Jahn, Mareile: Untersuchungen zum Einfluß selektierter arbuskulärer Mykorrhizapilze (AMP) und assoziativer Rhizosphärenbakterien einzeln und kombiniert auf das Wachstum und den Zierwert von Zierpflanzen für den urbanen Bereich

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Versuchsorganismen

Wirtspflanzen

Arbuskuläre Mykorrhizapilze (AMP)

Bakterien

2.2. Versuchsstandorte und Versuchsböden

2.2.1. Charakterisierung der Versuchsstandorte

Es wurden urbane Standorte in Berlin-Köpenick, sowohl anlehmige Sandböden des Versuchsgeländes des Institutes für Gartenbauwissenschaften als auch eine extrem nährstoffarme Verkehrsinsel in der Stadtmitte von Berlin-Köpenick, für die zweijährigen Versuche ausgewählt. Kennzeichnend für beide Standorte waren geringe Nährstoffsorptionsgehalte (Tab. 4) und abiotische (Trockenheit, Abgase) sowie biotische (Krankheitsbefall) Streßbelastungen. Die natürlichen Bedingungen für ein optimales Pflanzenwachstum waren auf beiden Standorten nicht gegeben. Deshalb wurden auf diesen anlehmigen Sandböden Untersuchungen zum Einfluß von AMP und Bakterien auf das Wachstum und den Zierwert von Zierpflanzen durchgeführt.

Extremer urbaner Standort (Verkehrsinsel)

Die Wirkungen von AMP (VAM3, Isolat 49) an Tagetes wurden unter Trockenstreß auf der Verkehrsinsel geprüft. Wirkungen assoziativer Rhizosphärenbakterien auf diesem extremen Standort wurden aus Zeitgründen im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Der anlehmige Sand (Bodentyp Pararendzina) war durch starke Bodenverdichtungen und einen dichten Grasbewuchs gekennzeichnet. Der Ct-Gehalt betrug 2000 mg/100 g Boden.


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Urbaner Standort (Versuchsfeld)

Die Vorkulturen des Standortes waren von 1984 bis 1993 Rosa-Hybriden und 1993/94 Phacelia tanacetifolia BENTH.. Weitere Zusatzuntersuchen sind in Tab. 1 dargestellt.

Tab. 1: Übersicht über Freilandversuche von 1991 bis 1997 auf urbanen anlehmigen Sandböden des Institutsgeländes in Berlin-Köpenick (Versuchsfeld)

   

Jahr

Versuchsfrage

   
   

1991/92

Einfluß einer Kombinationsimpfung von VAM3 mit PsIA12 ohne bzw. mit organischer Düngung (Tonmudde/Torf (6 kg/m²) an Tagetes

1991/92

Einfluß einer Kombinationsimpfung von VAM3 mit PsIA12 ohne bzw. mit mineralischer Grunddüngung an Tagetes

1992

Einfluß einer Kombinationsimpfung von VAM3 mit PsIA12 ohne bzw. mit mineralischer Langzeitdüngung an Tagetes

1995

Wirkung von AMP und Bakterien auf die nicht inokulierte Folgekultur Tagetes

1995/97

Einfluß einer Kombinationsimpfung von VAM3 mit PsIA12 ohne bzw. mit organischer Düngung (Humussubstrat-Lehm (0,7 l/Gefäß) an Miscanthus

   

Folgende Eigenschaften kennzeichneten den Standort:

Bodenart: anlehmiger Sand

Bodentyp: Rostbraunerde

Luftkapazität [Vol.-%]: 11,4

Wasserkapazität [Vol.-%]: 36,0

Porenvolumen [Vol.-%]: 48,0

Zusätzlich wurden folgende Nährstoffgehalte [mg/100 g Boden] ermittelt:

MgO: 27,0

Mn: 3,6

Cu: 0,4

Ct-Gehalt: 2440,0

Tab. 2: Anteile der Bodenstruktur nach dem Teilchendurchmesser (Versuchsfeld), Angaben in [%]

   

Bodenschicht

Ton

Schluff

Sand

[cm]

 

Fein

Mittel

Grob

Fein

Mittel/Grob

             
             

0 - 10

1,7

<1

1,4

3,0

33,3

60,2

10 - 20

1,5

<1

1,7

3,7

26,0

66,4

20 - 30

1,6

<1

1,0

3,2

30,8

63,1

30 - 60

1,5

<1

1,0

3,0

26,5

67,5

             


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Die weitere Bestimmung der Korngrößen erfolgte nach der Köhn’schen Pipettanalyse. Der Karbonat-(3,0 % CaCO3) und Humusgehalt (5,7 %) des Bodens wurde vorher zerstört. Danach wurde der Feinboden (d < 2 mm) dispergiert. Die Unterteilung in unterschiedliche Korngrößenklassen erfolgte nach unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeiten in Abhängigkeit von der Korngröße und der Dichte der Bodenmasse.

