Philipp, Ute: Charakterisierung von Heterosiseffekten für Wurfgröße bei der Maus durch DNA-Marker-Analysen

30

Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Tiere

Für den Inzuchtlinien-Kreuzungsversuch zur Erzeugung von F2-Tieren nach F1-Intercross wurden die Stämme C57BL/6J und Balb/cJ verwendet. Sie sind wie folgt charakterisiert (Firmenunterlagen Bomholtgard Breeding and Research Centre, Dänemark, 1995):

C57BL/6JBom: Der Inzuchtstamm wurde vom Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd. in der ca. 145. Inzuchtgeneration bezogen. Der Ausgangsstamm ist 1921 aus dem Substamm C57BL/6 hervorgegangen, der zu den am meisten verwendeten Inzuchtstämmen zählt. Er zeichnet sich durch eine gute Zuchtleistung und eine mittlere Lebenserwartung von 700-800 Tagen unter normalen Haltungsbedingungen und 1200 Tagen unter SPF-Bedingungen aus.

Balb/cJBom: Der Inzuchtstamm wurde vom Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd. in der ca. 72. Inzuchtgeneration bezogen. Der Ausgangsstamm wurde 1913 von H. Bagg und nach 1940 vom Jackson Laboratorium über 150 Generationen ingezüchtet und besitzt eine gute und lange reproduktive Leistung.

3.1.2. Labormaterialien

SIGMA, Deisenhofen:

3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan (haftendes Silan), Bromphenolblau, Mineralöl, HCL, Dithioeritrithol (DTE)

Roth, Karlsruhe:

TEMED, Natriumacetat, Borsäure, Formaldehyd, NaCl, Ammoniumperoxodisulfat (APS), Agarose, Lauryl Sulfate (SDS), 100 % Essigsäure, Proteinase K, NaOH, Rotiphorese Gel 40, NaBH4, Methanol, Na2CO3, Ethanol

Merck, Darmstadt:

Titriplex (EDTA), Tris-hydroxymethyl-aminomethan

Research Genetics, Kanada:

fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Primer (MapPairs)

Fluka, Buchs:

Fluka Gel Repel I (nicht haftendes Silan)

INVITEK, Berlin:

Taq-Polymerase, dNTP-Mix


31

3.1.3. Puffer und Lösungen

Alle Lösungen wurden mit bidestilliertem Wasser angesetzt und anschließend autoklaviert.

3.1.4. Geräte

Sequenzieranlage:

SS 1000, Fröbel, Wasserburg

Elektrophorese-Doppelkammer:

Blue Vertical 160/C, Serva, Heidelberg

A.L.F.-Sequenzierautomat:

Pharmacia, Biotech, Freiburg

Horizontalelektrophorese-Apparatur:

Standard-device A5 ISS, UniEquip, Martinsried

Thermocycler:

Omnigene, MWG Biotech, Ebersberg

Crocodile, Appligene, Heidelberg

Gleichstromspannungsquellen:

E 452 und E 734 Consort, Fröbel, Wasserburg

Hybridisierungsofen:

7601, GFL Hannover

Magnetrührwerk mit Heizplatte:

MR 3001, Heidolph, Kelheim

Spektralphotometer:

Ultrospec 3, Pharmacia, Schweden

Tischzentrifuge:

Universal 30 RF, Hettich, Tuttlingen

Transilluminator:

TVR 312, Schubert, Schwandorf

Mikrowelle:

Siemens, Berlin


33

3.2. Methoden

3.2.1. Zuchtversuch

Im Kreuzungsversuch C57BL/6J x Balb/cJ wurden die Tiere der Parentalgeneration reziprok miteinander angepaart. Zur Erzeugung der F2 erfolgte innerhalb der reziproken Varianten ein Intercross der gesamten F1. Diese wurden anschließend für die Ermittlung der Wurfgrößen der F2-Tiere mit männlichen Tieren der F1 verpaart. Die F2-Tiere mit einer hohen Wurfleistung von ge 11 Nachkommen pro Wurf wurden getötet und Ohren, Schwanz, Leber, Nieren und Milz bei -80 °C gelagert. F2-Tiere mit einer Wurfleistung von le 10 Nachkommen pro Wurf wurden erneut mit männlichen F1-Tieren angepaart, um die Genauigkeit bei der Ermittlung der geringen Wurfleistung durch die Erfassung eines zweiten Wurfes zu erhöhen. Ein Überblick über den Zuchtversuch ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abb. 1: Zuchtschema der Inzuchtlinienkreuzung C57BL/6J x Balb/cJ

