Olbricht, Klaus: Untersuchungen zur genetischen und histogenetischen Variabilität an transgenen Petunia hybrida Hort. (Vilm.)

”Die Leute haben (mit Hilfe von Konventionen ) alles nach dem Leichten hin gelöst und nach des Leichten leichtester Seite; es ist aber klar, daß wir uns an das Schwere halten müssen; alles Lebendige hält sich daran, alles in der Natur wächst und wehrt sich nach seiner Art und ist ein Eigenes aus sich heraus...“
R. M. Rilke
”Denn unser Wissen ist Stückwerk...
Wir sehen jetzt durch einen Spiegel in einem dunkeln Wort;
dann aber von Angesicht zu Angesicht...“
1.Corinther 13

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Kapitel 1. Problemdarstellung

1.1. Zur Entstehung der transgenen Petunia hybrida Hort. (Vilm.)

Die Petunie - eine Gattung von ca. 30 Arten - ist nach ihrer Beschreibung 1803 von Jusseau (Sink, 1984) aus ihrer südamerikanischen Heimat nach Europa gebracht worden. Die gezielte Züchtung der schnell zu einer bekannten gärtnerischen Kultur gewordenen Pflanze begann Mitte des letzten Jahrhunderts (Bailey, 1896/ Rupprecht und Miessner, 1989). Nicht zuletzt wegen ihrer einfachen vegetativen und generativen Vermehrbarkeit ist sie heute eine Versuchspflanze für genetische und biochemische Forschung (Wijbrandi und de Both, 1993). Die gehandelten Hybriden sind in ihrer historischen Entstehung nicht klar belegt, chromatographische und elektrophoretische Analysen jedoch wiesen die Beteiligung von Petunia axillaris Lam., Petunia inflata Fries, Petunia parodii Steere und Petunia violaceae Lindl. nach (Natarella und Sink, 1974 und 1975). Für die Pigmentierung der Kronblätter sind bei Petunien Anthocyane und andere Flavonoide verantwortlich; sie ergeben im Zusammenspiel mit dem pH-Wert einen bestimmten Farbton (Sink, 1984/ Griesbach, 1996). Dabei wird normalerweise kein Pelargonidin ausgebildet (Meyer, 1991/ Gutterson, 1993).

Eine weiß blühende Petunienlinie wurde im Max-Planck-Institut (MPI) für Züchtungsforschung Köln-Vogelsang zum Ausgangspunkt für einen gentechnischen Versuch. Diese Hybridlinie besitzt weiße bis blaßrosa Blüten. Der Syntheseweg ihrer Blütenfarbstoffe war bekannt (Forkmann und Ruhnau, 1987/ Forkmann, 1991). Sie bildet die drei Dihydroflavonole Dihydromyricetin, Dihydroquercetin und Dihydrokaempferol. Während die beiden ersteren (in geringen Konzentrationen vorliegenden) zu Delphinidin- bzw. Cyanidinderivaten umgewandelt werden können, reichert sich Dihydrokaempferol lediglich an (Meyer et al., 1987/ Forkmann, 1991). Dihydrokaempferol als Vorstufe von Pelargonidin kann nicht umgewandelt werden, weshalb dieser Farbstoff nicht nachweisbar ist (Forkmann, 1991). Von dem A1-Gen des Mais’ ist bekannt, daß es für eine Reduktase codiert, die die Fähigkeit besitzt, Dihydrokaempferol als Substrat zu nutzen (Reddy et al., 1987). Kann nun dieses Gen erfolgreich in die beschriebene Petunienlinie transferiert werden, wird der Syntheseweg bis hin zum Pelargonidin denkbar.

Zusammen mit einem Gen, das für Kanamycinresistenz verantwortlich ist (NPT II), wurde das A1-Gen übertragen (Meyer et al., 1987). Das Resistenzgen NPT II ermöglichte eine Vorselektion auf Kanamycin-Kallusmedium. Unter den Regeneraten der überlebenden Kalli gab es Pflanzen mit ziegelroten Blüten, in denen die gewünschte Pelargonidinsynthese


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nachgewiesen werden konnte, variegate Blütenfarbtypen und weiße, die phänotypisch der Ausgangslinie entsprachen (Meyer et al., 1987/ Linn et al., 1990).

Griesbach (1993) fand heraus, daß sich mit der nun möglichen Pelargonidinsynthese die Farbstoffgehalte in den Kronblättern insgesamt erheblich erhöhen und dabei zugunsten des Pelargonidingehaltes verschieben, d.h. prozentual wesentlich weniger Delphinidin und Cyanidin synthetisiert wird.

