) als Induktor der 2,4,8-THT-Synthese; (3) als Einflußfaktor für die Enzymsysteme, die in den Metabolismus einbezogen sind, vergleichbar mit der Wirkung des synthetischen Hemmstoffes Tricyclazol®. Eine weitergehende Analyse der biochemischen und physiologischen Grundlagen des Mechanismus setzt jedoch die Isolierung und Identifizierung der verantwortlichen Substanz voraus.

Damit ist der Pentaketidmetabolismus des Erregers Mf als ein sekundärer Stoffwechselmechanismus zu betrachten, der sehr spezifisch sowohl auf synthetische Wirkstoffe wie Tricyclazol® sowie auf Bestandteile pflanzlicher Extrakte resistenter Musa cv reagiert. Die unter in vitro-Bedingungen bei Tricyclazol®-Anwendung festgestellte Steigerung des Gehaltes an 2,4,8-THT bei gleichbleibenden Gehalten an Juglon und 3-HJ machte einen Einsatz des Wirkstoffes unter in vivo-Bedingungen sinnvoll, durch den die dosisabhängige Wirkung des 2,4,8-THT auf Gewebe von Musa cv in planta untersucht werden konnte (siehe folgenden Abschnitt).

5.3. Bestimmung der kompatiblen und inkompatiblen Wirt-Pathogeninteraktionen

5.3.1. Kritische Überprüfung des HST-Postulates im Pathosystem Musa sp/Mf

Der Postulierung des 2,4,8-THT als HST in der Pathogenese von Mf (Stierle et al 1991) gingen teilweise beeindruckende empirische Befunde zur Rolle spezifischer Toxine in anderen pflanzenpathologischen Modellsystemen voraus. Seit der Bestimmung der inzwischen klassischen Beispiele von HST, des Victorin (HC-Toxin) von Cochliobolus victoriae in Hafer in den späten 40er Jahren und des HMT-Toxins von Cochliobolus heterostrophus in Mais zu Beginn der 70er Jahre, ist die Anzahl pilzlicher Metaboliten, die als HST eingestuft wurden, ständig gewachsen: Scheffer listete 1976 schon zehn wirtsspezifische Toxine, Scheffer und Livingston (1984) 14 und Stierle et al (1992) 15 HST auf; in der Mehrzahl stammten diese von Pathogenen der Gattungen Alternaria auf Obst und Cochliobolus (Helminthosporium) auf Nutzgräsern. Die Basis der Spezifität bildet die jeweils niedrigste taxonomische Ebene der Pflanzensorte bzw. des Kultivar (cv) und der Erregerrasse bzw. des Pathotyps. Die bisher unter dem Begriff HST zusammengefaßten Substanzen sind hinsichtlich ihrer Wirkung im kompatiblen Wirt-Pathogenkomplex vergleichbar, verfügen aber über unterschiedliche chemische Strukturen: Es handelt sich um niedermolekulare Verbindungen (MW < 800 Da), die zu den Alkaloiden, Glykosiden, Phenolen, Polyketiden, Terpenen und anderen Klassen organischer Verbindungen gehören (Kohmoto und Otani 1991, Stierle et al 1992).


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Insgesamt ist die Bedeutung der Toxine für die Pathogenese und der HST für die Spezifität von Wirt-Pathogeninteraktionen weiterhin ein kontrovers diskutiertes Thema: Dabei reichen die Positionen von Gäumanns Diktum aus den 50er Jahren, alle Pflanzenpathogene seien toxinbildend, bis zu dem Kommentar von Day, daß Toxine keine bedeutenden Faktoren der Pathogenität seien (zit. n. Wheeler 1981). Walton und Panaccione (1993) sprechen von einer konzeptionellen Polarisierung innerhalb der Phytopathologen, die den HST einerseits geradezu mythische Eigenschaften zuschreiben oder diese andererseits als Seltsamkeiten (”oddities“) ablehnen.

Im Verlaufe der Untersuchungen verschiedener Pathosysteme und deren toxischer Metaboliten konnte sich unter der Evidenz weiterer empirischer Belege eine konzeptionelle Neubewertung der zunächst als Toxine im engeren Sinne definierten Substanzen durchsetzen, die durch folgende Beispiele veranschaulicht werden soll:

Beispiel 1: Pathosystem Hafer/Cochliobolus victoriae und Puccinia coronata

In den 40er Jahren wurde in den USA der Anbau von Hafersorten ausgeweitet, die das Resistenzgen Pc-2 gegen den Erreger des Haferkronenrostes (Puccinia coronata) exprimierten; innerhalb weniger Anbauperioden wurde auf den rostresistenten Hafersorten ein neuer Blattfleckenerreger als Cochliobolus carbonum identifiziert, für dessen Pathogenität das HST Victorin (HC-Toxin) verantwortlich gemacht wurde (Pringle und Scheffer 1964, Ellingboe 1976). Das phänotypische Auftreten von Victorinsensitivität und Rostresistenz innerhalb desselben Genotyps führte zu der Hypothese, daß dasselbe Gen für beide Reaktionen gegenüber den genannten Pathogenen verantwortlich sei. Untersuchungen des Resistenzmechanismus gegenüber Puccinia coronata zeigten, daß eine verstärkte Synthese des Phytoalexins Avenalin eine Abwehr des Erregers bewirkte; Avenalin ist allerdings unwirksam gegen den Erreger der Blattfleckenkrankheit. Das für die Pathogenese und Symptomausprägung von Cochliobolus victoriae verantwortliche HST Victorin wurde schließlich als Elizitor für die Avenalinproduktion und damit die Resistenz gegen den Erreger des Haferkronenrostes erkannt (Mayama et al 1986). Damit wurde die klassische Rolle des pilzlichen Metaboliten als Toxin in der kompatiblen Wirt-Pathogenbeziehung um eine nachgewiesene Funktion als Elizitor in der inkompatiblen Interaktion ergänzt (Keen 1986).


