Olbricht, Klaus: Untersuchungen zur genetischen und histogenetischen Variabilität an transgenen Petunia hybrida Hort. (Vilm.)

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Kapitel 4. Diskussion

Die histogenetische Ursache des Sternmusters der transgenen Petunie konnte lückenlos belegt werden. Diskussionspunkte liefern die Instabilität des A1-Gens als Ursache der Sternmusterbildung, die Stabilität des A1-Gens im Klonbestand, in Selbstungen und Sorteneinkreuzungen, methodisch vergleichende Arbeiten zur Ploidiebestimmung, Untersuchungen zu den partnerinduktiven Wirkungen, die Gewebekonkurrenz verschiedenploider Gewebe, sowie die Sachverhalte der somaklonalen Variation.

4.1. Ploidienachweise

Um die Ploidiestufe einer Pflanze bzw. von Geweben zu bestimmen, ist die Chromosomen-zählung der direkteste Weg. So gängig diese Methode ist (Pryor, 1972/ Pohlheim, 1978/ Hopkins et al., 1996), unterliegt sie aber zum Teil erheblichen Einschränkungen: Nicht bei allen Pflanzen glückt die Präparation nach herkömmlichen Quetschmethoden von Wurzelspitzen (Darlington und La Cour, 1963/ Romeis, 1989). Und werden Wurzelspitzen genutzt, gewinnt man in der Regel lediglich eine Aussage zum Ploidiegrad der dritten Scheitelschicht aufgrund der endogenen Anlage von Stecklingswurzeln. Gerade bei chimärisch konstituierten Pflanzen reicht diese Aussage nicht aus (Kamo und Griesbach, 1993). Schichtenbezogene Chromosomenzählungen sind hingegen in Dauerpräparaten möglich, wie hier in der Arbeit anhand von Kunststoffeinbettungen erfolgt. Zellteilungsstadien werden fixiert und im Falle der Metaphase zählbar.

Mit einer der Chromosomenzählung entsprechenden Sicherheit ist die Ermittlung der Anzahl der Kernkörperchen (Nucleoli) anwendbar. Adaniya und Ardian (1994) schlagen dazu eine Färbevariante mit AgNO3 vor. Im eigenen Versuch konnten die Werte über die Kunststoffeinbettung und Färbung mit Toluidin ermittelt werden, wobei die maximale Anzahl der Nucleoli Aufschluß über den Ploidiegrad gibt (2 Nucleoli rarr diploid ; 4 Nucleoli rarr tetraploid). Voraussetzung für diese beiden Methoden ist eine histologische Analyse, da nicht unbedingt als bekannt vorausgesetzt werden kann, welche Scheitelschicht sich wie stark am Aufbau welcher Gewebe beteiligt. So ist das Mesophyll bei Petunia sowohl in Laub- wie in Blütenblättern nicht immer von L2 bzw. L3 abstammend. Im Kronblatt beteiligt sich die L1 regelmäßig am Randmesophyll (weiße Sektoren der Sternformen) und auch am Laubblatt wird Mesophyll am Rand von L1 gebildet. In die Kelchblätter wiederum fließen nur L1- und L2-bürtige Gewebe ein, wie Laubblattvarianten (siehe Farbtafel I) zeigen.

Wegen der aufgeführten Schwierigkeiten bei der Chromosomenzählung haben sich eine Reihe


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von indirekten Untersuchungsmethoden als brauchbar erwiesen, die alle auf der Grundlage basieren, daß höherploide Gewebe im Bereich bis zu ihrem Ploidieoptimum größere Zellen besitzen. Kennt man die Herkunft dieser meßbaren, ausdifferenzierten Zellen, kann man Rückschlüsse auf die zugehörige Scheitelschicht ziehen. Unumstritten ist die Ploidiegradbestimmung der ersten Scheitelschicht über die Erfassung der Stomatalänge bzw. -breite (Schwanitz, 1952/ Pohlheim, 1983). Die Zählung der Chloroplastenzahl pro Stoma führt zu entsprechenden Ergebnissen (Pohlheim, 1978/ Compton et al., 1996). Weiterhin dienten Messungen der Blattspreite und der Anzahl Stomata pro Flächeneinheit zur Ploidiebestimmung (Chat et al., 1996).

Weitaus strittiger ist dagegen der Rückschluß von Pollengröße auf den Ploidiegrad der zweiten Scheitelschicht, wenngleich auch diese Methode beschrieben ist. (Emsweller und Brierley, 1940/ Pryor, 1972/ Schmalz, 1989). So weist beispielsweise Walter (1961) auf die hohe Variabilität der Pollengröße hin und Schwanitz (1952) erkannte eine Abhängigkeit der Größe vom Alter der Blüte. Aus diesem Grunde wird von verschiedenen Autoren die Zählung der Keimporen am Pollen als sicherer empfohlen (Funke, 1956/ Walter, 1961).

Die Anwendung der indirekten Bestimmungsmethoden zur Ploidie hat zuallererst den Vorteil, leicht und technisch sowie zeitlich unaufwendig handhabbar zu sein. In diesem Zusammenhang wurde in der eigenen Arbeit eine Methode geprüft, über die Zellenanzahl pro Fläche bei Petalenepidermen auf die Ploidiestufe der L1 zu schließen. Diese Variante ist schnell, einfach anzuwenden und erwies sich aufgrund klar voneinander zu unterscheidender Mittelwerte bei einem Stichprobenumfang von ca. 30 Photos als brauchbar. Daraus gewonnene Ergebnisse stimmen mit den mittels anderer Methoden gefundenen Ergebnissen überein. Als statistisch sicher kann diese Methode allerdings nicht gelten, weil wegen sehr hoher Standardabweichungen statistische Mittelwertvergleiche nicht sinnvoll erscheinen. Dies setzt zudem die Anwendbarkeit im Falle heterogener Bestände (z. Bsp. nach Kolchizinbehandlung) erheblich herab; sektoriale Ploidieunterschiede können schwer erkannt werden. Andere Methoden wie die Ploidiebestimmung über Stomatamessung sollten deshalb vorgezogen werden.