Ein rotblühender Transformant, der das A1-Gen stabil zur Ausprägung brachte und für den später eine intakte Genkopie nachgewiesen werden konnte (Pröls und Meyer, 1992/ Meyer und Heidmann, 1994), diente zu weitergehenden Experimenten: Eine über Kreuzungen und Selbstungen erzielte homozygote (rote) Linie wurde selektiert und ein Klonbestand aufgebaut. Die Rückkreuzung mit der Ausgangslinie RL01 ließ rot blühende Nachkommen entstehen, die in bezug auf die Blütenfarbe heterozygot sind. 30000 solcher Pflanzen gelangten zu einem Freilandversuch (Meyer et al., 1992/ Meyer, 1995 B). Innerhalb dieses Feldversuchs gab es wiederum neben Pflanzen mit der gewünschten ziegelroten Blütenfarbe solche mit Farbvariationen. Unter diesen Farbvarianten war ein weiß-rot sektorierter Typ, der den Eindruck eines Sternmusters vermittelt (Meyer, mündliche Information). Diese Pflanze (Abb. 1), von der ein Klonbestand aufgebaut wurde, steht im Mittelpunkt dieser Arbeit und wird seiner homohistisch diploiden Konstitution wegen im weiteren als Stern/DDD bezeichnet.

Abb. 1: Sternmuster der transgenen Petunie (Stern/DDD)


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1.2. Der Untersuchungsgegenstand

Der 1987 beschriebene Gentransfer am MPI war der erste erfolgreiche Versuch, mittels molekulargenetischer Technik eine neue Blütenfarbe zu etablieren. Insbesondere in der Folge dieses Experimentes rückte die Stabilität des transferierten Genes in den Mittelpunkt der Untersuchungen. Wie beschrieben gab es unter den direkt aus dem Experiment folgenden Transformanten, wie auch innerhalb eines Freilandversuchs bei Pflanzen mit klar definierter genetischer Grundlage (eine Genkopie) zahlreiche Instabilitäten in der Expression des A1-Gens. Die folgende Arbeit widmet sich einer Besonderheit unter den variegaten Formen, einem aus dem Freilandversuch hervorgegangenen Sternmustertyp, und soll Beitrag sein zu einem wissenschaftlichen Gesamtbild über die Stabilität transferierter Gene. An den Anfang gestellt werden dabei zunächst drei primäre Fragen, den Sternmustertyp betreffend:

1.3. Chimärische Blütenmuster

Neben Blütenmustern, die genetisch determiniert sind (z.T. zusätzlich modifikativ beeinflußt) und virusbedingter bzw. pflanzensaftübertragbarer Musterung gibt es im Blütenbereich auch solche, die wie Musterungen von Laubblattchimären histogenetische Ursache haben. Genetisch voneinander verschiedene Sproßscheitelschichten beteiligen sich dabei unterschiedlich am Aufbau der Gewebe. Davon abhängig kommt es zu entsprechender Musterung der Organe. Diese Muster lassen sich auf vegetativem (Stecklinge), nicht jedoch auf generativem Wege erhalten. Sie haben eine relative Stabilität, was auch bedeutet, daß sich Sprosse bilden können, die nur eine Komponente verkörpern oder andere Muster aufgrund einer veränderten (vertauschten) Konstitution des Sproßscheitels zeigen (Bergann und Bergann, 1962/ Pohlheim, 1986). Experimentell nachgewiesen sind solche Muster im Blütenbereich bei Saintpaulia ionantha H.Wendl. (Pohlheim, 1980/ Lineberger und


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Druckenbrod, 1985/ Plaschil, 1997), Pelargonium Zonale- Hybride ‘Rosa Liebling’ (Pohlheim und Rössel, 1989/ Rössel, 1990) und Pelargonium Zonale- Hybride ‘Mr.Wren’ (Cassells und Minas, 1983/ Plaschil, 1997), Mentha arvensis L. ‘Variegata’ (Pohlheim, 1971), Verbena L. ‘Aphrodite’ (Plaschil, 1997), Rhododendron simsii L. (Heuersel, 1972) Euphorbia pulcherrima Willd. ‘Eckes Rosa’ (Bergann, 1961) und Myosotis L. (Bateson, 1926/ Chittenden, 1927), um nur einige zu nennen.