Die Heterosis- (h) und Maternaleffekte (m) für Wurfgröße wurden nach (BOUJENANE, 1990) ermittelt:

h (F1) = 0,5 (F1 CB + F1 BC) - 0,5 (C + B)

h (F2) = 0,5 (F2 CB + F2 BC) - 0,5 (C + B)


34

m (F1) = F1 BC - F1 CB

m (F2) = F2 BC - F2 CB

Hierbei bedeuten:

C:

Inzuchtstamm C57BL/6J

B:

Inzuchtstamm Balb/cJ

h (F1):

Heterosiseffekt h in der ersten Kreuzungsgeneration

h (F2):

Heterosiseffekt h in der zweiten Kreuzungsgeneration

m (F1):

Maternaleffekt m in der ersten Kreuzungsgeneration

m (F2):

Maternaleffekt m in der zweiten Kreuzungsgeneration

F1 CB, F1 BC:

F1 aus der Kreuzung C57BL/6J x Balb/cJ (F1 CB) bzw. Balb/cJ x C57/BL/6J (F1 BC)

F2 CB, F2 BC:

F2 aus der Kreuzung F1 CB x F1 CB (F2 CB) bzw F1 BC x F1 BC (F2 BC)

3.2.2. Bildung von Tiergruppen mit unterschiedlicher Wurfgröße

Als Leistungsmerkmal für die Fruchtbarkeit wurde die Wurfgröße gewählt, die als Merkmal mit hohen heterotischen Effekten bekannt ist. Selektionskriterium war die Anzahl geborener Tiere je Wurf (insgesamt Geborene). Die Merkmalserfassung erfolgte täglich, bei stündlicher Kontrolle werfender Weibchen.

Aus der F2-Gesamtpopulation wurden extreme Leistungsgruppen mit hohen und niedrigen Wurfgrößen gebildet. Ziel war eine möglichst hohe Spannweite der Wurfgrößen zwischen den Gruppen. Die Größen der Leistungsgruppen richteten sich nach der Tierzahl, welche die geforderten Leistungen erbrachten. F2-Tiere mit folgenden Wurfgrößen bildeten die extremen Leistungsgruppen:

Hochleistungsgruppe 1 (HLG 1):

ge 13 Nachkommen in einem Wurf

Niedrigleistungsgruppe 1 (NLG 1):

le 5 Nachkommen in jedem von zwei aufeinanderfolgenden Würfen


35

Spezifische Mikrosatellitenloci, die in Chromosomenregionen mit Fruchtbarkeit assoziierten DNA-Loci liegen (Tab. 4, S. 26), wurden an F2-Tieren einer größeren Stichprobe getestet. Dazu erfolgte eine zusätzliche Selektion von F2-Tieren, um die Hoch- und Niedrigleistungsgruppe zu vergrößern und eine Mittelleistungsgruppe zu bilden. Die Leistungen der Tiere der Mittelleistungsgruppe entsprachen der durchschnittlichen Leistung der F2-Gesamtpopulation des ersten bzw. zweiten Wurfes. Tiere der F2 mit folgenden Leistungswerten wurden zusätzlich berücksichtigt:

Hochleistungsgruppe 2 (HLG 2):

ge 11 Nachkommen in einem Wurf

Niedrigleistungsgruppe 2 (NLG 2):

le 6 Nachkommen in jedem von zwei aufeinanderfolgenden Würfen

Mittelleistungsgruppe (MLG):

im ersten Wurf 8 Nachkommen, im zweiten Wurf 9 Nachkommen

3.2.3. Recherchen in der Datenbank Mouse Genome Database zur Auswahl von Mikrosatelliten

Die Arbeitsgruppe um E. Lander am Whitehead Institute/Mit Center for Genome Research in Cambridge, Massachusetts erstellte eine Kopplungskarte mit 6183 SSLP-Markern (Simple Sequence Length Polymorphism, Stand Mai 1996). Die Fragmentlängen der Mikrosatelliten wurden an 12 Mäusestämmen geprüft. Die notwendigen Vorinformationen über die Lokalisation und Polymorphie zwischen den getesteten Inzuchtstämmen der Maus standen für die Auswahl von Mikrosatelliten durch die Datenbank Mouse Genome Database (MGD) zur Verfügung.