Interessant ist weiterhin ein methodischer Vergleich, den Compton et al. (1996) anhand von Untersuchungen an der Wassermelone anstellten: Ihren Ergebnissen nach eignen sich Ovariendurchmesser, das Verhältnis Laubblattlänge zu -breite und der Antherendurchmesser, wohingegen bei Erfassung des Petalendurchmessers, der Ovarienlänge, Blattlänge und Blattbreite sich zum Teil nicht signifikante Unterschiede zwischen verschiedenploiden


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Pflanzen ergaben. Aufgrund starker Abhängigkeit aller genannten Meßmethoden (außer Chromosomen- und Nucleolizählung) von Umweltbedingungen und Ontogenesestadium ist die Forderung nach gleichen Voraussetzungen (Entnahmestellen, Ernährungszustände, Ontogeneseabschnitte) eine entscheidende Grundlage für beabsichtigte Vergleiche (Schwanitz, 1952). Bei allen indirekten Meßmethoden, bei denen aufgrund größerer Zellen auf einen höheren Ploidiegrad geschlossen wird, muß zudem beachtet werden, daß artspezifisch ein Optimum der Ploidiegrade existiert. Wie Levan und Elliott (1958) an Phleum pratense L. demonstrieren, nimmt die Höhe der Pflanze bis zur pentaploiden Stufe zu und fällt danach bei weiterer Erhöhung der Chromosomenzahl stark ab. Auch Chat et al. (1996) konnten aufgrund dieses Sachverhalts tetraploide und pentaploide Actinidia Lindl. über Stomatalängen nicht mehr trennen. Hier wird die Grenze der indirekten Methodik deutlich. Eine moderne Variante und gleichzeitig eine Überwindung dieser Grenze ist die Analyse über den DNA-Gehalt der Zellen, der bei Erhöhung der Chromosomenzahl stetig zunimmt. Durch diese cytometrische Methode werden in Häufigkeitsdiagrammen, die auf der Grundlage von unterschiedlichen Fluoreszensintensitäten erstellt werden, Ploidieunterscheidungen möglich (Kamo und Griesbach, 1993/ Baranyi und Greilhuber 1996/ Chat et al., 1996/ Hopkins et al., 1996/ Martel et al., 1997). Liegen sektorial-, meriklinal- oder periklinalchimärische Konstitutionen bei Pflanzen vor, können jedoch bei dieser Methodik erhebliche Interpretationsschwierigkeiten bis hin zu Fehldeutungen auftreten, wenn derartige histogenetische Besonderheiten in der Untersuchungsweise nicht berücksichtigt werden. Ein kritischer Habitusvergleich, der diese Möglichkeiten mit einbezieht, sollte daher jeder Untersuchung vorausgehen.

4.2. Zur Stabilität des A1-Gens

Im eingangs dieser Arbeit beschriebenen Freilandversuch kam es zur Auspflanzung heterozygoter Pflanzen mit einer intakten Genkopie. Die während dieses Versuchs aufgetretenen Variabilitäten in der Blütenfarbe (zu denen das Sternmuster zählt) waren bedingt durch Methylierung in der Promotorregion (Meyer und Heidmann, 1994/ Meyer, 1995 B). Bislang ist hauptsächlich die eine Richtung der Instabilität, nämlich die Methylierung, Gegenstand von Untersuchungen gewesen. An der Sprenkelung vormals weiß blühender Pflanzen ist ablesbar, daß Methylierung auch wieder aufgehoben werden kann. Dieser Mechanismus ist ebenso interessant, weil er einen entscheidenden Teil der Instabilität des A1-Gens betrifft. Nicht nur die Inaktivierung, sondern auch die Reaktivierung des A1-


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Gens bedeutet Instabilität dieses Farbgens. In der Literatur sind Methoden zur künstlichen Reaktivierung von Transgenen beschrieben, so möglich mit dem Methylationsinhibitor 5-Azacytidin (van Slogteren et al., 1984).

Methylierung führt also zur Blockade des A1-Gens. Sprenkelung und Sektorbildung sind (A) rarrA - Ereignisse unterschiedlichen Ausmaßes. Abhängig vom Stadium der Gewebeentwicklung, in der es zur Blockade bzw. Deblockade des A1-Gens kommt, bilden sich im Falle der Deblockade kleine rote Bereiche (Sprenkel) bei relativ späten bzw. größere rote Bereiche (Sektoren) bei früheren Stadien der Blütenbildung. Die Sprenkelung ist dabei offenbar das weitaus häufigere Ereignis. Erfaßt diese Veränderung solch große Bereiche, daß beispielsweise eine Blockade des A1-Gens für eine gesamte Scheitelschicht manifest wird, entsteht bei A1-Blockade in der ersten Scheitelschicht für die Blüte ein Sternmuster, wie es in dieser Arbeit analysiert wurde. Wie der über fünf Jahre erhaltene Klonbestand zeigt, ist die Veränderung einer ganzen Scheitelschicht relativ stabil. Rot bzw. weiß blühende Sprosse, die gelegentlich an Stern/DDD entstehen, könnten als Entmischungsprodukte aufgrund einer Schichtenverdrängung (L1- Perforation bzw. - Reduplikation) aufgefaßt werden. Denkbar ist aber auch die Aufhebung der Deblockade in L1 im Falle rotblühender Sprosse, eine Blockade in L2 hingegen beim Auftreten weißer Blüten. Auch an dieser Stelle liefert die doppelte Markierung einen Analyseweg. So beweist der Fall der Ploidiechimäre Stern/TDD, daß Schichtenverdrängung stattfindet: An ihr auftretende weiß blühende Sproßvarianten besaßen homohistisch tetraploide Petalen, L1 hat hier subepidermales Gewebe verdrängt. Über L3 kann dabei keine Aussage getroffen werden, da nur Petalengewebe untersucht wurde. Rot blühende Sprosse, die bei einer L1-Perforation (L2-bürtiges Gewebe gerät in L1-Position) homohistisch diploid, bei Aufhebung der Blockade hingegen die ploidiechimärische Konstitution beibehalten müßten, traten an Stern/TDD nicht auf. Dieses vergleichende Ergebnis erhöht die Wahrscheinlichkeit, daß einheitlich weiß (bzw. rot) blühende Sprosse an Stern/DDD ihre Ursache in L1-Reduplikation (bzw. -Perforation) haben.