Korngrößen des anlehmigen Sandbodens (Versuchsfeld, Angaben in %):

Sand: 92,0

Schluff: 5,2

Lehm: 2,6

2.2.2. Bestimmung der Nährstoffgehalte der Böden

Monatliche Bodenanalysen erfolgten zur Bestimmung der Nährstoffgehalte der verschiedenen Böden beider Standorte und zur Beurteilung der nährstofferschließenden Wirkung inokulierter Mikroorganismen. Jeweils zehn Bodenproben wurden mit dem Bodenentnahmegerät aus der obersten Bodenschicht (0 - 30 cm) entnommen und zu einer Mischprobe vereinigt. Die edaphischen Eigenschaften der Anzuchtböden (1991 - 1996) sind im Anhang IV Tab. A3 und die der Freilandböden in Tab. 3 dargestellt. Die Nährstoffgehalte der Böden wurden wie folgt analysiert:

Tab. 3: Angaben zu den edaphischen Eigenschaften der Freilandböden (1991 - 1997), Bodenanalyse 1 (mg/100 g Boden; Bodentiefe 0 - 30 cm)

                 

Standort

Kultur

Nt

NO3-N

NH4-N

P2O5

K2O

pH-Wert

Salz [g/l]

                 
                 

Versuchsfeld

Tagetes

18.0

5,0

6,0

4,3

20,7

5,7

0,1

 

Gladiolen

20,0

10,0

6,0

28,3

46,0

5,7

0,1

 

Miscanthus

27,0

10,0

18,0

4,8

25,7

6,8

0,6

                 

Verkehrsinsel

Tagetes

4,4

3,8

1,5

8,5

2,9

6,9

0,2

                 

1Es wurden Mittelwerte der monatlichen Bodenanalysen von den verschiedenen Versuchen je Standort angegeben.


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2.2.3. Bestimmung der Sorptionskapazität

Die Sorptionskapazität wurde zur Einschätzung des Nährstoffsorptionsvermögens der anlehmigen Sandböden beider Standorte ermittelt (Tab. 4). Die Bestimmung des Sorptionsvermögens der Böden erfolgte nach der Methylenblau-Methode (PETER et al., 1959; RIEHM, 1982) durch die Fa. INU Umweltberatung & Analytik GmbH, Berlin. Die Versuchsböden wurden dazu mit 0,5 % Methylenblaulösung geschüttelt. Dabei sorbierte der Boden Farbstoff. Die volumetrische Messung der Methylenblau-Restkonzentration erfolgte bei 570 nm. Das Nährstoffsorptionsvermögen beider Standorte war gering (Tab. 4). Im Vergleich dazu gelten bei einer Sorptionskapazität von 11 mval/100 g Boden intensiv genutzte Freilandböden als gut nährstoffversorgt (DREWS, 1968; GÖHLER und DREWS, 1978).

Tab. 4: Sorptionskapazität [mval/100 g Boden] der anlehmigen Sandböden des Versuchsfeldes und der Verkehrsinsel (Bodentiefe 0 - 30 cm)

   

Standort

Sorptionskapazität [mval/100 g Boden]

   
   

Versuchsfeld

6,1

Verkehrsinsel

2,1

   

2.2.4. Beeinflussung der Versuchsböden durch organische und mineralische Düngung

Die Versuchsböden können durch organische und mineralische Düngung beeinflußt werden. Aus diesem Grund wurden Wirkungen inokulierter Rhizosphärenmikroorganismen in Kombination mit und ohne Düngungsgaben untersucht. Praxisrelevante Düngungs- und Pflanzenschutzmaßnahmen im Zeitraum von 1991 - 1996 sind im Anhang IV Tab. A4 bzw. A5 dargestellt.

Organische Düngung

1991/92 wurde der Einfluß von organischer Düngung in Höhe von 6 kg/m² bzw. 0,23 kg/Gefäß in Kombination mit VAM3 und PsIA12 bei der Tagetessorte ‘Hawaii’ geprüft. Die Düngungsgabe bestand aus 50 % Tonmudde und 50 % Niedermoortorf.

1995 bis 1997 wurde bei Miscanthus der Einfluß von VAM3 mit PsIA12 in Kombination mit bzw. ohne organische Düngung (einmalig Humussubstrat-Lehm-Gemisch, 0,7 l/7 l-Gefäß) auf das Wachstum geprüft. Die Angaben zu den edaphischen Eigenschaften des anlehmigen Sandbodens (Versuchsfeld, 1995/96) mit bzw. ohne organische Düngung und der Sorptionskapazität des Bodens sind in Tab. 5 dargestellt.