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Beispiel 2: Pathosystem Tomate/Cladosporium fulvum

Der Erreger der Blattflecken- und Fruchtfäulekrankheit der Tomate, Cladosporium fulvum, ist als langsam wachsender, hemibiotropher Pilz beschrieben worden, der die Pflanze durch die Stomata penetriert und sich ohne Haustorienbildung im Interzellularraum entwickelt (Kaars Sijpesteijn 1976, De Wit und Toma 1986). Die pflanzlichen Reaktionen auf das Pathogen reichen von denen anfälliger über die teilweise resistenter Sorten (extensives Myzelwachstum) bis zur HR unmittelbar nach Inokulation (Lazarovits und Higgins 1979). Aus dem Apoplasten infizierter Tomaten konnten Produkte des pilzlichen Stoffwechsels isoliert werden, die zunächst aufgrund ihrer Wirkung als spezifische Toxine oder Nekrose-induzierende Elizitoren bezeichnet wurden (De Wit und Spikman 1982). Diese in planta produzierten Erregersubstanzen wurden schließlich als Produkt des Avirulenzgenes AVR9 identifiziert und induzieren die HR in inkompatiblen Wirt-Pathogenbeziehungen bei resistenten Cf9-Tomatensorten (De Wit et al 1993b).

Diese Beispiele trugen zu einer veränderten Funktionsbestimmung und terminologischen Neudefinition von Substanzen bei, deren Eigenschaften sie zunächst als Toxine gekennzeichnet hatten. So formulierte Bell (1981) die Idee von Toxinen als Hyperelizitoren der pflanzlichen Abwehrreaktionen, soweit durch diese neben der direkten nekrotischen Wirkung auch Mechanismen induziert wurden, die die Pathogenese hemmten. Im entgegengesetzten Sinne entwickelten Nishimura und Kohmoto (1983) die Konzeption von Toxinen als Suppressoren der allgemeinen Abwehr gegen Pathogene in Pflanzen. Walton und Panaccione (1993) sprechen von ”nichttoxischen Toxinen“, die als wirtsspezifische Suppressoren bezeichnet werden können, da sie gerade die pflanzliche Abwehrreaktion unterdrücken.

Insgesamt gilt, daß für alle Pilze (außer den obligat biotrophen) der pflanzliche Zelltod sowohl mit Resistenz als auch mit Anfälligkeit der Wirtspflanze gegenüber dem Krankheitserreger verbunden sein kann (Bailey und O´Connell 1989). Pilzliche Metaboliten werden als Toxine bezeichnet, wenn die produzierenden Organismen nekrotroph sind, wohingegen Sekundärmetaboliten biotropher Erreger als Produkte der Avirulenzgene angesehen werden (Gabriel 1989). Nach Walton und Panaccione (1993) ist weder für Elizitoren noch für HST eine Unterscheidung möglich zwischen dem Zelltod als Symptom oder als auslösendem Faktor des Pathotyps.

Zusammenfassend kann von ambivalenten Funktionen pilzlicher Substanzen ausgegangen werden, die aufgrund ihrer unmittelbaren gewebeschädigenden Wirkung unter der Kategorie Toxin bzw. HST subsumiert wurden: Diese können als Elizitoren in inkompatiblen oder als Suppressoren in kompatiblen Wirt-Pathogeninteraktionen sekundäre (Beispiel Hafer/Victorin und Haferkronenrost) bzw. alternative Funktionen (Beispiel Tomate/Cladosporium fulvum) erfüllen:


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Abb. 43 Beziehungen zwischen der direkten Wirkung von Toxinen und deren mögliche Funktionen in kompatiblen und inkompatiblen Wirt-Pathogenverhältnissen

Zur Frage der Funktionen pilzlicher Metaboliten im hier untersuchten Pathosystems Musa sp/Mf bildeten die in Abschnitt 2.4.2 referierten Trophieverhältnisse sowie die Ergebnisse der Inokulationen von Blatt- (4.3.1) und Kallusgewebe (4.3.2) den Ausgangspunkt für die weitere experimentelle Untersuchung. Die hemibiotrophe Ernährungsweise des Pathogens rechtfertigte und erforderte die Überwindung der in der bisherigen Forschung praktizierten Arbeitsteilung zwischen Physiologen und Biochemikern einerseits, die vorwiegend die Untersuchung von Abwehrmechanismen in inkompatiblen Interaktionen zum Gegenstand hatten, und Genetikern andererseits, deren Experimentalsysteme aus biotrophen Pilzen in kompatiblen Wirt-Pathogenverhältnissen bestanden (Gabriel und Rolfe 1990). Im Pathosystem Musa sp/Mf sprechen die Ergebnisse der Inokulationsversuche zudem für das Vorliegen einer stetigen Reaktionsskala von anfällig bis resistent mit einem auch unter in vitro-Bedingungen gut erkennbaren PR-Phänotyp, der die Einbeziehung von drei Bananensorten (HR, PR, S) in die Untersuchung rechtfertigte.

Die bei verschiedenen Sorten aufgetretenen nekrotischen Symptome (HR bei der resistenten Sorte Yangambi km 5 unmittelbar nach Inokulation, Nekrotrophie bei der anfälligen Sorte Dominico Hartón in der fortgeschrittenen Phase der Pathogenese) legen dabei die Formulierung einer alternativen Hypothese nahe, nach der der pilzliche Metabolit 2,4,8-THT unterschiedliche Funktionen in verschiedenen Musa cv ausübt:

Als Elizitor von Abwehrreaktionen in Verbindung mit dem Phänomen der hypersensitiven Reaktion (HR) in der Frühphase der Interaktion zwischen resistenter Musa cv und dem Pathogen Mf sowie als ”klassisches“ Toxin in der nekrotrophen Phase der Pathogenese in kompatiblen Reaktionen zwischen anfälligen Sorten und dem Erreger.