Im Gegensatz zum Sternmuster ist die Sprenkelung eine sehr variable, unmittelbar von Umweltbedingungen (Licht und Temperatur) abhängige Erscheinung. Interessant ist in dieser Verbindung, daß in den weißen Sektoren der Sterne keine Sprenkelung ausgemacht werden kann. Isoliert man hingegen über Kalluskultur die erste Scheitelschicht und macht sie zur Grundlage eines Pflanzenbestandes, ist Sprenkelung zu beobachten, die zudem eindeutig typenbedingt ist. Mit hoher Wahrscheinlichkeit ist anzunehmen, daß Sprenkelung und Sternmusterbildung generell gleiche Ursache, nämlich Blockade bzw. Deblockade des A1-Gens haben. Da die Instabilität des A1-Gens eine generelle potentielle Eigenschaft der


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transgenen Petunien ist, die auch vererbt wird, ist es erklärbar, daß sich neu an sonst weiß blühenden Pflanzen (diploid und tetraploid) wie auch an weiß blühenden Sämlingen, die das A1-Gens in inaktiver Form [(A) -] besitzen, Sprosse mit Sternmusterblüten bilden. Damit wird zwar nicht das Sternmuster vererbt, aber die Fähigkeit zur Bildung desselben. Sonstige bekannte chimärische Blütenmuster haben in diesem Punkt eine andere Charakteristik. Die auf beispielsweise eine Schicht beschränkte Farb-Defektmutation ist bei ihnen ein einmaliger Vorgang (Saintpaulia, Verbena, Pelargonium: siehe 1.3.). Der Farbdefekt einer Scheitelschicht ist ein Verlust, der sehr unwahrscheinlich rückgängig gemacht werden kann. Bei der transgenen Petunie aber ist aufgrund der Instabilität des Farbgens A1 auch der Umkehrweg der Sternbildung praktikabel, auch kann der Weg der Sternbildung an rot bzw. weiß blühenden Pflanzen ständig neu vonstatten gehen. Bildet sich ein solcher Stern, ist das offenbar eine relativ stabile Konstruktion, die deshalb auch lange vegetativ erhalten werden kann.

Aufgrund des modifikativen Charakters dieser Blütenfarbchimären, die ihre Musterbildung nur einer Blockade des Farbgens durch Methylierung, nicht jedoch einem irreversiblen Gendefekt verdanken, muß ein neuer Begriff geprägt werden: Es wird vorgeschlagen, für derartige Pflanzen den Begriff ”epigenetische Periklinalchimäre“ zu gebrauchen. Nur scheinbar liegt eine Farbdefektmutation vor, sie ist weiter nichts als eine epigenetisch bedingte, reversible Veränderung (Methylierung) des für die Blütenfarbe verantwortlichen Gens. Daß diese Chimärenform nicht losgelöst von anderen Blütenfarbchimären bzw. Blütenbfarbvariationen existiert, sondern in einem logischen Kontext mit ihnen steht, wurde unter 3.9. durch Vorstellung von und Untersuchungen an weiteren auffälligen Blütenfarbmustern erörtert.

Erwähnt werden muß an dieser Stelle eine Arbeit über Tabak von Matzke und Matzke (1990), in der von einer ”epigenetischen Chimäre“ die Rede ist. ”Epigenetische Chimäre“ beschreibt hier lediglich die Tatsache, daß ein transferiertes Resistenzgen (Kanamycinresistenz) sowohl in aktivem wie auch inaktivem Zustand in ein und derselben Pflanze vorliegt. Die mit Methylierung verbundene Instabilität des transferierten Gens ist offensichtlich eine Eigenschaft dieses Gens innerhalb aller Sproßscheitelschichten bzw. der von ihnen abstammenden Gewebe und erscheint zellgebunden in einem willkürlichen Muster. Zudem ist diese Instabilität vererbbar. (Es könnte in diesem Sinne die weiß-rot gesprenkelte, transgene Petunie als vergleichbar angesehen werden.) Diese Pflanze als Chimäre zu bezeichnen, ist auch mit dem Adjektiv ”epigenetisch“ fragwürdig, weil die Voraussetzungen für das Vorhandensein einer chimärischen Konstitution im bisherigen Verständnis von


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chimärischen Koexistenzen innerhalb einer Pflanze nicht gegeben sind, auch nicht in einem sektorialchimärischen Sinn. Dazu erscheint die zu phänotypischen Veränderungen führende Geninstabilität zu wechselhaft; Sektorenbildung kann auch hier allenfalls als eine besondere (weil ontogenetisch früher einsetzende) Form der Sprenkelung verstanden werden.