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Tab. 5: Angaben zu den edaphischen Eigenschaften des anlehmigen Sandbodens (Versuchsfeld, 1995/96) ohne und mit organischer Düngung und der Sorptionskapazität [mval/100 g Boden], Bodenanalyse 1 (mg/100 g Boden; Bodentiefe 0 - 30 cm)

 ;  ;

Düngung

Angaben in mg/100 g Boden

 

N gesamt

NO3-N

NH4-N

P2O5

K2O

pH-Wert

Salz [g/l]

               
               

ohne organische Düngung

28

10,0

18,0

4,8

25,7

6,8

0,6

mit organischer Düngung

37

15,0

22,0

8,6

33,2

6,8

0,6

               
   ;
 

Sorptionskapazität [mval/100 g Boden]

ohne organische Düngung

6,1

mit organischer Düngung

11,2

 

1 Es wurden Mittelwerte der monatlichen Bodenanalysen von den verschiedenen Versuchen je Standort angegeben.

Mineralische Düngung

Die Feldversuche wurden in vier Blöcken angelegt. Die Parzellenfläche pro Variante betrug 0,8 m × 1,25 m. 1991/92 wurde der Einfluß einer differenzierten Grunddüngung (Tab. 6) in Kombination mit VAM3 und PsIA12 auf das Wachstum von Tagetes ‘Hawaii’ im Freiland in Gefäßen (7 l) mit anlehmigem Sandboden (Versuchsfeld) geprüft.

Tab. 6: Differenzierte mineralische NPK-Düngung auf anlehmigem Sandboden (Versuchsfeld)

       

Düngungsstufen

Stickstoff in g N/m²

(46 % N)

Phosphor in g P/ m²

(18 % P2O5)

Kalium in g K/ m²

(52 % K2O)

       
       

ohne Düngung

-

-

-

1 N, 1 P, 1K

8,4

5,0

8,0

       

1992 wurden bei Tagetes ‘Hawaii’ die Wirkungen von Grund- und Langzeitdüngung (Tab. 7) in Kombination mit VAM3 und PsIA12 auf das Wachstum geprüft.

Tab. 7: Mineralische Grund- und Langzeitdüngung, monatliche Freisetzungsrate der Nährstoffe, Nährstoffverhältnis [%] und Düngermengen [g/m²]

     ;  

Dünger

Freisetzungsrate Nährstoffe

Verhältnis [%]

Düngermengen

 

[Monate]

N

P2O5

K2O

MgO

[g/m²]

             
             

Grunddüngung

Harnstoff

Superphosphat

schwefelsaures Kalium

 

46

0

0

0

18

0

0

0

52

0

0

0

11,0

32,0

18,5

Langzeitdüngung

           

Osmocote

5 - 6

15

10

12

2

50,0

Floranid N32

4

32

0

0

0

50,0

Floranid Master

3 - 4

16

5

10

5

50,0

Floranid Permanent

3 - 4

15

9

15

2

50,0

Triabon

3 - 4

16

8

12

4

50,0

Plantacote Depot

4

14

9

15

0

50,0

             


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2.3. Erfassung von Klimadaten

Die Wirkungen inokulierter Mikroorganismen können unter Freilandbedingungen in Abhängigkeit von den ökologischen Faktoren stark schwanken. Deshalb wurden mögliche Einflußfaktoren erfaßt. Der Standort Berlin-Köpenick (30 m über NN) gehört zum Klimagebiet Nord-West-Brandenburg und Raum Berlin. Im Pleistozän der Eiszeit entstand eine diluviale Talsandfläche aus Mittel- und Feinsand (Umweltatlas, 1993). Die jährliche durchschnittliche Niederschlagsmenge beträgt ca. 555 - 570 mm/a. Die Messung der Klimadaten erfolgte in der Station Berlin-Schönefeld des Deutschen Wetterdienstes Potsdam und parallel dazu über die Wetterstation MEVIS T der Fa. Thies-Clima des Institutes in Berlin-Köpenick. Ausgewertet wurden Monatswerte (Temperatur) bzw. Monatssummen der Niederschläge. Die Luft- und Bodentemperaturen sowie die Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus wurden mit Thermo- und Hydrographen und zum Vergleich mit dem Klimarechner der Fa. Krivan ermittelt.

2.4. Kultivierung und Anzucht der Wirtspflanzen

Tab. 8: Kultivierungs- und Anzuchtbedingungen der Wirtspflanzen

           

Kultur

Kultivierung

Zeit

Bedingungen

Tag/Nacht T [°C]

rel. LF [%]

           
           

Tagetes

Aussaat, ohne Zusatzlicht

Pikieren

Abhärtung

Auspflanzung

Frühjahr

GH

Freiland

18 - 22/14 - 17

17/14

Boden-T 14 - 16 (10 - 20 cm)

75 - 95

80

           
           

Gladiolen

Knollenlagerung (14 Tage)

Treiben der Knollen

Auspflanzung

(Stecktiefe 8 cm)

Winter

Frühjahr

Frühjahr

Dunkelraum

GH

Freiland

10/10

26/23

ohne Zusatzlicht

65

80

           
           

Miscanthus

Auspflanzung in 7 l- Gefäße

Abdeckung mit Rindenmulch

(200 g/Gefäß)