36

3.2.4. Auswahl von Mikrosatelliten

Die Auswahl der Mikrosatelliten erfolgte zunächst in Abhängigkeit der aus der Literatur ermittelten DNA-Loci mit Beziehung zur Fruchtbarkeit. Hierbei wurden solche Mikrosatelliten berücksichtigt, die sich anhand der in der Datenbank MGD angegebenen Lokalisation am selben Locus befanden wie Loci, die für Fruchtbarkeit bedeutungsvoll sind, bzw. in einem minimalen Abstand von diesen entfernt lagen. Darüber hinaus wurden Mikrosatelliten gewählt, die als Marker eine gleichmäßige Abdeckung des Genoms realisierten. Ein Abstand von 30-35 cM zum benachbarten Mikrosatelliten bzw. zum Randbereich des Chromosoms und die Verfügbarkeit verschiedener Allele zwischen den beiden zu untersuchenden Stämmen C57BL/6J und Balb/cJ galten als Voraussetzung. Bei Vorhandensein mehrerer polymorpher Mikrosatelliten für einen Locus sind solche gewählt worden, deren Fragmentlängen nicht über 200 bp liegen, da die Optimierung und Darstellung langer Fragmente sehr aufwendig ist. Die Tabelle 5 enthält die Lokalisationen der mit Fruchtbarkeit assoziierten DNA-Loci und die Zusammenstellung der diese Loci repräsentierenden Mikrosatelliten.


37

Tab. 5: Zusammenstellung von Mikrosatelliten, die mit Fruchtbarkeit assoziierte Loci der Maus charakterisieren (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)

Locus *

Chromosom

Lokalisation (cM)

Mikrosatellit

Lokalisation (cM)

Inha

Inhbb

1

41,6

64,1

D1Mit23

D1Mit91

41,0

64,0

Fshb

2

60,0

D2Mit58

60,0

Cga

4

9,5

D4Mit193

12,3

Pmv12

Pdgfa

5

77,0

88,0

D5Mit30 **

D5Mit101

72,0

88,0

Ryr1

Lhb

Jdf

7

10,0

22,0

46,1

D7Mit22 **

D7Mit158

D7Mit301

8,0

23,0

46,4

Cyp19

9

31,0

D9Mit162

30,0

Estr

Igf1

10

9,5

46,0

D10Mit2

D10Mit117

9,0

45,4

Pmv2

Shbg

11

5,0

35,0

D11Mit162

D11Mit339

8,0

35,0

Inhba

Prl

Pl1

13

10,0

14,0

17,0

D13Mit115

D13Mit136 **

10,0

15,0

Pdgfb

15

43,3

D15Mit158

41,8

Cyp21a1

Ped

H2

17

18,8

19,5

23,0

D17Mit16 **

D17Mit52 **

18,2

22,3

* Legende zu den Abkürzungen siehe Tab. 4, S. 26

** Genotypisierung der Mikrosatelliten an F2-Tieren erweiterter Leistungsgruppen

Zusätzlich zu den in Tabelle 5 genannten 19 Mikrosatelliten wurden weitere 37 Mikrosatelliten ausgewählt, die, gleichmäßig verteilt, das gesamte Genom der Maus charakterisieren. Einige der Loci (D2Mit368, D5Mit229, D13Mit76, D17Mit11 und D19Mit61) wurden zu einem späteren Zeitpunkt in die Untersuchungen einbezogen, um diese Chromosomenregionen genauer als andere untersuchen zu können (Wiederholungsmarker). Die angegebenen


38

Lokalisationen wurden der Datenbank MGD entnommen (Stand Mai 1996). Die Abbildungen 2 und 3 zeigen alle 56 typisierten Mikrosatelliten.