An diesem Punkt erscheint eine weitere begriffliche Abgrenzung angebracht: Bergann (1967) verwendet den Begriff Chimäroide für Heterohistonten, die außerhalb ihrer Sproßscheitel, also extrapikal genetisch abgeänderte Zellen bzw. Gewebe besitzen. Auf Matzkes Tabakpflanze ist dieser Begriff in zweierlei Hinsicht nicht übertragbar; erstens treten hier auch intraapikal Instabilitäten des transferierten Gens auf und zweitens handelt es sich nicht um eine genetische, sondern lediglich epigenetische Veränderung, die reversibel ist. Die mosaikartige Erscheinung bei dieser Tabakpflanze muß zudem abgegrenzt werden von makulaten Mustern von Laubblattvarianten, die ihre Ursache in der Existenz von Mischzellen (Nebeneinander von mutierten und unmutierten Plastiden in einer Zelle) haben. Je nachdem, in welcher Form sich die Zellteilung vollzieht, verteilen sich mutierte und unmutierte Plastiden in die Tochterzellen. Dabei ist eine Separation in gänzlich mutierte bzw. unmutierte Zelltypen theoretisch und praktisch möglich. Ihre histologische Anordnung wiederum führt zu verschiedenen Musterungen.

Zuletzt muß noch auf vererbliche Mosaik- bzw. Scheckungsmuster hingewiesen werden, wie sie bspw. von Tropaeolum majus albopulvereum (Kirk und Tilney-Bassett, 1967) oder bei Petunia hybrida albomutabilis (siehe 3.8.) bekannt sind.

In diesem begrifflichen Rahmen kann die beschriebene Tabakpflanze histologisch/histogenetisch nur als ein mosaikartiges Nebeneinander von Zellen mit unterschiedlichen Methylierungsgraden und damit einer differenten Geninstabilität des Transgens charakterisiert werden. Im eigenen Verständnis berechtigt erst die den ”klassischen Chimären“ entsprechende relativ stabile Musterung, wie sie beispielsweise beim Auftreten des Sternmusters an der transgenen Petunie zu beobachten ist, zur Anwendung des Chimärenbegriffs, hier als ” epigenetische Periklinalchimäre“. Überträgt man Matzkes Ansicht auf die transgene Petunie, müßte weiß/diploid mit der Fähigkeit zur Sprenkelung als ”epigenetische Chimäre“ interpretiert werden. Sie ist zwar die Vorstufe zur Bildung der ”epigenetischen Periklinalchimäre“, hat aber analog zu Matzkes Tabakpflanze nicht unbedingt Eigenschaften zu sonst als Sektorial- oder auch Meriklinalchimären bezeichneten Formen.

Vielmehr ist bei Matzke mit Chimärie die der transformierten Tabakpflanze eigene, willkürlich erscheinende Instabilität eines transferierten Gens gemeint. Den Begriff


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”epigenetische Chimäre“ in diesem Zusammenhang zu gebrauchen, erscheint aufgrund der üblichen Begriffsverwendung und des hier vorliegenden Sachverhaltes als nicht ratsam. Als ”Musterbildung unterschiedlichen Ausmaßes aufgrund der Instabilität eines transferierten Gens“ ist es möglicherweise besser, wenn auch ausführlicher bezeichnet.

Stabilität des A1-Gens in Kreuzungsanalysen

Die Instabilität des A1-Gens ist auch auf der generativen Ebene ein Faktor, der zu Blütenfarbveränderung der Sämlingsnachkommenschaft und damit zu veränderten, von den Mendelschen Regeln abweichenden Aufspaltungsverhältnissen führt.

Bei Kreuzungen von Pflanzen mit inaktiviertem A1-Gen und Pflanzen, die das A1-Gen in aktivem Zustand besitzen, ist eine Übertragung des Methylationsmusters vom ”inaktiven“ auf den ”aktiven“ Partner denkbar, so im Falle der Kreuzung von weiß/diploid × Stern/DDD (Gametenbildung von der zweiten Scheitelschicht: A1-Gen aktiv). Bei Selbstung homozygot roter Pflanzen entstehen jedoch ebenfalls weiß blühende Nachkommen und zahlreiche instabile Farbmuster. Hier müssen andere Methylationsvorgänge einsetzen, da beide Selbstungspartner das A1-Gen in sichtbar aktivem Zustand besitzen.

Als Übertragung von Methylationsmustern hat Meyer (1995, A) den Vorgang beschrieben, wenn ein unmethyliertes Allel mit einem methylierten zur Paarung gelangt. Das unmethylierte Allel kann dabei inaktiviert, also ebenfalls methyliert werden. Diese Transinaktivierung (Odenbach et al., 1997) wurde von Meyer et al. (1993) als der Paramutation ähnlich bezeichnet.

Der Begriff Paramutation wurde in Hinsicht auf eine allelspezifische Interaktion beim Mais eingeführt (Brink 1973). Dabei verändert sich das Allel B (für Anthocyanbildung verantwortlich), wenn es mit dem Allel B’ bei Kreuzung aufeinandertrifft, zu B’. Die spontane Umkehrung dieses Vorgangs, also B’rarrB, konnte bislang nicht beobachtet werden (Patterson, 1993).