Entfernen der Sprosse

Herbst

Winter

Frühjahr

Freiland 1

1995

1996

1997

Luft/Boden-T 1

10 - 13 °C

10 - 20 °C

10 - 15 °C

Niederschl. 1

40 mm

40 - 160 mm

40 - 60 mm

           

1 Angaben in der Vegetationsperiode von April bis Oktober im Freiland

2.5. Anzucht von AMP und Bakterien

AMP

Die Gewinnung von VAM3-Inokulum in Torf-Bentonit-(3:1)-Substrat erfolgte mit Mais (GLANTE, 1988; HÖFLICH und GLANTE, 1991). Das Isolat 49 wurde nach einem Verfahren von DEHNE und BACKHAUS (1986) in Hydrokultur an Tagetes-Erecta-Hybriden mit dem Trägermaterial Blähton produziert. Inokuliert wurden bei allen Versuchspflanzen 160 g VAM3-Torf-Bentonit-Präparat bzw. 250 g/m² Isolat 49-Blähton pro Variante einzeln oder in Kombination mit den Bakterien.


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Bakterien

Die Anzucht der Bakterien erfolgte z.T. als Kultursuspension mit Glyzerin-Pepton-Medium (HIRTE, 1961) und z.T. als Präparat auf der Trägersubstanz Torf (HÖFLICH et al., 1987). Inokuliert wurden die Suspensionen mit einer Konzentration von 106 cfu je g Samen bzw. Pflanze und das Präparat 0,08 g/m² mit einem Titer von 108 cfu je g Präparat (Tab. 9). Die Trägersubstanzen hatten in Vorversuchen keinen Einfluß auf das Pflanzenwachstum (HÖFLICH et al., 1996).

Die Inokulation der Rhizosphärenbakterien an die Tagetessaat (6 g pro Samen) erfolgte jährlich zur Aussaat im Gewächshaus (Tab. 9). Bei Gladiolen wurden jährlich 0,6 g Bakterien-Torfpräparat pro Knolle inokuliert. Bei Miscanthus erfolgte die Beimpfung von 8,3 g Bakterien-Torfpräparat pro Wurzelballen einmalig zur Auspflanzung im Freiland. In Vorversuchen wurde nachgewiesen, daß die Inokulation zur Aussaat effektiver als zum Pikieren bzw. als die zweimalige Inokulation zur Aussaat und zum Pikieren war (JAHN, 1994).

Tab. 9: Inokulumformen und Inokulationsmethoden der Bakterien und AMP

   

 

Kultur

 

Bakterien

AMP

Anzucht

 

Jahr

Suspension

Torfpräparat

Torfpräparat

Blähton

 
             
             

Tagetes

1991/92

+

+

+

-

GH

 

1993/94

-

+

+

-

 
 

1995/96

-

+

+

+

 
             
             

Gladiolen

1995/96

-

+

+

+

Freiland

             
             

Miscanthus

1995

-

+

+

+

Freiland

             

+: angewendet, -: nicht angewendet

2.6. Bestimmung von Pflanzenwachstumsparametern

Die Auswahl der Versuchspflanzen erfolgte nach morphologisch differenzierten Pflanzentypen, nach Ein- und Mehrjährigkeit der Pflanzen und nach einfacher Ermittlung von Pflanzenwachstumsparametern. Tagetes-Erecta-Hybriden der Sorten ’Hawaii’ und ‘Yellow Supreme’ wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Ausgangskreuzungen und die Gladiolensorte ‘Frührot’ aufgrund ihrer Schnellwüchsigkeit im Vergleich zu anderen ausgewählt. Die Effektivitätsprüfung inokulierter Rhizosphärenmikroorganismen erfolgte bei allen Versuchspflanzen anhand der Sproßlängen, Sproß- und Wurzeltrockenmassen sowie der Knospen-, Trieb- und Blütenanzahlen pro Pflanze.


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2.6.1. Trockenmassen

Sproß- und Wurzeltrockenmassen

Die ausgewaschenen Sprosse und Wurzeln wurden bei 105 °C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und dann gewogen.

Knollen- und Bruttrockenmassen

Bei Gladiolen wurden auf gleiche Weise zusätzlich die Knollen- und Bruttrockenmassen zur Haupternte Ende August nach dreimonatiger Wachstumszeit im Freiland bestimmt.

2.6.2. Boniturverläufe

Blattanzahl, Pflanzendurchmesser

Zwei Monate nach der Inokulation wurden die Blattanzahl und der Pflanzendurchmesser von Tagetes-Erecta-Hybriden der Sorten ‘Hawaii’ und ‘Yellow Supreme’ im Freiland bonitiert.

Knospenbildungs- und Blühverläufe

Von Gladiolen und Tagetes wurden zwei Monate nach der Inokulation die Knospenbildungs- und Blühverläufe durch wöchentliche Bonituren erfaßt. 1995/96 wurden dazu die Knospen- und Blütenanzahlen pro 100 Tagetes der Sorten ‘Hawaii’ und ‘Yellow Supreme’ nach den Merkmalen ”knospig“, ”Blume voll erblüht“ und ”Blume bei einsetzender Verwelkung“ bonitiert.

