Olbricht, Klaus: Untersuchungen zur genetischen und histogenetischen Variabilität an transgenen Petunia hybrida Hort. (Vilm.)

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Die drei Wege der Beweisführung

Um die chimärische Konstitution einer Pflanze zu prüfen, sind drei Wege notwendig:

1. ENTMISCHUNG gilt gleichermaßen als Eigenschaft wie auch als Nachweismethode von Chimären. Durch Umschichtungen an den Sproßscheiteln (layer-reduplication, layer-perforation, layer-translocation) kann zum Beispiel eine Schicht die andere verdrängen, bzw. sie vertauschen einander ihre Lage. Es ist damit möglich, daß homohistische Pflanzen entstehen bzw. Pflanzen mit einer neuen chimärischen Konstitution (Bergann und Bergann, 1962/ Pohlheim, 1982 und 1986/ Rashid, 1993). Eine weitere Möglichkeit der Entmischung ist der Wurzelaustrieb, der in der Regel dann die L3-Komponente einer Pflanze verkörpert. Als Testmethode für Chimären ist er unter der Bezeichnung "Bateson-Test" in die Literatur eingegangen (Bateson, 1916). Entmischung kann als Sproßvariation verstanden werden und spontan an einer Pflanze auftreten. Eine Trennung der chimärischen Komponenten mit hoher Wahrscheinlichkeit ist die in-vitro-Kalluskultur. Dort können Regenerate aus einzelnen Zellen entstehen und damit entsprechende Sproßscheitelschichten repräsentieren. Auch traditionelle Vermehrungstechniken sind geeignet, Entmischungen herbeizuführen, wie z. B. bei Saintpaulia ionantha, wo Regenerate aus Blattstecklingen von epidermalem Gewebe abstammen und somit einheitlich den Genotyp der ersten Scheitelschicht zeigen (Lange, 1992/ Lineberger, 1996/ Plaschil, 1997).

Für die transgene Sternmusterform von Petunia hybrida bedeutet das:

In einem großen Klonbestand müßten nach einer ausreichenden Zeitspanne Sprosse mit entweder einheitlich weißen oder einheitlich roten Blüten entstehen. Eine in-vitro-Kalluskultur mit anschließender Erdüberführung läßt weiß und rot blühende Pflanzen erwarten. Obgleich Bino et al. (1984) davon ausgehen, daß bei Petunia Regenerate in der Regel von L1-bürtigem Epidermisgewebe abstammen, kann Regeneration aus subepidermalen Schichten nicht ausgeschlossen werden (Bino et al., 1984/ Handro et al., 1973). Der


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Bateson-Test zur Isolierung der L3-Komponente hätte wenig Erfolg, da Wurzelaustriebe bei Petunia nicht beobachtet wurden.

2. DOPPELTE MARKIERUNG BEI PERIKLINALCHIMÄREN hat zum Ziel, einzelne Scheitelschichten mit zwei Merkmalen zu kennzeichnen, so daß möglicherweise bereits am Phänotyp, sicher jedoch durch cytologische bzw. histologische Befunde einzelne Schichten vor allem in ihrer Histogenese klar erkannt und voneinander abgegrenzt werden können. Eine solche Markierung erreicht man durch Mutationen, beispielsweise durch Induktion eines Chlorophylldefektes als Plastidommutation oder die Erhöhung der Ploidiestufe einer Schicht als Genommutation. Letzteres ist möglich durch die Applikation von Kolchizin und erzeugt Ploidiechimären, auch Cytochimären genannt (Dermen und Bain, 1944).

3. Chimärisch bedingte Laub- und Blütenblattmuster sind auf GENERATIVEM WEGE nicht erhaltbar. Nachkommen spalten in der Regel der genetischen Situation der L2 (verantwortlich für die Bildung der Gameten) folgend auf. Wegen des heterozygoten Zustandes der Sternmusterpetunie (Meyer et al., 1992) ist eine mendelnde Aufspaltung in rot und weiß blühende Nachkommen zu erwarten. Darunter darf sich - die chimärische Konstitution vorausgesetzt - in direkter Folge kein Sternmuster befinden.