Für den Fall der transgenen Petunie jedoch ist die Umkehrung von (A) zu A charakteristisch, d. h. auch, daß die Nachkommenschaft bei Kreuzung von weiß [homozygot: (A)(A)] × rot [homozygot: A A] nicht nur aus weiß blühenden Pflanzen aufgrund ”paramutationsähnlicher“ Übertragung des Methylationsmusters, sondern auch aus rot und variabel blühenden Nachkommen besteht (Meyer et al., 1993). Auch wenn der Paramutation in anderen Fällen ein metastabiler Charakter zugebilligt wird, Variabilität in der Allelbeeinflussung (einschließlich der Nachkommenschaft) also der Paramutation eigen sein kann (Jorgensen, 1994), erscheint wegen der noch


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sehr unklaren Ursachen und

Zusammenhänge für dieses Phänomen der von Sabl und Laird (1992) geprägte Begriff ”epigene Konversion“ sinnvoll. Für den Fall der Petunie könnte er so verstanden werden, daß der Allelstatus des inaktiven Allels in einem epigenetischen Sinn auf das aktive Allel übertragen werden kann, wodurch dieses ebenfalls inaktiviert wird. Diese Veränderung muß dabei nicht stabil in der Nachkommenschaft zu finden sein, ebenso wenig sich auf vegetativem Wege erhalten (wie die bisherigen Untersuchungen zur transgenen Petunie gezeigt haben).

Matzke (1994) befürwortet die Verwendung des mehr allgemein gehaltenen Begriffs ”epigene Konversion“, zumal Inaktivierungsprozesse von Trans- wie von endogenen Genen nicht ausreichend aufgeklärt sind.

Verschieden hohe Abweichungen von der Mendelschen Aufspaltung und die Häufigkeit instabiler Nachkommen, je nachdem, ob Selbstung/Kreuzung und Aussaat/Bonitur im Sommer oder Winter erfolgte, machen die Umweltabhängigkeit deutlich. Selbst bei Nachkommenschaft homozygot ”roter“ Pflanzen treten weiße und instabil rot blühende Typen auf. Unterschiede insbesondere bei diesen Pflanzen suggerieren, daß es zur Sprenkelung neigende Typen gibt, die diese Veranlagung auch auf generativem Wege weitergeben. Die Existenz von zur Sprenkelung neigenden Typen wurde auch aus der Bonitur des Kallusregeneratbestandes von weiß/diploid und weiß/tetraploid geschlußfolgert.

Stabilität des A1-Gens in Sorteneinkreuzungen

Im Gegensatz zu zwei publizierten Einkreuzungsversuchen (siehe auch 3.7.) konnte festgestellt werden, daß Instabilitätserscheinungen in der Blütenfarbe (Sektorbildung, Sprenkelung) in F1- und F2- Generationen wahrscheinlich bleiben. Ihr Ausmaß ist relativ gering, aber auffällig. Der Farbdefekt überträgt sich dabei offensichtlich auch auf die Farbkomponenten des (blauen) Kreuzungspartners (‘Marathon Dunkelblau’). Sektoren haben demzufolge neue Farbwerte, dazu die von transgen/rot und der blauen Sorte bis hin zum völligen Farbausfall (weiß). Die Übertragung des Methylierungsmusters auch auf andere Farbgene wäre eine Interpretationsmöglichkeit.

Im eigenen Kreuzungsversuch unklar ist die fehlende Aufspaltung der F1. Nach einer Überprüfung der Handelssorte ‘Marathon Dunkelblau’ durch Selbstung stand fest, daß es sich um eine in Hinblick auf die Blütenfarbe homozygote Ausgangsbasis handelt. Von dem transgenen roten Typ ist sein heterozygoter Zustand bekannt. Die F1 bestand einschließlich Reziprokkreuzung aus einheitlich dunkelrosa blühenden Pflanzen, lediglich ein hellerer Typ (hellrosa) befand sich darunter. Eine 1:1-Farbtyp-Aufspaltung jedoch wäre nach


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Mendel zu

erwarten.

Es ist wahrscheinlich, daß bei diesen dunkelrosa Farbtypen die Farbstoffsynthese nicht alleinig in Richtung Anthocyanidin wie bei der transgenen Petunie fortgesetzt wird, sondern aufgrund entsprechender Gene der eingekreuzten Sorte in Richtung blauer und roter Farbstoffe abgeleitet wird. Das in der Farbstoffkette gebildete Dihydroflavonol wird also nicht nur weiter zu Dihydrokaempferol, sondern verstärkt auch in Richtung Dihydromyricetin und Dihydroquercetin umgewandelt, was zur Fortsetzung anderer Farbstoffsynthesen und letztendlich zur Bildung von Delpinidin- und Cyanidinderivaten führt.

Der hellrosa Farbtyp (eine Pflanze) wie auch die Farbsektoren könnten als Defekte interpretiert werden, die zur partiellen oder vollständigen Unterbrechung der Farbstoffsynthesen führen.

Negativ wirkt sich auf Erklärungsansätze die Tatsache aus, daß der genetische Hintergrund zur Farbstoffsynthese bei ‘Marathon Dunkelblau’ nicht ausreichend bekannt ist. Einkreuzungen der transgenen Form mit genetisch definierten Sorten sollten deshalb weiterer Untersuchungsgegenstand sein, weil die Einbeziehung transgenener Pflanzen in die klassische Pflanzenzüchtung der entscheidende Punkt ist, wenn es um die Anwendung molekularer Methodik geht.


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4.3. Betrachtungen zur Gewebekonkurrenz

Anhand des Phänotyps der Sterne und des Hintergrundwissens über ihre Scheitelkonstitution (Ploidiestufen) lassen sich Überlegungen zur Gewebekonkurrenz anstellen:

Abb. 86: zwei Homohistonten: Stern/TTT und Stern/DDD, (von links nach rechts)

Abb. 87: zwei Ploidiechimären: Stern/TDD und Stern/DP? (von links nach rechts)

Die stabile Schichtung von ”rotem“ und ”weißem“, diploidem und tetraploidem Gewebe macht jeweils beide Komponenten zu Partnern, zwischen denen sich ein Kräfteverhältnis herausbildet. Je nachdem, zu welcher Schicht hin dieses Verhältnis verschoben ist, kommt es zu typischen Musterausprägungen. Schneider (1995) spricht in diesem Zusammenhang von ”sporophytischer Balancierung“, ein Begriff, der den Zustand stabil geschichteter


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Periklinalchimären treffend beschreibt. Gleichermaßen wird mit diesem Begriff der Vorgang erfaßt, der zu Verschiebungen im Verhältnis von roten zu weißen Blütenanteilen durch Polyploidisierung einer Scheitelschicht zustande kommt. Begriffe, wie sie aus der Literatur bekannt sind: ”Diplontische Selektion“ (Gaul, 1959) und ”Diplontische Drift“ (Balkema, 1972) erweisen sich für solche stabil geschichteten Chimären, wie die Sternform der transgenen Petunie eine ist, als ungeeignet.