1995 erfolgten Bonituren zur Knospen- und Blütenanzahl pro 30 Gladiolen. 1996 wurden die Blütenrispen von Gladiolen in die Gruppen ”voll erblüht“ und ”erntefähig“ eingeteilt. Von jeder Gladiolenblütenrispe wurde die Anzahl farbezeigender und nicht farbezeigender Blütenknospen erfaßt.

Triebanzahlen pro Pflanze

Bei Miscanthus sinensis ‘Gracillimus’ wurde die Triebanzahl pro Pflanze in regelmäßigen Abständen bonitiert.

Fotografische Dokumentation

Während des gesamten Vegetationsverlaufes erfolgten jährlich unter natürlichem Tageslicht fotografische Aufnahmen mit der OLYMPUS OM 4 Ti.


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2.6.3. Wurzellängen

Wurzellängenmeßgerät

Die Wurzellängen wurden mit einem Meßgerät der Fa. Commonwealth Aircraft Corporation Ltd. (Australien) gemessen. Die Berechnung erfolgte nach der Methode von NEWMAN (1966). Die Wurzeln wurden in 1 cm lange Stücke zerkleinert, gleichmäßig auf der Drehscheibe des Gerätes verteilt und 1 l Wasser zugegeben. Aus der Zahl der Unterbrechungen des Lichtstrahles durch die Wurzelstückchen errechnete das Gerät die Gesamtwurzellänge.

Bildverarbeitungsprogramm

Wurzelstücke von ca. 1 cm Länge einer Probe wurden in einer wassergefülten Glasschale (_ 17 cm) gleichmäßig verteilt. Die Wurzeln wurden mit der Videokamera aufgenommen und mit Hilfe des Bildverarbeitungs-Programmes IMAGE P2 ‘root’ der Fa. H & K Meßsysteme Berlin ausgewertet. Die Berechnung der Wurzellänge erfolgte ebenfalls nach NEWMAN (1966). Das Aufnahmesystem wurde auf die eingestellte Kamerahöhe kalibriert. Bei allen Messungen blieben die Justierungen unverändert.

Sowohl das Wurzellängenmeßgerät als auch die Videokamera waren geeignete Geräte zur Messung der Wurzellänge, wobei die Messung mit der Videokamera zeitsparender war. Überschnittene Wurzeln im Bild führten zu ungenauen Meßergebnissen. Deshalb war eine gleichmäßige Verteilung der Wurzeln erforderlich. Zur Erfassung feiner durchsichtiger Wurzelstrukturen kann in weiteren Untersuchungen eine Färbung mit Trypan-Blau-Lösung (PHILLIPS und HAYMAN, 1970) hilfreich sein.

2.7. Ermittlung der Wirkungen von inokulierten AMP und Bakterien auf die nicht inokulierte Tagetes-Folgekultur

Um die Nachhaltigkeit von Inokulationswirkungen einzuschätzen, wurden ein Jahr nach Erstbeimpfung von AMP (Glomus ssp., VAM3), Pseudomonas fluorescens (PsIA12), Agrobacterium rhizogenes (A1A4) und Rhizobium trifolii (R39), einzeln und kombiniert, die Wirkungen an der nichtbeimpften Folgekultur Tagetes auf anlehmigem Sand (Versuchsfeld) geprüft. Das Saatgut wurde breitflächig ausgesät und später pikiert. Es erfolgte keine zusätzliche Düngung. Die Mykorrhizierung der Pflanzen wurde zu mehreren Terminen nach PHILLIPS und HAYMAN (1970) bestimmt.


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2.8. Bestimmung von Wirkungsursachen für die mikrobielle Stimulierung des Pflanzenwachstums

2.8.1. Ermittlung von Stoffwechselleistungen der Bakterienstämme in Reinkultur

Die Stoffwechselleistungen der Rhizosphärenbakterien können das Pflanzenwachstum stimulieren. Deshalb wurden charakteristische Eigenschaften der Bakterien in Reinkultur untersucht. Die Identifizierung der Bakterien (A1A4, R39, PsIA12, PsIB2, PsI2) erfolgte durch Sequenzierung der DNA (HÖFLICH und KÜHN, 1996). Die Rezepturen für die einzelnen Untersuchungen sind im Anhang II aufgeführt.

Nitrogenaseaktivität

Die Messung der Azethylenreduktion in nmol C2H4/mg Protein/h wurde im CC-halbflüssigen Medium (RENNIE, 1981) unter normalem Sauerstoffdruck nach 1 h Inkubationszeit unter 10 Vol.-% Azethylen am Gaschromatographen durchgeführt (RUPPEL, 1987).

Phytohormonbildung

Die Auxine wurden modifiziert nach SARWAR et al. (1992) ermittelt.