Abb. 2: Verteilung der insgesamt berücksichtigten Mikrosatelliten auf den Chromosomen 1 - 9 (* Mikrosatelliten als Wiederholungsmarker typisiert)


39

Abb. 3: Verteilung der insgesamt berücksichtigten Mikrosatelliten auf den Chromosomen 10 - X (* Mikrosatelliten als Wiederholungsmarker typisiert)


40

Die Fragmentlängen der getesteten 56 Mikrosatelliten sowie deren Auswahlkriterien sind in der Tabelle 6 enthalten.

Tab. 6: Zusammenstellung ausgewählter Mikrosatelliten, ihre Lokalisationen und Fragmentlängen für die Mäuse-Inzuchtlinien C57BL/6J und Balb/cJ (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)

Chromosom/

Gesamtlänge

Mikrosatellit

Lokalisation

(cM)

Allele, Fragmentlängen

C57BL/6J Balb/cJ

Art der Auswahl

1/

112,19 cM

D1Mit211

D1Mit23

D1Mit91

D1Mit113

20,7

41,0

64,0

90,6

139

134

148

206

149

130

142

224

1

2

2

1

2/

114,5 cM

D2Mit372

D2Mit368

D2Mit58

D2Mit410

27,0

27,0

60,0

78,7

123

100

134

116

127

98

168

121

1

1, 3

2

1

3/

95 cM

D3Mit120

D3Mit127

32,1

70,3

148

176

160

168

1

1

4/

81 cM

D4Mit193

D4Mit175

D4Mit148

12,3

44,0

63,0

138

110

128

123

126

140

2

1

1

5/

102 cM

D5Mit148

D5Mit229

D5Mit236

D5Mit30

D5Mit101

18,0

18,0

47,0

72,0

88,0

149

150

192

144

130

135

154

188

140

118

1

1, 3

1

2, 4

2

6/

85 cM

D6Mit93

D6Mit290

26,0

62,5

140

127

152

117

1

1

7/

79 cM

D7Mit22

D7Mit158

D7Mit301

8,0

23,0

46,4

220

151

115

222

159

131

2, 4

2

2


41

Tab. 6: (Forts.) Zusammenstellung ausgewählter Mikrosatelliten, ihre Lokalisationen und Fragmentlängen für die Mäuse-Inzuchtlinien C57BL/6J und Balb/cJ (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)

Chromosom/

Gesamtlänge

Mikrosatellit

Lokalisation

(cM)

Allele, Fragmentlängen

C57BL/6J Balb/cJ

Art der Auswahl

8/

84 cM

D8Mit191

D8Mit112

22,0

54,0

144

122

132

128

1, 4

1

9/

74 cM

D9Mit162

D9Mit35

30,0

52,0

140

124

122

112

2

1

10/

80,5 cM

D10Mit2

D10Mit117

9,0

45,4

124

142

132

126

2

2

11/

80 cM

D11Mit162

D11Mit339

D11Mit213

8,0

35,0

55,0

123

127

141

131

175

143

2

2

1, 4

12/

86,6 cM

D12Mit54

D12Mit20

26,0

58,0

154

200

146

208

1

1

13/

78 cM

D13Mit115

D13Mit136

D13Mit13

D13Mit130

D13Mit76

10,0

15,0

33,0

58,5

59,0

151

97

148

143

106

141

101

138

117

98

2

2, 4

1

1

1, 3

14/

69 cM

D14Mit141

D14Mit265

15,0

48,0

141

148

125

178

1

1

15/

72,5 cM

D15Mit121

D15Mit158

30,6

41,8

148

152

163

170

1

2

16/

71,9 cM

D16Mit166

D16Mit189

21,0

53,7

149

199

155

185

1

1

17/

60 cM

D17Mit16

D17Mit11

D17Mit52

D17Mit142

18,2

21,6

22,3

47,4

118

174

154

147

106

150

156

123

2, 4

2, 3

2, 4

1


42

Tab. 6: (Forts.) Zusammenstellung ausgewählter Mikrosatelliten, ihre Lokalisationen und Fragmentlängen für die Mäuse-Inzuchtlinien C57BL/6J und Balb/cJ (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)

Chromosom/

Gesamtlänge

Mikrosatellit

Lokalisation

(cM)