Die polyploidisierte L1 führt bei Stern/TDD (im Vergleich zu Stern/DDD) zur Vergrößerung der weißen Sektoren durch stärkere Beteiligung dieser Scheitelschicht am Randmesophyll des Kronblattes. Ist die zweite Scheitelschicht polyploid, kehrt sich dieser Effekt um, die weißen Sektoren bei Stern/DP? sind auffällig klein.

Bei den beiden Ploidie-Homohistonten Stern/DDD und Stern/TTT bleibt das Flächenverhältnis rot:weiß ungefähr gleich, nur werden im Falle Stern/TTT die Blüten generell größer. Tetraploides Gewebe scheint bei Petunia diploidem gegenüber bevorteilt zu sein, was offenbar nicht durch eine höhere Teilungsfrequenz (im Gegenteil: bei tetraploidem Gewebe verlangsamt sich die Teilungsgeschwindigkeit: Scheibe, 1951/ Schmalz, 1989/ Schneider, 1995), sondern allein durch die größeren Zellen, die pro Zeiteinheit größere Volumina ergeben, bedingt ist. Neben dieser Ursache sind auch veränderte Druckverhältnisse bei Ploidiechimären als Grund für mögliche veränderte Teilungsmodi denkbar (Kny, 1902/ Lintilhac, 1974/ Schneider, 1995). Ebenfalls sollte beachtet werden, daß ein Optimum für die Ploidiestufe existiert, welches artspezifisch ist (Schmalz, 1989). Höherploide Scheitelschichten haben deshalb nicht unbedingt einen erhöhten Gewebeanteil an den Organen.

Bei den Zellenzählungen/Petalenepidermis zur Ploidiebestimmung (siehe 3.2.) fiel auf, daß die Zellen bei Stern/TDD im weißen Randbereich größer sind als im roten Binnenfeld . Da der Rand homohistisch tetraploid, das Binnenfeld aber aus einer Schichtung von tetraploidem über diploidem Gewebe besteht, lag die Vermutung nahe, daß für letzteren Fall eine Verringerung der Zellgröße durch das unterlagerte diploide Mesophyll (mechanische Beeinflussung oder partnerinduktive Wirkung?) bedingt wird. Um das zu testen, wurden vergleichende Untersuchungen an Stern/DDD durchgeführt mit einem dem Stern/TDD analogen Ergebnis: Auch hier sind die Epidermiszellen im weißen Rand größer als im roten Binnenfeld der Petalen.


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Die auf 34 Photos pro Variante abgebildeten Zellen wurden ausgezählt und ergaben beispielsweise für die obere Petalenepidermis:

Stern/TDD:

rot: 102 / weiß: 94,

Stern/DDD:

rot: 188 / weiß: 178 Zellen.

Mit diesen Zahlen (einschließlich hoher Standardabweichungen: Werte von 6,7-12,5) sind die Unterschiede allenfalls lagebedingt und haben keine Ursache im Sinne einer Gewebekonkurrenz aufgrund verschiedener Ploidiestufen. Statistische Testverfahren konnten wegen der hohen Standardabweichungen nicht angewendet werden, jedoch wird der Sachverhalt bereits qualitativ erfaßbar.

Ein lohnendes Untersuchungsgebiet über Gewebekonkurrenz wären die aus in-vitro-Kalluskultur hervorgegangenen Laubblattvarianten (siehe Farbtafel I). Die Ploidiemarkierung einzelner Schichten ausgesuchter Typen der Laubblattvarianten und eventuell flow-cytometrische Untersuchungen würden hier eine sinnvolle Vergleichsebene schaffen, um Gewebekonkurrenz weiter zu charakterisieren!


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4.4. Versuchsansatz und Teilergebnisse zur Klärung partnerinduktiver Wirkungen

Das Phänomen der Partnerinduktion ist zur Erklärung des Sternmusters der transgenen Petunie herangezogen worden und konnte bestätigt werden. Während Brabec (1965) noch über die Untersuchungen von Bergann (1961) an Euphorbia pulcherrima Willd. ‘Eckes Rosa’ als einzig ”einwandfreien Fall einer Partnerinduktion“ berichtet, haben sich bis heute zahlreiche weitere, eindeutig belegte Beispiele gefunden (siehe 1.3.). Die Wirkungsweise der Partnerinduktion konnte dabei jedoch nie geklärt werden. Lediglich Vermutungen wurden aufgestellt, wonach sie als ”zwischenzellige Genwirkung“, ”Diffussion von Stoffwechselprodukten von einer Zelle in eine andere“ (Rössel, 1990) oder ”genphysiologische Wechselbeziehung“ (Brabec, 1965) grob charakterisiert wird. Das Modell von Euphorbia geht davon aus, daß Cofermente aus L2-bürtigem Gewebe in L1-bürtiges Gewebe diffundieren und dort in Zusammenspiel mit einem Apoferment die verhinderte Farbsynthese als Reparation eines vorliegenden Defektes wieder ermöglichen (Bergann, 1961). Mutmaßungen darüber, was von einer Chimärenkomponente in die andere übergeht, haben bis heute für Diskussionen - insbesondere im Falle von Pfropfchimären gesorgt. Ein Genübertritt von einer Schicht in eine andere konnte jedoch nie nachgewiesen werden, Wirkungen bleiben auf eine physiologische Ebene beschränkt, wie bereits eine, in der Geschichte der Chimärenforschung frühe Arbeit von Winkler (1912) umfassend darstellt. Der bei Petunia genau bekannte Syntheseweg der Blütenfarbstoffe, speziell der der Anthocyansynthese, ermöglicht einen Ansatz, der - wenn auch auf indirektem Wege - zur Klärung des Wesens partnerinduktiver Wirkungen beitragen kann.