Diese Hypothese soll im folgenden mit den in der diesbezüglichen Literatur dokumentierten Daten aus anderen Pathosystemen sowie den Ergebnissen der eigenen Arbeit diskutiert werden.


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In bezug auf die Bestimmung der Spezifität der zu untersuchenden Sekundärstoffe erlaubten die verschiedenen und teilweise widersprüchlichen Literaturangaben zur Sensitivität von Musa cv gegenüber Mf-Metaboliten kein schlüssiges Urteil, da sowohl der Reinheitsgrad der verwendeten Substanzen als auch die angewandte Applikationsmethode der verschiedenen Untersuchungen entweder nicht übereinstimmten oder nicht hinreichend beschrieben wurden, so daß ein Vergleich nicht sinnvoll erscheint. Soweit vergleichbare Methoden der Substanzgewinnung und -applikation angewendet worden sind, liegen widersprüchliche Aussagen verschiedener Autoren vor: Die Angaben reichen dabei von der Feststellung der Wirtsspezifität verdünnter Mf-Rohextrakte (Molina und Krausz 1989) über die Beobachtung unterschiedlicher Sensitivitäten verschiedener Musa cv gegenüber 2,4,8-THT (Stierle et al 1991, Novak et al 1993, Okole 1995) bis zu Ergebnissen, die weder mit Rohextrakten noch mit einzelnen Fraktionen eine Musa cv-spezifische Sensitivität analog der Anfälligkeit gegenüber Mf bestimmen konnten (Upadhyay et al 1990, Natural 1990, Lepoivre et al 1993).

Demzufolge bestand die Notwendigkeit, Dosis-Wirkungsbeziehungen mehrerer Fraktionen in den verschiedenen Musa cv durch die Anwendung reproduzierbarer Methoden zur Probenaufbereitung, Isolierung und anschließenden Exposition gegenüber Wirtspflanzengewebe zu bestimmen. Diese Aufgabe wurde unterstrichen durch die zugrundeliegende Definition der Toxine als Substanzen mit pflanzengewebeschädigender Wirkung unabhängig von ihrer Struktur oder Herkunft (Stierle 1992); besondere Berücksichtigung erforderte demzufolge die Bestimmung von Konzentrationen auf molarer Basis, die einen Vergleich von verschiedenen Substanzen bezüglich ihrer Wirkung ermöglicht.

Die Untersuchung der Dosis-Wirkungsbeziehung erfolgte mit Mf-Rohextrakt, mit der durch SPE nach Hexanspülung gewonnenen Fraktion, mit 2,4,8-THT und Juglon. Die Ergebnisse unter Anwendung der ”leaf-puncture-wound overlay technique“ lassen sich mit der Aussage zusammenfassen, daß alle drei Musa cv gegenüber allen geprüften Mf-Fraktionen und Substanzen eine unterschiedliche Sensitivität aufwiesen, die jedoch nur im Falle des 2,4,8-THT eine Prüfung bezüglich der postulierten wirtsspezifischen Toxizität aussichtsreich erscheinen ließ. Dazu sind Dosen von 0.1 bis 50.0 mM 2,4,8-THT mit einer ”nominellen Reinheit“ (UV-Detektion, siehe auch Abschnitt 5.2) von durchschnittlich >90 % angewendet und die jeweilige nekrotische Wirkung auf Blattgewebe mit der beschriebenen Methode bestimmt worden. Daraus sind durch potenzierte Regressionsgleichungen für jede verwendete Musa cv Selektivitätsindizes abgeleitet worden: Im Falle der Selektivität von 2,4,8-THT ergeben die eigenen Ergebnisse Indizes von 4.47 (Cachaco, PR) und 7.44 (Yangambi km 5, HR) gegenüber Dominico Hartón (S). Gemessen an dem Kriterium von Daly und Knoche (1982) wurde damit die Mindestbedingung (Selektivitätsindex ge 10) zur Klassifizierung dieser Substanz als wirtsspezifisches Toxin in den Musa cv Yangambi km 5 und Cachaco nicht erfüllt. Nach Wheeler (1976)


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liegen die Selektivitätsindizes von HST zwischen 25 (HMT-Toxin in Mais) und 400´000 (Victorin in Hafer).

Damit konnte in keiner der experimentell durchgeführten Expositionen von Wirtsgewebe gegenüber Mf-Extrakten und deren Fraktionen hinreichende Spezifität auf der Ebene von Musa cv bestimmt werden, die auf das Vorhandensein spezifischer Insensitivität (Mechanismen zum Abbau, zur Nichterkennung oder zur raschen Regeneration geschädigter Zellen; Durbin 1983) schließen lassen. Vielmehr stehen geringe Sensitivitätsunterschiede zwischen verschiedenen Bananensorten großen Unterschieden zwischen verschiedenen Applikationstechniken gegenüber, so daß sich die aufgetretenen Widersprüche zwischen den Ergebnissen mehrerer Arbeitsgruppen eher durch methodische Unterschiede erklären lassen. Die Untersuchungen mit nachgewiesenermaßen unspezifischen Toxinen wie Juglon (Novak et al 1993) unter Anwendung verschiedener Applikationstechniken (”leaf-puncture-wound overlay technique“ nach Stierle 1992, ”leaf disk infiltration technique“ nach Lepoivre und Acuna 1990) sprechen für die Wirksamkeit morphologischer Einflüsse (unter-schiedliche Stomataverteilung und -durchmesser bzw. -öffnung, Adsorption von Substanzen im kutikulären Bereich usw.), die bei der Anwendung von Vakuuminfiltrationstechniken überwunden werden. Die bei Yangambi km 5 gemessene höhere Leitfähigkeit und damit geringere Insensitivität gegenüber Juglon ist damit als Ergebnis eines engeren Kontaktes zwischen dem Analyt und dem hypothetischen Wirkungsort wie Plasmalemma und Zellorga-nellen anzusehen.