2.2. Die doppelte Markierung der Scheitelschichten

Um Aussagen darüber zu treffen, welche der drei Schichten eines Petuniensproßscheitels sich in welchem Maße an der Bildung von Geweben beteiligt, ist es notwendig, für die Scheitelschichten eine über die gesamte Ontogenese verfolgbare Markierung zu haben. Eine eindeutige Möglichkeit dabei ist die Erhöhung des Ploidiegrades beispielsweise einer Scheitelschicht. Die Applikation des Herbstzeitlosen-Alkaloids Kolchizin: C22H25O6N (Blakeslee und Avery, 1937/ Blakeslee et al., 1940) bewirkt bei der Mitose die Inaktivierung des Spindelapparates, in deren Folge es zu einem erhöhten Chromosomensatz (Genommutation) kommen kann. Je nachdem, ob homologe oder nichthomologe Chromosomensätze verdoppelt wurden, spricht man von Auto- bzw. Allopolyploidie (Strasburger et al., 1989). Vielfach bereits angewendet ist eine Methode, bei der mit Kolchizin getränkte Watte auf die Vegetationskegel aufgelegt wird (Rieger, 1963/ Kuckuck et al., 1989/ Schmalz, 1989). Eigenen Erfahrungen mit Gerbera - Jamesonii - Hybriden zufolge fanden Lösungen von 0,1 und 0,2%iger Konzentration Verwendung


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(Olbricht und Wegner, 1991). Dieser Behandlung unterzogen wurde der beschriebene Sternmustertyp. Die Selektion nach der Applikation erfolgte zunächst auf visueller Basis (veränderter Phänotyp). Eingehend untersucht wurden daraufhin diese Pflanzen mit verschiedenen Methoden der Ploidiebestimmung.

2.3. Methoden der Ploidiebestimmung

Qualitative Untersuchungen

Auf der qualitativen Ebene wurden ausgehend vom unterschiedlichen Phänotyp (Blüten) der Varianten Zellgrößen gegenübergestellt, sowie Unterschiede in den Zellformen untersucht. Eingebunden darin sind visuelle Vergleiche der Zellkerngrößen. Dazu sind von Petalen Frischpräparate (Petalensegmente, Epidermisabzüge) angefertigt und entlüftet worden. Querschnitte sind sehr schwer herzustellen. Es empfiehlt sich dafür der Schnitt in Zucchini bzw. wassergetränktem Holundermark. Auf diese Weise bleibt das empfindliche Kronblattgewebe schadlos. Ausgelöste Plasmolyse (Entlüftung in 10%iger KNO3-Lösung) erleichtert die Zuordnung der Vakuolenfarbstoffe zu den Zellen. Einfacher hingegen können Petalensegmente aufgrund ihrer geringen Mächtigkeit am Mikroskop durchleuchtet werden. Für den Vergleich der Kerngrößen wurden Frischpräparate entlüftet, in Karminessigsäure gelegt, nach zwei Stunden in Wasser gespült und untersucht. Kerngrößenvergleiche sind ebenfalls in den Kunststoffpräparaten - hier im histogenetischen Zusammenhang - gut möglich.

Stomatamessung

Eine der gebräuchlichsten Indiziensammlungen zur indirekten Bestimmung des Ploidiegrades ist die Messung der Größe von Schließzellen. Dabei sollte auf eine bei jeder Messung gleiche Entnahmestelle am Laubblatt (Interkostalfeld) und die ähnliche Konstitution der Pflanzen (Alter, Gesundheits- und Ernährungszustand, gleiche Position des untersuchten Laubblattes) geachtet werden (Schwanitz, 1952/ Adaniya und Ardian, 1994). Die Erfassung von Stomatameßwerten gilt mit einer ausreichend großen Stichprobe (in dieser Untersuchung 200 Werte pro Variante) als sicheres Mittel zu einer relativen Aussage über den Ploidiegrad der ersten Scheitelschicht einer Pflanze, da die Epidermis ein L1-bürtiges Gewebe ist. Abzüge der unteren Laubblattepidermis wurden demzufolge mikroskopiert, die Stomatalänge mit einem

Meßokular bestimmt. Über den


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(im vorliegenden Fall 1,5) findet man zur wahren Länge der Schließzellen (in µm). Eine statistische Aufarbeitung der Meßdaten läßt Schlüsse auf den Ploidiegrad zu. Zur Untersuchung kamen alle auf der Farbtafel II verzeichneten Varianten.