Von der weiß blühenden Petunie ist bekannt, daß sich in ihren Blütenblättern, maßgeblich dabei in den Zellen der oberen Epidermis, Dihydrokaempferol, eine Vorstufe zur Bildung von Pelargonidin, anreichert (Zudem sind Cyanidin- und Delphinidinderivate in den Epidermiszellen in Spuren nachzuweisen.). Pelargonidin kann nicht synthetisiert werden, da den Petunien eine Reduktase (Enzym) fehlt, die in der Lage ist, Dihydrokaempferol zu Pelargonidin zu reduzieren (Meyer et al., 1987/ Forkmann, 1991). Das vom Mais in die Petunie transferierte A1-Gen codiert diese Reduktase, die Pelargonidinsynthese wird möglich.

Nun ist bereits nachgewiesen, daß das Sternmuster, welches als eines der Produkte dieses genmanipulatorischen Versuchs entstand, eine chimärische Konstitution aufweist. Diese Pflanze setzt sich zusammen aus einer genetisch weißen Schicht (L1) und genetisch roten Komponenten (L2 / L3). Im Binnenbereich der Petalen wird in der eigentlich farbdefekten L1-bürtigen Epidermis Farbstoff (Pelargonidin) induziert. Diese Wirkung geht von der


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unterliegenden L2-bürtigen Zellschicht (Mesophyll) aus und wird als Partnerinduktion beschrieben (Nachweis dieses Sachverhaltes unter 3.2.).

Aus den Untersuchungen über das Wesen des Farbdefektes ist bekannt, daß das A1-Gen nicht verschwunden, sondern blockiert ist (Sprenkelung an den weißen L1-bürtigen Entmischungsprodukten weiß/diploid und weiß/tetraploid). Weiterhin zeigten die Versuche zur Kalluskultur von Laubblattexplantaten der Sternmuster, daß Regenerate fast ausschließlich von L1 abstammen und in der Regel den farbdefekten Charakter beibehielten, also weiße Blüten ausbildeten.

In den Laubblättern jedoch ist das A1-Gen nicht von Interesse. Zum Zeitpunkt der Blütenentwicklung wird dieses Gen in Hinsicht auf die Anthocyansynthese aktiv. Erst zu diesem Zeitpunkt auch können Wirkungen, die mit diesem Gen und der Blütenfarbausbildung zusammenhängen, bedeutsam werden. Aus diesen Tatsachen ergeben sich zwei theoretische Möglichkeiten, die zu den beschriebenen partnerinduktiven Wirkungen führen können:

Hypothese 1:

Das Mesophyll des Kronblattes (L2-bürtig) bewirkt in den Zellen der ihr überlagerten Epidermis die Aufhebung der Blockade (Methylierung) des A1-Gens. Eine Regeneration über Kalluskultur von Kronblättern aus dem chimärischen Teil, also dem roten Binnenfeld der Petale, ergäbe damit im Falle der Ploidiechimäre Stern/TDD tetraploide, rot blühende Pflanzen bei der anzunehmenden Regeneration aus epidermalem Gewebe. (Jedoch sollte bedacht werden, daß mit der Umwandlung ausdifferenzierten Petalengewebes in meristematisches Kallusgewebe die Deblockade wieder rückgängig gemacht werden könnte. In diesem ganz speziellen, aber bei Einbeziehung aller theoretischen Möglichkeiten denkbaren Fall wird eine Interpretation schwierig.)

Hypothese 2:

Sind die Kallus-Regenerate tetraploide, weiß blühende Pflanzen, dokumentieren also den Erhalt des farbdefekten Genzustandes der ersten Scheitelschicht, so ist es sehr wahrscheinlich, daß lediglich ein Stoffwechselprodukt, welches von den genetisch intakten Mesophyllzellen (L2) in die Epidermiszellen diffundiert, zu den partnerinduktiven Wirkungen führt. Von den Pflanzen der weißen Petunienlinie (gemeint ist die Ausgangslinie vor dem Gentransfer), die dann in bezug auf ihre Farbstoffsynthese diesen weiß blühenden Kallusregeneraten entsprechen würden, wissen wir, daß die Pelargonidinsynthese mit Dihydrokaempferol abbricht, da die notwendige Reduktase fehlt. Es kann also mit großer Wahrscheinlichkeit


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vermutet werden, daß in diesem zweiten Falle zum Zeitpunkt der Blütenentwicklung im L2-bürtigen, intakten Mesophyll diese Reduktase gebildet wird und in die Zellen der Epidermis gelangt. Die durch Blockade des A1-Gens nicht mögliche Pelargonidinsynthese kann in diesen Zellen fortlaufen. Denkbar jedoch ist gleichermaßen ein Stofftransfer aus der fortgeschrittenen Farbstoffsynthese, so zum Beispiel der Übertritt von Leucoanthocyanidin aus dem Mesophyll in epidermales Gewebe.

Abweichungen wegen einzelner (A) larrrarr A-Ereignisse sind zu erwarten, weshalb ein großer Stichprobenumfang zur Prüfung der Hypothesen nötig ist. Ein Kontrollversuch mit Petalenexplantaten von weiß/tetraploid würde die Sicherheit einer Entscheidung zugunsten einer der beiden Hypothesen erhöhen.