Allele, Fragmentlängen

C57BL/6J Balb/cJ

Art der Auswahl

18/

74,95 cM

D18Mit123

D18Mit106

31,0

50,0

116

115

125

135

1

1

19/

57,32 cM

D19Mit61

D19Mit28

D19Mit36

8,0

12,0

40,5

131

148

164

149

154

174

1, 3

1

1

X/

82,2 cM

DXMit73

DXMit130

19,0

55,0

113

168

125

146

1

1

1) Mikrosatelliten zur gleichmäßigen Abdeckung des Genoms

2) Mikrosatelliten zur Charakterisierung von DNA-Loci mit Assoziation zur Fruchtbarkeit

3) Zusätzlich als Wiederholungsmarker ausgewählte Mikrosatelliten

4) Genotypisierung der Mikrosatelliten an F2-Tieren erweiterter Leistungsgruppen

Von den in Tabelle 6 aufgeführten 56 Mikrosatelliten wurden sieben für die Untersuchung an einer größeren Stichprobe von F2-Tieren mittels A.L.F.-Sequenzierautomat verwendet. Die Auswahl dieser Mikrosatelliten erfolgte unter folgenden Gesichtspunkten:

Die Mikrosatelliten wurden mit fluoreszenzmarkierten Primern amplifiziert und mit dem A.L.F.-Sequenzierautomaten dargestellt.


43

3.2.5. Isolierung genomischer DNA aus Gewebe

Zur Isolierung der DNA aus Knorpelgewebe wurde eine Kurzmethode angewandt (Zentralinstitut für Versuchstierkunde Hannover, Dr. Prokop), die sich bereits mehrfach in Voruntersuchungen durch eine ausreichende DNA-Menge und DNA-Qualität bewährte. Es fand ein Verdau des Materials in 1 ml Tris-Puffer über Nacht auf dem Überkopfschüttler im Hybridisierungsofen bei 55°C durch 60 µl Proteinase K (10 mg/ml) statt. Bis dahin ungelöste Zellsubstanzen wurden mittels Zentrifugation (11.400 x g, 10 min) von der freigesetzten DNA im Überstand getrennt. Das Aussalzen noch vorhandener Restproteine aus dem Überstand erfolgte mit 500 µl NaCl-Lösung (6 mol/l) und anschließender Zentrifugation (11.400 x g, 10 min). Die im Überstand enthaltene DNA wurde mit 96% Ethanol (2 Volumen pro 1 Volumen Überstand) präzipitiert und nachfolgend zweifach in jeweils 1 ml 70%-igem Ethanol gewaschen. Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen, um das DNA-Pellet über Nacht zu trocknen. Die abschließende Hinzugabe von 200 µl TE-Puffer ohne zusätzliche Phenol-Chloroform-Extraktion führte zu einer qualitativ und quantitativ guten DNA-Ausbeute.

3.2.6. Kontrolle der DNA

Für die Kontrolle der DNA-Reinheit und zur Bestimmung ihrer Konzentration wurde am Spektralphotometer die optische Dichte bei 260 nm und 280 nm gemessen. Die DNA hat ein Absorbtionsmaximum von 260 nm, Proteine bei 280 nm. Die DNA-Konzentration und der Reinheitsgrad wurden mit folgender Formel berechnet:

DNA-Konzentration (µg/µl): ( OD260 x 47,5 x 100 ) x 1000-1

Reinheitsgrad: ( OD260 x 50 ) x ( OD280 x 40 )-1

Der Quotient der Absorbtion von 260 nm und 280 nm sollte etwa zwischen 1,6 und 1,8 liegen. Er spiegelt den Reinheitsgrad der DNA wider. Niedrigere Werte weisen auf Proteinverunreinigungen hin. Der strukturelle Zustand der DNA wurde über ein Testgel kontrolliert. Dabei erfolgte die Auftrennung der isolierten DNA in einem 0,8%-igem Agarosegel in TBE-Puffer bei einer Feldstärke von 3 V/cm. Zur anschließenden optischen Erkennung auf dem Transilluminator wurde dem Gel 0,05 µg/ml Ethidiumbromid hinzugesetzt.