Nitratreduktaseaktivität

Nach MÜLLER und MELCHINGER (1964) wurde das gebildete Nitrit der zu untersuchenden Bakterien bestimmt.

Phosphormobilisierung

Die Ermittlung der Phosphormobilisierung der Bakterien erfolgte nach DOMEY (1987).

Streßtoleranz

Osmotoleranz

Die Bestimmung der Toleranz gegenüber hohem osmotischem Druck erfolgte auf Glyzerin-Pepton-Agar (HIRTE, 1961) unter Zugabe von 0,8 mol NaCl je Liter. Osmotolerante Stämme konnten auf diesem Nährmedium wachsen.

pH-Wert

Die pH-Wert-Toleranz wurde anhand des Wachstums der Bakterien auf Nährmedien mit differenzierten pH-Werten von 4,0 - 8,0 beurteilt.

Pektinase und Zellulase

Die Bestimmung der Pektinase und Zellulase erfolgte nach JAYASANKOV und GRAHAM (1970).


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Antagonismus

Antagonistische Wechselwirkungen der Bakterien gegenüber bodenbürtigen Pathogenen wurden durch Ausbildung von Hemm- und Lysiszonen gegen Gaeumanomyces graminis auf Glyzerin-Pepton-Agarplatten nachgewiesen.

2.8.2. Bestimmung von Prolin in gestreßten Pflanzen

Das den Betainen zugehörige Prolin wird als Trockenstreßindikator angesehen (SINGH et al., 1973). In zwei Vegetationsperioden (1995/96) wurden bei Tagetes sowohl auf urbanen anlehmigen Sandböden (Versuchsfeld) als auch auf einer Verkehrsinsel die Wirkungen von VAM3 bzw. Isolat 49 bei Trockenstreß zu mehreren Terminen untersucht. Während der Anzuchtphase wurden insgesamt je 100 l/m² auf beiden Standorten beregnet. In der Übergangsphase vom vegetativen Wachstum zur generativen Entwicklung wurde nicht beregnet. Die Bestimmung des Prolingehaltes erfolgte modifiziert nach BATES et al. (1973).

2.8.3. Ermittlung des Besiedlungsverhaltens

2.8.3.1. Ermittlung der Mykorrhizierung durch inokulierte und durch autochthone AMP

Ermittlung der Mykorrhizierung

Eine geeignete Methode zur Beurteilung der Besiedlung von AMP in Wirtspflanzenwurzeln ist die Ermittlung der Mykorrhizierung. Die Mykorrhizierungsrate wurde in regelmäßigen Abständen während der Vegetationsperiode bestimmt. Dazu wurde eine repräsentative Wurzelanzahl der verschiedenen Versuchspflanzen entnommen. Die gewaschenen Wurzeln wurden in 1 cm lange Stücke zerkleinert. Aus jedem Wurzelabschnitt, bevorzugt feine Endwurzeln und laterale Wurzeln (ZOBEL, 1986), wurden Proben entnommen, die entweder in AFE-Lösung nach GERLACH (1969) oder in 70 % Ethanol fixiert wurden. Das anschließende Anfärben der Wurzeln erfolgte modifiziert nach PHILLIPS und HAYMAN (1970) mit Trypan-Blau-Lösung. Pro Pflanze wurden 100 zufällig ausgewählte Wurzelstücken unter dem Mikroskop (Vergrößerung 40×) auf Myzel, Arbuskeln und Vesikel bonitiert. Die Mykorrhizierungsrate wurde als prozentualer Anteil mykorrhizierter Wurzeln angegeben.

Histologische Untersuchungen AMP-inokulierter Wurzeln

Zur detaillierteren Beurteilung von AMP-infizierten Wurzeln und zur Charakterisierung typischer AMP-Strukturen in der Wurzel wurden histologische Untersuchungen durchgeführt. AMP-infizierte Wurzelstücke wurden nach Entlüftung 24 h in Carnoy’scher Lösung (6 Teile 96% Alkohol, 1 Teil Eisessig, 3 Teile Chloroform) fixiert. Die Entwässerung der Wurzeln erfolgte schrittweise durch zweimaliges Einlegen in Ethylenglycolmonoethylether 12 h bei Zimmertemperatur. Anschließend wurden die Wurzeln in aufsteigender Alkoholreihe (Ethanol, Propanol, n-Butanol) zweimal 12 h umgesetzt. Die Einbettung der Proben erfolgte 24 h unter Lichtabschluß in kalter Vorbereitungslösung (100 ml Technovit 7100 Fa. Kulzer und 1 g Härter I). Die Proben wurden anschließend in 20 ml Vorbereitungslösung unter Zusatz von 2 ml Härter II umgestellt. Abschließend polymerisierten die Blöcke 1 h in 6 ml Technovit-


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Lösung 3040, der 10 g Technovit-Pulver 3040 zugegeben wurden. Nach 24 h konnten die Blöcke am Mikrotom (Fa. Leica) in einer Stärke von 8 µm geschnitten und nach 30 s Toluidinblau-Färbung getrocknet werden. Die Fotoaufnahmen erfolgten bei 40facher Vergrößerung mit dem ‘Jenaval Contrast’- Mikroskop (Fa. Carl Zeiss Jena).