Zum Versuch:

Die in-vitro-Vermehrung über Kalluskultur von Petalensegmenten ist eher die Ausnahme. Beispielsweise wird eine solche Methode für Rosa hybrida L. (Murali et al., 1996) beschrieben. Für Petunia finden sich in der Literatur nur Angaben über in-vitro-Kultur von Antheren, Sproßspitzen, Wurzeln, Laubblättern, Sämlingen, Ovarien, Pollen und Stengelstücken (Dixon, 1985/ George, 1987). Im eigenen Versuch war über die im Methodik-Teil dieser Arbeit beschriebene Prozedur erstaunlich einfach eine gute Kallusentwicklung zu erreichen. Der Kallus hielt sich über Wochen, ohne daß wie beim Kallus aus Laubblattexplantaten eine Sproßentwicklung einsetzte. Aus diesem Grunde wurde mit verschiedenen Medienzusammensetzungen und einem Neuansatz über ein Jahr lang in Folge weiterexperimentiert:

Abb. 88: Kallus aus Petalensegment


89

Numerierung /

Bemerkung

Grundmedium

Hormonzusatz

pro Liter

Hormonzusatz

pro Liter

1.

½ MS

4mg BAP

 

2.

½ MS

2mg IBA

1mg Kinetin

3.

½ MS

 

 

4. Photo

½ MS

0,3mg 2,4 D

3mg Kinetin

5.

½ MS

0,5mg IES

1mg Kinetin

6.

½ MS

1mg IES

3mg Kinetin

7.

½ MS

0,5mg IES

3mg 2iP

8.

½ MS

4mg IES

3mg Kinetin

9.

½ MS

0,6mg 2,4 D

6mg Kinetin

Die ersten drei Medien ausgenommen konnte sich Kallus ausgesprochen gut entwickeln und über erstaunlich lange Zeiträume (mehrere Wochen) ohne Umsetzen erhalten werden. Teilweise ergrünte der Kallus, niemals jedoch konnte das Ziel, eine Sproßbildung erreicht werden. Es sollte die bereits bis zu diesem Punkt vorangebrachte Analyse dringend weitergeführt werden, weil aufgrund der sowohl biochemisch als auch genetisch klaren Farbstoffsynthese bei der transgenen Petunie und der nun geklärten chimärischen Konstition der Sternmusterform endlich konkrete Untersuchungen zu den Wirkprinzipien der Partnerinduktion ansetzen können. Dabei sollten die beiden aufgestellten Hypothesen Prüfungsgrundlage sein.


90

4.5. Überlegungen zur somaklonalen Variation

Nach in-vitro-Kalluskultur an Laubblattexplantaten kam es zur Bildung zahlreicher Varianten, die durch abweichende Blüten, Wuchs und Laubblattmerkmale auffielen. Sie sind unter 3.8. dokumentiert. Für die Blütenvarianten, worunter sich Gigas und Zwergwuchs befinden, sind genetische Defekte sehr wahrscheinlich (Sink, 1984). Die fehlende Fruchtbarkeit dieser Typen unterstreicht das. Bei den Laubblattvarianten führten Chlorophylldefekte unterschiedlicher Stärke in verschiedenen Scheitelschichten sowie Reduplikationen und Perforationen zu vielfältiger Musterbildung. Dabei ist die Beteiligung der ersten Scheitelschicht am Randmesophyll auffällig. Im Gegensatz zu Monokotylen gilt das bei Dikotylen eher als Ausnahme (Bergann, 1954 und 1955/ Pohlheim, 1971/ Pohlheim und Kaufhold, 1985/ Tilney-Bassett, 1986), die L1 bildet meistens nur epidermales Gewebe.

Die Gewebe der Kelchblätter werden bei Petunia von L1 und L2 gebildet, wie das aus den Musterbildern ablesbar ist. Perikline Teilungen in L1 im Kelch von Petunia, die zu einer Beteiligung dieser Scheitelschicht am Randmesophyll führten, konnten bereits von Rischkow (1936) gefunden werden. Analog berichtet zum Beispiel Pohlheim (1971) im Zusammenhang mit immerspaltenden Periklinalchimären über eine regelmäßige L1-Beteiligung am Kelchblattrand bei Mentha arvensis L., so daß regelmäßige perikline Teilungen der L1 bei der Kelchblattentwicklung zu vermuten sind. Die vielen unterschiedlichen, hier beschriebenen Laubblattmuster sowie das Sternblütenmuster von der transgenen Petunie lassen ausschließen, daß eine Beteiligung von L1 am Randmesophyll aufgrund von Anomalien bestimmter Scheitelschichten zustande kommt.

L1-Randbeteiligung an Laub- Kelch- und Kronblatt ist für Petunia hybrida als spezifisch zu betrachten.

Bildung von Sternblütenmustern ist auch an Laubblattvarianten möglich, wie bei G HGG G (grün-hellgrün/wachstumsgehemmt-grün) aufgetreten. Hier gibt es Merkmalskopplungen von Chlorophyllgehalt und Blütenfarbe, die zur Chimärenanalyse genutzt werden können, weil sie eine Form von doppelter Markierung sind. Das umfangreiche Gefüge zahlreicher Laubblattvarianten (Farbtafel I) ermöglicht Untersuchungen zur Gewebekonkurrenz, die u.a. in Hinblick auf verschiedene Chlorophyllgehalte einzelner Schichten geführt werden sollten. Da die Typenvielfalt so groß ist, gibt es eine gute Vergleichsbasis. Desweiteren sind aus solchen Analysen histologische Aussagen zur Ontogenese des Laubblattes zu erwarten.


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