Weiterhin ist bei allen Versuchen unter Verwendung von Naturprodukten wie dem 2,4,8-THT die fehlende Standardisierung der Gewinnungsmethoden zu berücksichtigen, die oftmals nicht einmal einen Vergleich zwischen verschiedenen Ergebnissen erlauben: Mit Ausnahme des Juglon müssen alle untersuchten Pentaketidmetaboliten aus Kulturfiltraten gewonnen werden, wobei die Inkubations- ebensowenig wie die Extraktions- und Reinigungsbedingungen standardisiert sind und die eingesetzten Substanzen keineswegs die von Yoder (1981) geforderten Kriterien zur Reinheit erfüllen. Unterschiedliche Befunde zur Wirkung von Toxinen sind somit grundsätzlich erklärbar durch verschiedene Trenn- und Reinigungsverfahren, die die Reinheit der betreffenden Substanz beeinflussen. Weitergehende Aussagen können aber oft nicht getroffen werden, da die veröffentlichten Daten keine Hinweise auf sekundäre Bestandteile der als ”rein“ bezeichneten Toxinfraktionen geben.

Insgesamt entsprechen die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen bezüglich der Wirtsspezifität von Mf-Metaboliten der jeweils von Lepoivre et al (1993) und von Okole (1995) formulierten Schlußfolgerung, die Inkompatibilität der HR-Sorten von Musa cv beruhe nicht auf einer Insensitivität gegenüber dem bzw. den Mf-Toxin(en) und diese spielten keine entscheidende Rolle in der frühen Phase der Pathogenese. Diese Einschätzung wird durch einen


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Vergleich zwischen den Ergebnissen der in vitro-Kultur von Mf mit den Ergebnissen der in vivo-Inokulation verschiedener Musa cv mit dem Myzel des Erregers unterstützt: Auf der einen Seite wichen die Konzentrationen an 2,4,8-THT in verschiedenen Mf-Isolaten nach Inkubation in Nährsuspensionen deutlich voneinander ab (siehe Abbildung 22), auf der anderen Seite ließen die Inokulationen von Musa cv mit verschiedenen pilzlichen Isolaten keinerlei Unterschiede in ihrer Pathogenität oder Virulenz gegenüber der Wirtspflanze erkennen, die mit dem in vitro-Gehalt an 2,4,8-THT korreliert sind.

Ein weiterer Ansatzpunkt für die Frage nach der Spezifität pilzlicher Metaboliten in Wirt-Pathogeninteraktionen kann durch eine Anwendung des von Walton und Panaccione (1993) formulierten Diktums gewonnen werden, demzufolge die Bedeutung von HST durch eine Analyse der genetischen Korrelation verschiedener Wirtspflanzen und Pathotypen des Erregers untersucht werden kann:

Bezüglich des Pathosystems Musa sp/Mf sind unter Berücksichtigung der kurzen evolutiven Entwicklung in wenigen Jahrzehnten (Stover 1978) folgende Ableitungen zu formulieren: Der Erreger befällt Bananensorten der taxonomischen Untergruppe Cavendish (Genom AAA), die seit den 30er Jahren zur Bekämpfung der Panamakrankheit (Fusarium oxysporum f. sp. cubense) in allen Anbauregionen eingeführt worden sind (Jeger et al 1995). Mf-Pathogene fanden also genotypisch weitgehend uniforme Bestände vor, die durch die vorherrschende Vermehrung durch Klonung nur über einen sehr begrenzten Genpool verfügen und diesen infolge von Sterilität weitgehend konservieren (Price 1995). Die Beobachtung eines engen zeitlichen Zusammenhanges von der Einführung homogener Wirtspflanzen und dem Auftreten der bis dahin unbekannten Schwarzen Sigatokakrankheit legt den Vergleich mit den ”klassischen“ Beispielen von Pathosystemen nahe, in denen HST eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielen: Die Einführung von Haferkronenrost-resistenten Sorten und deren Anfälligkeit gegenüber Victorin und dessen Erreger Cochliobolus carbonum (siehe Beispiel 1), die Ausdehnung der Anbaufläche von TMS-Mais und nachfolgende Verbreitung des Erregers Cochliobolus heterostrophus mit dem wirtsspezifischen HMT-Toxin, sowie die Einführung der Birnensorte Nijisseiki in Japan und das Auftreten der Schwarzfleckenkrankheit durch den Erreger Alternaria kikuchiana mit den AK-Toxinen 1 und 2 (Pringle und Scheffer 1964, Nishimura und Kohmoto 1983) standen in engem chronologischen Zusammenhang. Dieser ist im Falle von Musa sp/Mf jedoch deutlich geringer ausgeprägt, da der Erreger auch Bananenpflanzen anderer genetischer Zusammensetzung befällt (Abschnitt 2.4.4, Tabelle 3) und die Reaktionen gegenüber dem Pathogen nicht nur qualitativ (anfällig vs resistent, sensitivvs insensitiv), sondern quantitativ (graduelle Skalierung) beschreibbar sind.