1.4. Der Sternmustertyp der transgenen Petunie

1.4.1. Phänotypische und gärtnerische Charakteristik

Die Petunienblüte besteht aus fünf zu einer Kronröhre zusammengewachsenen Petalen. Dabei sind die Binnenfelder rot gefärbt, an den Kronblatträndern, d.h. im Verwachsungsbereich erscheinen die Petalen weiß. Dadurch kommt der Eindruck eines Sterns zustande (Abb. 3). Über Stecklinge ist dieser Typ relativ stabil erhaltbar; ein Klonbestand existiert im Institut seit nunmehr fünf Jahren. Vereinzelt traten an den Sternmusterpflanzen einheitlich weiß, selten auch rot blühende Sprosse auf. Das Blütenmuster geht auf generativem Wege verloren und unterscheidet sich damit von bekannten Sternmustern bestimmter Petuniensorten (siehe Abbildung 2). Die Ausbildung des vererbbaren Sterns ist zudem temperatur- und lichtabhängig (Rünger, 1971 und 1976). Je nach Umweltbedingungen verschiebt sich das Farbverhältnis in Richtung rot bzw. weiß. Diese Modifikation kann beim Sternmuster der transgenen Petunie nicht beobachtet werden.

Abb. 2: handelsübliche Sternmustersorte der Petunie

Abb. 3: Sternmuster bei der transgenen Petunie


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Die für den Sternmustertyp der transgenen Petunie genannten Eigenschaften lassen eine Parallele zu den im vorigen Abschnitt aufgeführten chimärischen Blütenmustern sichtbar werden, was im folgenden als Hypothese formuliert und geprüft werden soll.

1.4.2. Hypothese eines chimärischen Aufbaus der transgenen Sternmusterform

Anatomie und Histogenese

Blütentriebe von Petunia folgen einem sympodialen Verzweigungssystem, endständig steht die Infloreszens, seitlich wird das weitere Sproßwachstum fortgesetzt (Sink, 1984/ StraSburger et al., 1989). Im stereomikroskopischen Bild (Abb. 4) ist diese Abfolge sichtbar: Der Sproßscheitel von Petunia besteht aus drei separaten Zellschichten (Cornu und Bugnon, 1971). Einem von Napp-Zinn (1984 und 1988) formulierten generellen Aufbau von Angiospermenblättern zufolge bildet in der Regel die erste Scheitelschicht (L1) obere und untere Epidermis, das Palisaden-gewebe geht von L2 und das übrige Mesophyll von der dritten Schicht (L3) aus. Nach Weberling (1981) unterbleibt hingegen bei Kronblättern die Untergliederung in Palisaden und Schwammparenchym (siehe auch Abb. 5). Inwieweit überhaupt eine dritte Scheitelschicht sich am Aufbau des Kronblattes beteiligt, ist nicht bewiesen, erscheint anatomischen Befunden nach aber eher unwahrscheinlich. Bereits beim Kelchblatt ist bei Laubblattchimären am Phänotyp (siehe 3.8.) eine Beteiligung von nur zwei Scheitelschichten ablesbar.

Abb. 4: Verzweigungsmodus (Photoprintbild/Stereomikroskop)


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Abb. 5: Kronblatt im Querschnitt (Kunststoff-einbettung)

Bei Petunien findet die Farbstoffsynthese hauptsächlich in der oberen, in stark abgeschwächter Intensität in der unteren Petalenepidermis statt. Es handelt sich um Vakuolenfarbstoffe (Sink, 1984/ Bino et al., 1984/ Meyer, 1991).

Abb. 6: obere Petalenepidermis Stern/DDD (Plasmolyse mit KNO3-Lösung)

Abb. 7: untere Petalenepidermis Stern/DDD (Plasmolyse mit KNO3-Lösung)

Im Mesophyll hingegen ist kein Farbstoff lokalisiert:

Abb. 8: Farbstoffverteilung im Petalenquerschnitt (rotes Binnenfeld Stern/DDD)


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Die weißen Sektoren des Sternmusters weisen auf einen Farbdefekt hin. Es gibt also Bereiche in den Epidermen, wo Pelargonidinderivate gebildet werden (Binnenfeld der Petalen) und angrenzend einen Petalenrand ohne diesen Farbstoff. Diese widersprüchliche Situation könnte mit partnerinduktiven Wirkungen und der alleinigen Beteiligung einer anthocyandefekten L1 am Petalenrandmesophyll erklärt werden. Solche Sachverhalte sind von chimärischen Pflanzen bekannt.