Zellenzählung Epidermis/Kronblatt

Da sich in der Regel erhöhte Ploidiegrade in größeren Zellen äußern (Schmalz, 1989) wurden für die zu vergleichenden Varianten (Farbtafel II) die Anzahl der Zellen pro Fläche (Petalenepidermen) ermittelt. Dabei muß analog zur Stomatamessung auf die adäquate Entnahmestelle, den Ernährungszustand und das Alter der Pflanze geachtet werden. Auf 34 (pro Variante) 8,8cm × 13cm großen Photos konnten die Zellen ausgezählt werden. Eine begleitende Skalenphotographie garantiert die Maßstäblichkeit und ermöglicht eine Aussage zum durchschnittlichen Flächeninhalt einer oberen bzw. unteren Epidermiszelle in µm2. Die über das Längenverhältnis Objekt (Skala) zu Photo ermittelte Endvergrößerung liegt ungefähr bei dem Faktor 307. Eine Kontrollberechnung über das Mikroskop (Objektiv einschließlich Ausschnitt) und die Vergrößerung von Photonegativ zu -positiv ergab den Vergrößerungsfaktor 297 (Beyer und Riesenberg, 1988). Aufgrund zu erwartender Abweichung (u.a. Linealmessung) liegt die tatsächliche Vergrößerung wahrscheinlich zwischen beiden Werten. Die ermittelten Daten wurden statistischen Tests unterzogen. Weitere Untersuchungen widmen sich den Auswirkungen von Plasmolyse auf die Meßergebnisse. Durch Entlüften von Epidermisabzügen in 10%iger Kaliumnitratlösung (KNO3-Lösung) wurde die Plasmolyse von Epidermiszellen ausgelöst.

Anzahl der Nucleoli

Über die Anzahl der Kernkörperchen lassen sich Rückschlüsse direkt auf den Ploidiegrad ziehen. In der Literatur ist eine Möglichkeit der Sichtbarmachung von Kernkörperchen von Adaniya und Ardian (1994) beschrieben. Dabei werden die Nucleoli über eine Silbernitratbehandlung sicht- und zählbar, ihre maximale Anzahl pro Zellkern gibt Aufschluß über die Ploidiestufe. In der vorliegenden Arbeit konnten die Nucleoli im Ergebnis der Kunststoffeinbettung und Anfärbung mit Toluidin sehr gut sichtbar gemacht und zur Ploidiebestimmung herangezogen werden.

Chromosomenzählung

Herkömmliche Methoden zur Chromosomenzählung wie die Färbevarianten mit Karmin-essigsäure bzw. Hämatoxylin als Wurzelspitzen-Quetschpräparate (Darlington und La


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Cour, 1963/ Romeis, 1989/ Kamo und Griesbach, 1993) führten auch bei vorheriger Stauchung in 0,1%iger Kolchizinlösung (1h) zu keinen brauchbaren Ergebnissen. Offenbar sind die Wurzelspitzen sehr hart, so daß diese Methode nicht weiter Verwendung fand. Als sichere Untersuchungsmöglichkeit erwies sich die Kunststoffeinbettung von am Mittag bei Sonne entnommenen Explantaten (Blüten und Sproßspitzen), die nach dem Schnitt mit einer Dicke von 8 µm mit Toluidin angefärbt wurden. In allen Gewebeteilen - auch in den Antheren (hier meiotische Teilungen) - ist der gesamte Teilungszyklus sichtbar; Zellteilungen können im Stadium der Metaphase gut zählbare Chromosomen erbringen.