44

3.2.7. Analyse von Mikrosatelliten mit Hilfe der Silbernitratfärbung

3.2.7.1. Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern

Die Amplifizierung der Mikrosatelliten erfolgte mittels PCR im Thermocycler Omnigene der Firma MWG Biotech. Die in Tabelle 7 dargestellten Programmvarianten fanden Anwendung.

Tab. 7: Programmvarianten der PCR zur Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern

Zahl der Zyklen

Programm 1

Programm 2

Temp. (°C)

Zeit (s)

Temp. (°C)

Zeit (s)

Denaturieren

94

180

94

180

1

Annaeling

56-58

30

-

-

Synthese

72

40

-

-

Denaturieren

94

120

94

15

30

Annealing

56-58

120

56-58

120

Synthese

72

60

72

120

Denaturieren

94

60

-

-

1

Annealing

56-58

30

-

-

Synthese

72

300

72

350

Die Einsatzmengen an MgCl2, Primer und Taq-Polymerase wurden optimiert und anschließend weitestgehend standardisiert verwendet. Ein Einfluß der DNA-Konzentration hat sich in früheren Untersuchungen als sehr gering herausgestellt, so daß die präparierte DNA-Lösung nicht standardisiert eingesetzt wurde. Die Optimierung der PCR-Bedingungen erfolgte an Tieren der beiden Inzuchtstämme C57BL/6J und Balb/cJ und an F1-Nachkommen. Ziel war die eindeutige Analyse der Allele der Inzuchtstämme und der heterozygoten Genotypen der jeweiligen F1-Nachkommen. Folgende PCR-Optimierungsparameter wurden für die Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern mittels Silbernitratfärbung ermittelt:


45

DNA-Konzentration:

200 - 1000 ng,

Primer-Konzentration:

0,13 µM,

Taq-Polymerase:

1 U.

Die Angaben beziehen sich auf einen PCR-Ansatz von 30 µl. Bei den Reihenuntersuchungen wurden Stammansätze für 30-40 Tiere pipettiert. Primerspezifische Optimierungsparameter werden in der Tabelle 8 zusammengefaßt.

Tab. 8: PCR-Bedingungen zur Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern

Mikrosatellit

MgCl2-Konzentration (mM)

Annealing-Temperatur (°C)

PCR-Programm

(vgl. Tab. 7)

D1Mit211

D1Mit23

D1Mit91

D1Mit113

1,2

1,2

1,2

1,1

58

56

56

56

1

2

2

2

D2Mit372

D2Mit368

D2Mit58

D2Mit410

1,2

1,2

1,2

1,2

58

56

58

58

1

1

1

1

D3Mit120

D3Mit127

1,2

1,2

58

56

1

2

D4Mit193

D4Mit175

D4Mit148

1,2

1,2

1,2

58

58

56

1

1

2

D5Mit148

D5Mit229

D5Mit236

D5Mit101

1,2

1,2

1,1

1,2

58

56

56

58

1

1

2

1

D6Mit93

D6Mit290

1,2

1,2

58

56

1

2

D7Mit158

D7Mit301

1,2

1,2

58

56

1

2


46

Tab. 8: (Forts.) PCR-Bedingungen zur Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern

Mikrosatellit

MgCl2-Konzentration (mM)

Annealing-Temperatur (°C)

PCR-Programm

(vgl. Tab. 7)