Partnerinduktion

Als "interzelluläre Genwirkung" (Pohlheim und Rössel, 1989) wird Partnerinduktion bislang bezeichnet. Sie ist immer dann möglich, wenn zwei genetisch verschiedene Partner unmittelbaren Gewebekontakt haben, wie das bei einer Periklinalchimäre der Fall ist. Zwei unterschiedliche Wirkungsrichtungen sind dabei möglich:

  1. hemmende Wirkung des genetisch defekten auf den unveränderten Partner (Bleichwirkung bei der Pelargonium-Zonale-Hybride ‘A Happy Thought’: Pohlheim und Rössel, 1989)
  2. kompensierende Wirkung des intakten Partners in bezug auf den Defekt des mutierten (z. B. Ausgleich eines Anthocyandefektes in L1 bei der Pelargonium-Zonale-Hybride '‘Kleiner Liebling’: Pohlheim und Rössel, 1989, Kompensation eines Farbdefektes in L1 bei Saintpaulia ionantha Wendl.: Pohlheim, 1980)

Erstmalig eindeutig nachgewiesen wurde die Partnerinduktion in Form einer Kompensationswirkung an den Brakteen bei Euphorbia pulcherrima Willd. ‘Eckes Rosa’ von Bergann (1961 und 1962). Bei dieser Pflanze, deren Epidermis aufgrund einer Anthocyanverlustmutation in L1 die Fähigkeit zur Farbausbildung verloren hatte, kam es dennoch zu einer schwachen Anthocyanausprägung (rosa) in der Epidermis, da zur Anthocyanbildung befähigtes Gewebe (L2-bürtig) unterlagert ist. Daß es sich bei dieser Sorte um eine Chimäre handelt, wird u. a. dadurch belegt, daß ‘Eckes Rosa’ aus einer scharlachroten Form entstand und selbst eine weiße Sorte ('Eckes Weiß') durch perikline Aufspaltung der L1 hervorbrachte (Brabec, 1965).

Ebenfalls einen intermediären Phänotyp beschreibt Pereau-Leroy (1974) bei der Nelkensorte 'Jacqueline'. Seiner Darstellung nach befindet sich eine für gelbe Blütenfarbe


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veranlagte Außenkomponente über einer (genetisch) "roten" Innenkomponente, wobei durch partnerinduktive Wirkungen die Kronblätter dieser Periklinalchimäre orange gefärbt erscheinen. Nachfolgende Untersuchungen der Farbstoffsynthese an einer orangefarbenen Nelkenform ergaben jedoch, daß die orange Färbung nicht durch partnerinduktive Kompensation des Defektes, sondern neben der Bildung gelber Farbpigmente durch die rein chemisch, also spontan mögliche Fortsetzung des unterbrochenen Pelargonidinsyntheseweges (Chalcon zu Flavanon) zustande kommt (FORKMANN und DANGELMAYR, 1980 / Forkmann: mündliche Information). Diese Erklärung erscheint aufschlußreich, zumal der von Pereau-Leroy gewählte Weg des Chimärennachweises über Entmischungen von ploidiemarkierten Pflanzen durch die Zuhilfenahme von Bestrahlung Raum für Fehlinterpretationen (Mutationsauslösungen durch Strahlung) schafft.

Bei den Chimera-Sorten von Saintpaulia entstehen durch partnerinduktive Wirkungen Zweifarbigkeiten, die an ein Sternmuster erinnern (Plaschil, 1997).

Die Ursache dieser Wechselwirkungen ist noch nicht aufgeklärt, man vermutet Beeinflussung mittels diffundierender Wirkstoffe (Brabec, 1965). Zumindest kann wohl davon ausgegangen werden, daß es sich um biochemisch-physiologische Wechselwirkungen handelt (Rössel, 1990). Diese nur globalen Aussagen näher an Details heranzuführen, ist das Ziel einer eigenständigen, unter Punkt 4.4. erklärten Versuchsanstellung.

Unter den genannten Voraussetzungen lassen sich für den Sternmustertyp der transgenen Petunie folgende Hypothesen formulieren:

  1. Die erste Scheitelschicht (L1) ist Träger eines Farbdefekts von ursprünglich roter zu weißer Petalenfärbung.
  2. Im Randbereich der Petalen werden im Gegensatz zum Petalenbinnenfeld Epidermen und Mesophyll von der L1 gebildet und sind deshalb genotypisch gleiche Gewebe.
  3. Obwohl die Farbstoffsynthese auf die Epidermen beschränkt und die sie bildende L1 farbdefekt ist, zeigt sich die fehlende Pigmentierung nur in den Verwachsungszonen der Petalen. Im Binnenfeld der Petalen ist die L1-bürtige, anthocyandefekte Epidermis von intaktem, L2-bürtigem Mesophyll unterlagert. In diesen Bereichen kommt es zur Farbstoffinduktion in den Epidermen (rarrPartnerinduktion)
  4. Sind die Punkte 1. bis 3. erfüllt, ist die Sternform der transgenen Petunia hybrida eine Monektochimäre.

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