2.4. Herstellung von Dauerpräparaten

Zur histologischen Untersuchung wurden mit dem Ziel, auswertbare Schnitte von Sproßscheiteln und Blüten zu erhalten, Sproßspitzen zur Einbettung in Paraffin und Kunststoff gebracht. Prinzipiell sind beide Methoden erfolgversprechend. Aufgrund der in diesem Fall erzielten besseren Qualität bei den Kunststoffschnitten wurde diese Form der Präparation favorisiert, auch weil hier Kernkörperchen- und Chromosomenzählungen besser möglich sind.


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2.5. in-vitro-Kalluskultur

Um das Entmischungs- und Regenerationsverhalten vor allem der das Sternmuster zeigenden Petunien zu untersuchen, wurden einzelne Varianten in eine Kalluskultur überführt. Die von Stern/DDD, TDD, TTT und von rot/tetra aus den Interkostalfeldern der Laubblätter entnommenen Explantate sind nach Desinfektion (70 %iger Alkohol und 0,25 %iges Wofasteril) auf ein Kallusmedium (1/2 MS + 1mg IES/l + 1mg BAP/l) gebracht worden. Eine rasche Kallusentwicklung zeigte in der Folge nach durchschnittlich vier Wochen erste Sproßentwicklung. Die Sprosse wurden abgenommen und auf ein um die Hälfte der Nährstoffkonzentration verringertes Nährmedium nach Murashige und Skoog (1962) übertragen. Nach erfolgter Wurzelbildung und Sproßwachstum kamen die Pflanzen zur Überführung in Erdkultur, wo sie bis zur Bonitur der Blüte kultiviert wurden.

Versuch zur Kallusregeneration von Petalensegmenten

Um die Ursachen partnerinduktiver Wirkungen zu untersuchen, wurden Petalensegmente aus den bereits rot gefärbten Teilen einer noch nicht geöffneten Blüte der Ploidiechimäre Stern/TDD entnommen. Die der beschriebenen Kalluskultur von Laubblattexplantaten analoge Verfahrensweise führte zwar zu ausreichender Kallusbildung, brachte aber keine Sproßbildung. Deshalb wurde mit verschiedenen Nährmedien, denen auf der Basis von 1/2 MS unterschiedliche Mengen an IES, IBA, 2,4 D, 2iP und Kinetin beigefügt waren, weiterexperimentiert. Alle Versuche fanden im klimatisierten Kulturraum bzw. in Klima-schränken unter Dauer-Kunstlicht (ausgenommen die Kallusphase) und bei ca. 22°C statt.

2.6. Untersuchungen zur Stabilität des A1-Gens

Bonitur im Bestand

Dazu wurden zwei Klonbestände aus weißblühenden Kallusregeneraten von Stern/DDD und Stern/TDD aufgebaut und über sechs Monate hinsichtlich ihrer Blütenfarbe bonitiert. Da die Sprenkelung der Blüten quantitativ schwer erfaßbar und die Fähigkeit dieser Pflanzen, den Sternmustertyp wieder zu bilden, bekannt war, wurde die Anzahl dieser erneuten Sternausprägung (an vormals weiß blühenden Pflanzen!) registriert.

Kreuzungsanalysen

Zur Überprüfung des Merkmals rote bzw. weiße Blütenfarbe und damit auch der Stabilität des A1-Gens wurden Selbstungen der Sterne DDD, TDD und TTT sowie der weiß bzw. rot


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blühenden diploiden und tetraploiden Varianten durchgeführt. Ziel war es desweiteren, homozygote Pflanzen in bezug auf die Blütenfarbe zu erhalten. Im Rahmen der Analyse zur Genstabilität kam es zur Kreuzung heterozygoter, transgener Pflanzen (rot/diploid aus Stern/TDD) mit der als F1-Hybride ausgezeichneten Petuniensorte ‘Marathon Dunkelblau’ (Firma Walz). Eine Überprüfung des F1-Status’ der Blütenfarbe durch eine Selbstung dieser Sorte erwies sich als notwendig. Die Samen wurden jeweils nach der Ernte ca. drei Monate gelagert, weil sich bei Petunia die Keimfähigkeit mit zunehmender Lagerungsdauer bis zu sechs Monaten erhöht (Rünger, 1976).

2.7. Technische Ausrüstungen


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