Seitens des Erregerorganismus sprechen dessen spätes Auftreten und schnelle Ausbreitung für mutative Veränderungen an einem oder wenigen für die Kodierung von Pathogenität


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und Virulenz verantwortlichen Genloci, durch die sich aus einem hypothetisch vorhandenen Apathogen bzw. unbedeutendem Saprophyten innerhalb kurzer Zeit der bedeutendste pilzliche Krankheitserreger der Wirtspflanze Musa sp evolutiv entwickeln konnte. Bei Vorhandensein des Pentaketid-Metabolismus innerhalb von Mf (Wheeler 1983) kann schon die Veränderung eines einzigen Enzymes, wie z. B. durch die Hemmung zweier spezifischer Reduktasen durch den synthetischen Wirkstoff Tricyclazol® experimentell belegt, die Synthese von 2,4,8-THT und damit die Interaktionen zu Musa cv entscheidend beeinflussen. Ein weiteres Indiz für eine mono- oder oligogene Basis von Pathogenität und Virulenz ist in dem von Fullerton und Olsen (1995) beobachteten ”breakdown of resistance“ der HR-Sorten Paka (Genom AA) und T8 (AAAA) gegenüber Mf zu sehen, die allerdings in den Resistenzausprägungen multipler rezessiver Allele (vgl. Abschnitt 2.4.4) sehr unwahrscheinlich sind.

Im Hinblick auf die vorliegende Arbeit wurde mit der Verwendung von drei Musa cv eine die gesamte Spannbreite der Reaktionen gegenüber Mf repräsentierende Auswahl getroffen. Die verwendeten Musa cv unterscheiden sich allerdings aufgrund ihrer genetischen Konstitution in sehr vielen Merkmalen voneinander; eine genetische Analyse der Nachkommenschaft ist aufgrund der Gametensterilität nicht möglich. Im Falle des Erregerorganismus Mf erforderte die fehlende Bestimmung physiologischer Rassen eine Überprüfung der verfügbaren Isolate im Hinblick auf ihre Pathogenität und Virulenz gegenüber Musa cv sowie eine Analyse von ausgewählten Sekundärmetaboliten, die mit der Fähigkeit zur Pathogenese in Verbindung gebracht werden.

5.3.2. Funktionen des 2,4,8-THT in kompatiblen und inkompatiblen Musa cv/Mf-Interaktionen

Die Interpretation der Untersuchungen zur Spezifität verschiedener Musa cv gegenüber Mf-Sekundärstoffen einerseits sowie deren Reaktionen gegenüber einer Inokulation mit dem Myzel des Erregers Mf andererseits sind dahingehend zusammenzufassen, daß die pflanzliche Abwehr gegenüber dem Pathogen und dessen Metaboliten in der Frühphase inkompatibler Interaktionen nicht auf einer verminderten Sensitivität resistenter Sorten beruht. Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse muß die Funktion pilzlicher Substanzen innerhalb des Pathosystems unabhängig von der postulierten Rolle als HST bestimmt werden. Dabei ist dem 2,4,8-THT als derjenigen Substanz, die unter in vitro-Bedingungen bedeutende Gehalte aufweist und durch natürliche und synthetische Wirkstoffe stark gesteigert werden kann, eine besondere Bedeutung zuzumessen.

In diesem Zusammenhang bot das in vivo-Versuchssystem inokulierter Musa cv unter Anwendung von Tricyclazol® die Möglichkeit, die Wirkungen einer gesteigerten 2,4,8-THT-Synthese auf den pflanzlichen Interzellularraum unter naturnahen Infektionsbedingungen zu


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untersuchen. Die Ergebnisse der diesbezüglichen in vitro-Versuche an Mf-Nährsuspensionen lassen einen höheren Gehalt an 2,4,8-THT und eine dadurch hervorgerufene schnellere Ausprägung der Blattsymptome mit früherem Erreichen der nekrotrophen Phase erwarten; tatsächlich wurde durch die Anwendung des Wirkstoffes Tricyclazol® das Erreichen von Stadium 2 der Symptomentwicklung (Skalierung nach Fullerton und Olsen 1991) bei allen drei Musa cv einschließlich der HR-Sorte Yangambi km 5 schon innerhalb von 10 Tagen nach Inokulation und Wirkstoff-Applikation erreicht. Dieser Wirkstoff, der als Fungizid in Pathosystemen eingesetzt wird, deren Erreger durch eine Hemmung der Melaninbiosynthese ihre Pathogenität einbüßen (Pyricularia oryzae in Reis [Viviani et al 1993, Kawamura et al 1997]), führt bei Anwendung gegenüber Mf in Musa sp zu einer gegenteiligen Wirkung: Die Hemmung des Reduktasesystems zur Biosynthese von Melanin führte zur Akkumulation des Zwischenproduktes Flaviolin und zu einem verstärkten Aufbau von 2,4,8-THT, durch dessen Wirkung in allen experimentell untersuchten Bananensorten eine schnellere und stärkere Nekrotisierung erreicht wurde. Damit liegt ein weiterer Beleg für die geringe Spezifität des untersuchten 2,4,8-THT gegenüber verschiedenen Musa cv vor, setzt doch die Hypothese einer höheren Insensitivität resistenter Bananen die deutlich verringerte Ausprägung nekrotischer Symptome im Vergleich zu anfälligen Sorten voraus. Die schnelle Entwicklung von Blattnekrosen in Yangambi km 5 bei Anwendung von Tricyclazol® bestätigt dagegen die Er-gebnisse geringer Wirtsspezifität in den Dosis-Wirkungsbeziehungen verschiedener Musa cv.

Damit kann 2,4,8-THT zunächst als Virulenzfaktor angesehen werden, der unter natürlichen Bedingungen nach erfolgreicher Infektion und Besiedelung der Wirtspflanze wesentlich an der Symptomausprägung in der späten (nekrotischen) Phase der kompatiblen Wirt-Pathogeninteraktion beteiligt ist. Diese Bestimmung entspricht der von Jones (1990) beschriebenen Rolle von Toxinen als sekundären Faktoren innerhalb von Pathosystemen, in denen die physiologische Konzentration des Metaboliten im Wirtsgewebe zur Virulenz des Erregers proportional ist.