Ermittlung der autochthonen AMP-Sporenanzahl

Untersuchungen zu autochthonen AMP-Chlamydosporen im anlehmigen Sandboden (Berlin-Köpenick) zu verschiedenen Jahreszeiten wurden zur Beurteilung von standortspezifischem Vorkommen und zur taxonomischen Einordnung von AMP-Gattungen durchgeführt. Dazu wurde jeweils 100 g lufttrockener Boden in Wasser suspendiert und der Bodensiebmaschine der Fa. Retsch zugeführt. Anschließend wurde der Boden durch Naßsiebung extrahiert (GERDEMANN und NICOLSON, 1963). Die Weiterbearbeitung der Proben erfolgte modifiziert nach LAND (1990). Die nicht sichtbaren Sporen wurden in Ringerlösung (Anhang II) überführt. Nach der Auszählung isolierter Sporen unter dem Stereomikroskop (Vergrößerung 40×) erfolgte eine taxonomische Klassifizierung nach WALKER (1992) und nach dem ”Manual for the identification of VA mycorrhizal fungi“ (SCHENCK und PEREZ, 1987) in die AMP-Gattungen. Dauerpräparate von Chlamydosporen wurden durch Zugabe von Polyvinylalkohol mit Lactophenol (Anhang II) hergestellt. Charakteristische Sporen wurden mit dem Fotomikroskop Axiophot (Fa. Carl Zeiss Jena) dokumentiert.

Bestimmung der Most Probable Number autochthoner AMP

Durch mikroskopische Erfassung können selten alle vorhandenen AMP-Vermehrungsstrukturen ermittelt werden. Im Gegensatz dazu ermöglichte die Most-Probable-Number-(MPN)-Methode die Ermittlung des gesamten infektiösen AMP-Potentials im Boden. Die Anzahl infektiöser autochthoner AMP-Strukturen an Tagetes wurde vom anlehmigen Sandboden (Berlin-Köpenick) unter Gefäßbedingungen im Herbst 1995 und im Frühjahr 1996 bestimmt. Die zur Wurzelbesiedlung fähigen Vermehrungsorgane wurden in einzelnen Töpfen aufeinanderfolgender Verdünnungsstufen nachgewiesen. Dieses Schätzverfahren beruht auf der Errechnung der maximalen Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von infektiösen AMP-Strukturen (COCHRAN, 1950; ALEXANDER, 1965; NORRIS et al., 1994). Teile des Originalbodens wurden wie folgt behandelt:

Substrat A: Freilandboden unsterilisiert, gesiebt (Siebgröße 0,5 cm), luftgetrocknet

Substrat B: autoklaviert, gesiebt, lufttgetrocknet

Substrat C: sterilisiert ungesiebt

250 ml-Töpfe wurden mit 150 g Substrat C befüllt. Das Substrat A wurde mit dem autoklavierten Boden im Verhältnis 1 : 4 verdünnt und jeweils 50 g der insgesamt acht Verdünnungsstufen in die Töpfe gegeben. Die Kontrolle erhielt den unbehandelten Freilandboden in der Mittelschicht. Abschließend wurden 50 g Substrat C pro Topf gegeben. Zur Aussaat kamen sechs Tagetes pro Topf. Die Kultivierungsbedingungen sind in Tab. 8 beschrieben. Nach einem Monat Inkubationszeit wurde das gesamte Bodenvolumen aller Töpfe entnommen. Nur die mittlere Verdünnungsschicht wurde verwendet. Die Wurzeln wurden in AFE-Lösung (GERLACH, 1969) fixiert. Nach modifizierter Trypan-Blau-Färbung der Wurzeln (PHILLIPS und HAYMAN, 1970) wurden diese auf An- oder


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Abwesenheit von AMP-Strukturen unter einem Binokular der Fa. Pabisch KG (Vergrößerung 40 x) bonitiert. Jedes einzelne infizierte Wurzelstückchen zählte als positive Reaktion. Die Berechnung der MPN-Anzahl und der Vertrauensbereiche erfolgte nach folgender Formel (FISHER und YATES, 1974):

log OMEGA = x · log a - k
OMEGA : Anzahl der infektiösen Strukturen


a : Verdünnungsfaktor = 4 (im Falle einer vierfachen Verdünnung) k : konstanter Faktor (FISHER und YATES, 1974) zur Bestimmung von x oder y
y = s - x
y : Verdünnungsstufen s : Anzahl der Verdünnungsstufen

Es wurde für den Boden ein Wassergehalt von 8 % ermittelt. Eine Umrechnung auf 100 g lufttrockenen Boden war zur Standardisierung der MPN-Ergebnisse erforderlich. Die abschließende Berrechnung der Vertrauensbereiche erfolgte nach der Formel:


S = bei einer vierfachen Verdünnung
n : Anzahl Wiederholungen pro Verdünnung (FISHER und YATES, 1974)
z : 1,645 für a=4 bei einer Wahrscheinlichkeit von 95 %
log OMEGAs : höchste MPN-Anzahl bei einer Wahrscheinlichkeit von 95 %
log OMEGA i : niedrigste MPN-Anzahl bei einer Wahrscheinlichkeit von 95%

2.8.3.2. Ermittlung des Besiedlungsverhaltens inokulierter Bakterien in der Rhizosphäre

Eine Voraussetzung zur Förderung des Pflanzenwachstums ist die Besiedlung, das Überleben und die Vermehrung der inokulierten Bakterien in der Rhizosphäre der Wirtspflanzenwurzeln während der Vegetationsperiode. Deshalb erfolgte in zwei Jahren die Ermittlung des Besiedlungsverhaltens nach Inokulation antibiotikaresistenter Mutanten von Rhizosphärenbakterien (120 ppm) zur Zeit des Auspflanzens und zur Blüte im Freiland durch Reisolierung der Bakterien aus Wurzelabschnitten der samenbeimpften Tagetes und der knollenbeimpften Gladiolen. Nach Abernten des Pflanzenbestandes wurde Boden- und Wurzelmaterial sechs Monate lang trocken bei 10 °C gelagert. Die Wiederbesiedlung der Bakterien wurde an der nichtinokulierten Folgekultur Tagetes ein Jahr nach Erstinokulation im Gewächshaus geprüft. Dazu wurde eine Mischprobe aus 1 g Wurzeln und 9 ml 0,05 M physiologischer Kochsalzlösung gebildet. Der Stammlösung wurde 3 % TMTD zur Hemmung


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von Pilzkeimen zugesetzt. 0,1 ml wurde nach der Verdünnungsmethode (HIRTE, 1961) auf Glyzerin-Pepton-Agarplatten in dreifacher Wiederholung ausplattiert. Durch Zugabe von 120 ppm Rifampicin zum Anzuchtmedium wurde nur das Wachstum der markierten Impfstämme gefördert. Nach einer Inkubationszeit von 12 Tagen bei 28 °C erfolgte die Bestimmung der Anzahl koloniebildender Einheiten (cfu) pro Bakterienstamm.

WIEHE et al. (1995) wiesen die Identität der Reisolate mit den inokulierten Ausgangsstämmen serologisch nach qualitativem ELISA-Test mit stammspezifischen Polyclonalen nach.

2.8.3.3. Bestimmung von Bakterien und Pilzen aus der autochthonen Wildpopulation der Rhizosphäre

Vor der Inokulation wurden Mischproben von den Gladiolen- und Tagetesböden bzw. -wurzeln entnommen. Anschließend erfolgte die Isolierung und Identifizierung ausgewählter bakterieller und pilzlicher Mikroben der Wildpopulation der Rhizosphäre.

Die natürliche Bakterienpopulation wurde auf Glyzerin-Pepton-Agar nach HIRTE (1969a,b) ermittelt. Dazu erfolgte zunächst nach makro- und mikromorphologischen Merkmalen über Bestimmungsschlüssel eine Einteilung in Typen und anschließend die Ermittlung der Typenanteile an der Gesamtzahl. Nach der Methode von MILLER (1982) bzw. SASSER und MILLER (1984) wurden typenspezifische Isolate durch Analyse der zellulären Fettsäuremethylesterprofile mit Hilfe des ”Microbial Identification System“ (MIS, Microbial ID Inc., Newark, USA) identifiziert (LISTE, 1992; HÖFLICH et al., 1996). Die qualitative und quantitative Auswertung der Pilze erfolgte auf Biomalzagar (Anhang II).

2.9. Statistische Auswertung

Die varianzanalytische Auswertung der Daten wurde mit dem Statistikprogramm SPSS (BÜHL und ZÖFEL, 1994) durchgeführt. Multiple Mittelwertvergleiche erfolgten nach Tukey mit einem Signifikanzniveau von 5 % (KÖHLER et al., 1984) und der Vergleich von zwei Mittelwerten nach dem t-Test (SACHS, 1992). Wenn die Voraussetzungen für die Varianzanalyse nicht gegeben waren, wurden nichtparametrische Tests (LOZÁN, 1992) mit anschließendem Nemenyi-Test durchgeführt. Da es sich dann um Rangvarianzanalysen handelte, konnten keine Grenzdifferenzen angegeben werden. Die Auswertung der Knospen- und Blütenanzahlen pro Pflanze erfolgte z.T. über Gruppenbildung und anschließender Signifikanzprüfung nach dem Chiquadrat-Test. Signifikante Unterschiede sind in den Tabellen fett und in den Abbildungen mit einem Stern gekennzeichnet (*).


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Wed Jun 16 16:02:47 1999