Im Falle der weitgehenden Nekrotisierung der gesamten Blattspreite durch die Wirkung des Tricyclazol® auf die Produktion von 2,4,8-THT wurde jedoch gleichzeitig die weitere Ausbreitung des Pilzes bei vollständiger Symptomentwicklung in allen Musa cv gehemmt und die Entwicklung eines kompatiblen Wirt-Pathogenverhältnisses verhindert. Gleichzeitig deuten die nekrotischen Bereiche auf der nichtinokulierten Blatthälfte auf die Wirksamkeit des von Wheeler (1981) als Telepathogenese bezeichneten Phänomens hin, das als räumlich entfernte Krankheitsursache ohne physischen Kontakt mit der Pflanze definiert worden ist. Demnach führt eine gesteigerte Synthese von 2,4,8-THT zu einer Dislozierung der Substanz im Blattgewebe über die Mittelrippe hinaus und zur Ausprägung von nekrotischen Symptomen in räumlicher Distanz zu den Penetrationshyphen von Mf.


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Die Wirkung einer kombinierten Behandlung durch Mf-Inokulation und Anwendung des Wirkstoffes Tricyclazol® kann in Anlehnung an die Ergebnisse von de Wit et al (1993a) im Pathosystem Tomate/Cladosporium fulvum als ”zerstörerische HR“ interpretiert werden, bei der die Induktion eines pflanzlichen Abwehrmechanismus in Zusammenhang mit dem hypersensitiven Absterben von Pflanzenzellen nicht auf die unmittelbare Umgebung des Pathogens beschränkt bleibt, sondern systemisch die gesamte Pflanze erfaßt.

Die vorliegenden Ergebnisse deuten auch im Fall von Musa sp/Mf auf einen Zusammenhang zwischen der Nekrotisierung von Blattgewebe auf der einen Seite und der Induktion von Resistenzmechanismen auf der anderen Seite hin, die auch der Diskussion um die Rolle von pilzlichen Sekundärmetaboliten in den beiden angesprochenen Beispielen, Hafer und Tomate, zugrundeliegen: Damit ist die experimentelle Anwendung von Mf-Extrakten und deren Bestandteilen wie 2,4,8-THT zur Selektion resistenter Bananenpflanzen nicht mehr durch die spezifische Insensitivität gegenüber den Erregersubstraten zu erklären, sondern durch die Elizitierung pflanzlicher Abwehrmechanismen in den benachbarten Bereichen nekrotisierter Zellen. Auch durch subletale Dosen der pilzlichen Substanzen kann ein erhöhtes Maß an Resistenz gegenüber dem Pathogen induziert werden (Lazarovits und Higgins 1979). Wie beständig die auf diese Weise gewonnenen Adaptationen eine Abwehr von Pathogenen bewirken und welches Maß an Spezifität den Mechanismen zugrunde liegt, kann nur durch weitere diesbezügliche Untersuchungen bestimmt werden. Die postinfektionelle Aktivierung von PAL in selektierten und regenerierten Musa cv Horn (Okole 1995) deutet auf die Wirksamkeit von Abwehrmechanismen hin, die auch in der resistenten Sorte Yangambi km 5 nachgewiesen worden sind.

Die Fähigkeit des Erregers zur Pathogenität und der Entwicklung einer kompatiblen Wirt-Pathogeninteraktion entscheidet sich in der ersten Phase der Infektion: Mf ist in der Lage, Musa zu besiedeln, ohne 2,4,8-THT in toxischen Dosen zu produzieren und in physiologisch relevanten Konzentrationen im Apoplasten wirksam zu werden. Die Abwehr von Mf durch Musa cv Yangambi km 5 wird durch Mechanismen hervorgerufen, die durch die HR und weitere postinfektionelle Abwehrmechanismen zur Hemmung und Verhinderung des pilzlichen Wachstums im Frühstadium der Infektion führt und damit die Synthese von 2,4,8-THT verhindert.

Auf dieser Basis ist die Frage nach der Spezifität von Mf-Metaboliten gegenüber verschiedenen Musa cv neu zu formulieren: Beruht diese in Übereinstimmung mit den eigenen Ergebnissen nur in sehr geringem Maße auf einer Musa cv-spezifischen Sensitivität gegenüber 2,4,8-THT, so wird die Synthese dieser Substanz des pilzlichen Pentaketidmetabolismus aber in starkem Maße durch die Bananensorte beeinflußt. Die diesbezüglich festgestellte Förderung des 2,4,8-THT durch aktivierende Substanzen des Interzellularraumes der resistenten Sorten


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Cachaco (PR) und Yangambi km 5 (HR) weist auf eine spezifische Interaktion zwischen beiden Organismen hin: Diese wird durch eine sortenspezifische Beeinflussung des pathogenen Sekundärstoffwechsels einerseits und durch dessen Einwirkung auf die Pflanze andererseits charakterisiert, von deren quantitativem Ausmaß zu gegebenem Zeitpunkt die Entwicklung eines kompatiblen oder inkompatiblen Wirt-Pathogenverhältnisses bestimmt wird. Die im vorhergehenden Abschnitt formulierte Alternativhypothese zur Funktion des 2,4,8-THT läßt sich mit Verweis auf die eigenen Versuchsergebnisse folgendermaßen zusammenfassen:

Anknüpfend an die Arbeiten von Bailey (1983, 1991) und Bailey und O´Connell (1989) im Pathosystem Buschbohne/Colletotrichum lindemuthianum lassen sich die eigenen Versuchsergebnisse in folgenden chronologischen und inhaltlichen Zusammenhang bringen:


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Mf-Inokulum bildet Penetrationshyphen und

dringt in das substomatäre Gewebe aller Musa cv vor

darr

der pilzliche Metabolismus wird durch Aktivatoren der HR-Sorte Yangambi km 5 und in geringerem Maße auch der PR-Sorte Cachaco zur verstärkten Synthese von 2,4,8-THT angeregt

darr

im Bereich der Infektionsstellen verursachen die aktivierenden Substanzen nekrotische Läsionen, die mit der Induktion von Abwehrmechanismen in benachbarten Zellen, wie der Aktivierung von PAL und der Synthese postinfektioneller Wirkstoffe, einhergehen und zur Hemmung des pilzlichen Wachstums (graduelle Reaktion proportional zur physiologischen Konzentration des 2,4,8-THT) führen

darr

Absterben des Erregers

darr

in der anfälligen Sorte Dominico Hartón sind keine Veränderungen des Mf-Metabolismus nach Infektion nachweisbar, die PAL-Aktivität steigt nur sehr geringfügig und der weiteren Ausbreitung des Pilzes bei biotropher Ernährung sind keine pflanzlichen Abwehrmechanismen entgegengesetzt

darr

die Pathogenese wird fortgesetzt bei steigender Synthese und /oder Akkumulation von 2,4,8-THT mit der Folge ausgeprägter nekrotischer Symptome in der gesamten besiedelten Blattspreite

darr

der pilzliche Metabolismus geht in die nekrotrophe Phase über und bildet sexuelle und asexuelle Fortpflanzungsorgane

Der solchermaßen postulierte Verlauf der Interaktionen zwischen Mf und Musa cv führt also je nach physiologisch wirksamer Konzentration des 2,4,8-THT zu einer Nekrotisierung von Pflanzengewebe, deren Bildungsgeschwindigkeit und Ausmaß über das Wirt-Pathogenverhältnis hinsichtlich der Inkompatibilität oder Kompatibiltät entscheidet. Diese Art der Interaktion ist auch von Lazarovits und Higgins (1979) im Pathosystem Tomate/Cladosporium fulvum untersucht worden, in dem subletale Konzentrationen des Toxins in der Pflanze als Folge einer Abwehrreaktion durch resistente Sorten zu toxischen Dosen gesteigert wurden. Im Falle der vorliegenden Interaktion zwischen Musa sp und Mf erlaubt die hemibiotrophe Lebensweise des Erregers die Bestimmung verschiedener Funktionen eines pilzlichen Sekundärstoffes, namentlich als Elizitor gegenüber heterologen Musa cv in der frühen Phase der Inkompatibilität sowie als Toxin im Rang eines Virulenzfaktors gegenüber homologen Wirtspflanzen in der nekrotrophen Phase des kompatiblen Pathosystems. Inwieweit die genetische Grundlage dieser biochemischen und physiologischen Interaktionen von dem AVR/avr-Genlocus (dominante Avirulenz, rezessive Pathogenität) kodiert wird und damit der


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Elizitor bzw. das Toxin als AVR-Produkt (Gabriel 1989) angesehen werden kann, ist mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestimmbar. Bezüglich ihrer Funktion entspricht die Wirkung von 2,4,8-THT in der Initialphase der eines Elizitors: Nach Bailey und O´Connell (1989) sind toxische Effekte in kleinräumigem Maßstab als elizitorische Wirkung zu bezeichnen, die zu Phytoalexinbildung und der Ausprägung resistenter Interaktionen führt.

In diesem Zusammenhang soll auf das von Gabriel und Rolfe (1990) entwickelte Modellsystem der pflanzlichen Ionenkanal-Abwehr verwiesen werden, das das Vorhandensein verschiedener Membranrezeptoren als Produkte der Resistenzgene postuliert. Diese Rezeptoren interagieren mit den als toxisch bezeichneten Produkten der pilzlichen AVR-Gene und induzieren einen Elektrolyt- (insbesondere Kalzium-) Flux in die Pflanzenzelle, der weitere aktive Abwehrreaktionen hervorruft. Das Modell ist in der Lage, die dosisabhängige Wirkung von Resistenzgenen, die auch für Musa sp postuliert worden ist (Ortiz und Vuylsteke 1994, Ortiz 1995), mit der Anzahl von Rezeptorzellen zu erklären, und geht von der Wirksamkeit einer sich ausbreitenden (”spreading“) HR in der Pflanze aus, deren Ausmaß zu der Wirkung von Elizitoren einerseits und Rezeptoren andererseits proportional ist.

Folgende Abbildung faßt die Versuchselemente synoptisch zusammen, wobei die versuchsbedingte Einteilung in die drei Referenzsorten Yangambi km 5, Cachaco und Dominico Hartón als Beispiele für mögliche Reaktionen gegenüber Mf auf einem Kontinuum möglicher Reaktionen zwischen Resistenz und Anfälligkeit steht:

Abb. 44 Synoptische Darstellung der zeitlichen Abfolge biochemischer und physiologischer Inter-aktionen von Mf und dessen Metaboliten 2,4,8-THT mit verschiedenen Musa cv


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Dabei ist zu betonen, daß die einzelnen Elemente der Darstellung auf Ergebnissen aus den in vitro- und in vivo-Versuchssystemen der vorliegenden Arbeit beruhen, die Anordnung in der angenommenen Reihenfolge aber nur hypothetisch unter Zuhilfenahme von Ergebnissen aus anderen Wirt-Pathogenverhältnissen erfolgen kann. Dies gilt in besonderem Maße für die aus den Mf-Inkubationsversuchen unter in vitro-Bedingungen abgeleiteten Konzentrationen von 2,4,8-THT und dessen Wirkungen zu verschiedenen Zeitpunkten im natürlichen Pathosystem, aus dem eine Extraktion und Bestimmung pilzlicher Sekundärstoffe aus methodischen Gründen kaum durchführbar ist (Yoder 1981). Im Falle der erwähnten Untersuchungen spezifischer Toxine bzw. Elizitoren des Pathogens bei Tomate/Cladosporium fulvum (De Wit et al 1993a) ist zu betonen, daß das Produkt des pilzlichen Avirulenzgenes (AVR9) nur in der befallenen Pflanze, nicht aber in der pilzlichen Zellsuspension nachgewiesen worden ist, so daß der Wirtsorganismus für die Induktion des Pilzelizitors mitverantwortlich sein muß (Elstner et al 1996).

5.4. Schlußfolgerungen und Ausblick

Die in der Einleitung formulierte Fragestellung bezüglich der postulierten Funktion ausgewählter Mf-Sekundärmetaboliten als wirtsspezifische Toxine (HST) läßt sich im Anschluß an die in der Diskussion vorgenommene alternative Interpretation der vorliegenden Ergebnisse folgendermaßen beantworten:

Eine weiterführende Zielsetzung der Bestimmung von Resistenzfaktoren der Wirtspflanze einerseits sowie von Pathogenitätsfaktoren des Erregers andererseits erfordert eine Überprüfung der hier formulierten Hypothese über die möglichen Funktionen des 2,4,8-THT in verschiedenen Interaktion mit Musa cv durch die Einbeziehung weiterer Sorten der Wirtspflanze und Isolate des Erregers.


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Bezüglich der Wirtspflanze Musa sp ist in diesem Zusammenhang die Identifizierung der pflanzlichen Aktivatoren, die zu einer Beeinflussung der pilzlichen Synthese von 2,4,8-THT in resistenten Sorten beitragen, von Bedeutung. Außerdem sind die kausalen Beziehungen zwischen der HR und der Induktion weiterer Abwehrmechanismen wie der Aktivierung von PAL und der Synthese fungizider Sekundärmetaboliten zu untersuchen: Das von Bailey (1989) angewandte Verfahren zur Immunlokalisierung mit Hilfe von PAL-Antikörpern erlaubt in der frühen Phase der Wirt-Pathogeninteraktion eine kleinräumige Lokalisierung von nekrotischen und PAL-aktivierten Zellen im Bereich der Infektionshyphen. Im Hinblick auf die Bedeutung von Phytoalexinen liegen Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen vor (Mourichon et al 1990, Luis et al 1993, 1996, vorliegende Arbeit), deren Zusammenführung zur Bestimmung von Struktur und Funktion phytoalexiner Substanzen und der Identifizierung von deren Biosynthesewegen im pflanzlichen Stoffwechsel führen könnte. Die Nutzung von Zellsuspensionen und Kalluskulturen der Wirtspflanze ist in diesem Zusammenhang erfolgversprechend, ist aber von weiteren Fortschritten in der in vitro-Kulturtechnik verschiedener Musa cv und der Etablierung von Referenzsorten zur weiteren experimentellen Untersuchung abhängig.

Seitens des Erregerorganismus Mf ist der in der vorliegenden Arbeit mit Erfolg angewendete Wirkstoff Tricyclazol® zur weiteren Untersuchung der biochemischen Regulierung des pilzlichen 2,4,8-THT nutzbar; in Verbindung mit genbiologischen Methoden (Carlier et al 1993, 1994) ist eine Identifizierung der die Pathogenität bzw. Avirulenz kodierenden Abschnitte des Erregers möglich.

In diesem Zusammenhang hat das von der Arbeitsgruppe um De Wit untersuchte Wirt-Pathogenverhältnis Tomate/Cladosporium fulvum den Status eines Referenzsystems errungen, da erstmals die Isolierung eines die pilzliche Avirulenz kodierenden Genes (AVR9) gelungen ist (De Wit et al 1993a), mit dessen Produkt die Identifizierung des korrespondierenden Resistenzgenes in der Pflanze (Cf9) erfolgte (Elstner et al 1996). Diesbezüglich wird über die Ausnutzung der phänotypisch als ”zerstörerische HR“ auftretenden Form der pflanzlichen Abwehr durch einen Transfer beider Gene als Zweikomponentensystem (Cornelissen und Melchers 1993) in den Wirtsorganismus diskutiert und eine Regulierung von deren Expression zur Steuerung durch angreifende Pathogene angestrebt: Das die HR induzierende Gen darf dabei nicht konstitutiv exprimiert werden, sondern muß durch einen Promotor aktiviert werden, der die Reaktion lokal und zeitlich begrenzt (De Wit et al 1993a). Die Induktion kann sowohl durch spezifische als auch durch unspezifische Erreger ausgelöst werden (Cornelissen und Melchers 1993, Elstner et al 1996).

Die praktische Bedeutung der vorliegenden Ergebnisse im Pathosystem Musa sp/Mf für weitere Untersuchungen ist in der Bestimmung natürlicher Resistenzmechanismen in der Wirtspflanze Musa sp zu sehen, deren Ausnutzung zu einer bevorzugten Methode eines


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zeitgemäßen Pflanzenschutzes angesehen wird. Dabei sind folgende Möglichkeiten einer Anwendung natürlicher Resistenzphänomene gegeben (Elstner et al 1996):

Die botanischen Charakteristika von Musa sp haben einerseits die Anwendung konventioneller Züchtungsmethoden weitgehend verhindert, ermöglichen andererseits aber die Konservierung der erreichten Fortschritte in der genetischen Verbesserung erwünschter Eigenschaften. Die durch die Arbeiten von Sági et al (1994, 1995) entwickelte Methode einer genetischen Transformation von Musa sp erlaubt eine Ausweitung der Perspektiven intra- und interspezifischen Gentransfers und somit eine Nutzung spezifischer Abwehrreaktionen als Alternative zu chemotherapeutischen Verfahren.

Die Ergebnisse des in der vorliegenden Arbeit untersuchten Pathosystems Musa sp/Mf könnten diesbezüglich zur Identifizierung von Avirulenzgenen des Erregers und deren korrespondierender Resistenzgene beitragen und eine Nutzung von Abwehrreaktionen in der Wirtspflanze ermöglichen.


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