D8Mit112

1,2

56

2

D9Mit162

D9Mit35

1,2

1,2

58

58

1

1

D10Mit2

D10Mit117

1,2

1,1

58

56

1

2

D11Mit162

D11Mit339

1,2

1,2

58

58

1

1

D12Mit54

D12Mit20

1,2

1,2

56

56

2

2

D13Mit115

D13Mit13

D13Mit130

D13Mit76

1,2

1,2

1,2

1,2

58

56

56

56

1

2

2

1

D14Mit141

D14Mit265

1,2

1,2

58

58

1

1

D15Mit121

D15Mit158

1,2

1,2

58

58

1

1

D16Mit166

D16Mit189

1,2

1,2

56

56

2

2

D17Mit142

D17Mit11

1,2

1,2

58

56

1

1

D18Mit123

D18Mit106

1,2

1,2

58

58

1

1

D19Mit28

D19Mit61

D19Mit36

1,2

1,2

1,2

58

58

58

1

1

1

DXMit73

DXMit130

1,2

1,2

56

56

2

2


47

3.2.7.2. Polyacrylamidgel-Elektrophorese zur Auftrennung unmarkierter Mikrosatelliten

Die Auftrennung der Mikrosatelliten erfolgte in einem 12%-igem Polyacrylamidgel mit einem Anteil von 2% Bisacrylamid. Die Polyacrylamidgele hatten eine Dicke von 0,4 mm. Als Puffer wurde 0,6 x TBE verwendet. Die jeweiligen Laufbedingungen sind in Tabelle 9 angegeben. Die Elektrophoresen erfolgten ungekühlt bei Raumtemperatur.

Tab. 9: Bedingungen für die Polyacrylamidgel-Elektrophorese zur Auftrennung unmarkierter Mikrosatelliten

Elektrophorese-Apparatur

SS-1000 Sequencer

Blue Vertical 160/C

Probenanzahl pro Gel

36

2 x 25

Gellänge

43 cm

18 cm

Bedingungen:

Tageslauf

Nachtlauf

1500 V, 50 mA, 30 W

500 V, 25 mA, 30 W

300 V, 50 mA

100 V, 25 mA

Laufzeit:

Tageslauf

Nachtlauf

5 h

17 h

5 h

17 h

Auftragsvolumen (µl) *

12

9

* Zwei Volumen PCR-Produkt und ein Volumen Bromphenolblaulösung

Für die Auftrennung unmarkierter Mikrosatelliten fanden zwei unterschiedliche Elektrophorese-Apparaturen mit einer Kapazität von 36 Proben und 2 x 25 Proben Anwendung. Pro Polyacrylamidgel wurde ein Mikrosatellit für alle 32 zu testenden Tiere der beiden extremen Leistungsgruppen (HLG 1 und NLG 1) analysiert. Weiterhin sind auf das Gel zusätzlich die Inzuchttiere und ein F1-Tier aufgetragen worden, um durch den unmittelbaren Vergleich zu einem homozygoten bzw. heterozygoten Genotyp, die Tiere der F2 typisieren zu können. Nach der Elektrophorese erfolgte die Färbung der PCR-Fragmente direkt im Polyacrylamidgel, welches einer Glasplatte als Trägermaterial anhaftete. Die Färbung begann mit der Fixierung der Mikrosatelliten im Gel durch Eisessig für 10 min in Lösung 1 (S. 32). Anschließend wurde das Gel für 14 min in Silbernitratlösung (1g/l) gefärbt und darauffolgend zweimal kurz in Wasser abgespült. Die eigentliche Farbfällung erfolgte in Lösung 2 (S. 32) für ca. 20 min Die abschließende Inkubation in Na2CO3 (7,5 g/l) für ca. 2 min ermöglichte eine


48

Haltbarkeit des Geles über mehrere Tage. Das noch feuchte Polyacrylamidgel wurde mit einer Folie abgedeckt und nach kurzem Trocknen fotokopiert. Außer der unmittelbar vor Gebrauch angesetzten Lösung 2 wurden alle Lösungen der Silbernitratfärbung dreimal verwendet. Die Genotypen der Mikrosatellitenloci wurden anhand der Bandenmuster ohne weitere Hilfsmittel erfaßt.

3.2.8. Analyse von Mikrosatelliten mit dem A.L.F.-Sequenzierautomaten

3.2.8.1. Amplifizierung von Mikrosatelliten mit fluoreszensmarkierten Primern

Mit dem Ziel der Untersuchung von sieben spezifischen Mikrosatelliten an einer größeren Stichprobe von F2 -Tieren wurden während eines Aufenthaltes an der Universität Hohenheim (Fachgebiet Tierzüchtung, Leitung Prof. Dr. H. Geldermann) für einen hohen Probendurchsatz Multiplex-Ansätze etabliert. Die Amplifizierung der Mikrosatelliten erfolgte im Thermocycler Crocodile der Firma Appligene (Tab. 10).

Tab. 10: PCR-Programm für die Amplifizierung von Mikrosatelliten mit fluoreszenzmarkierten Primern

Zahl der Zyklen

Temp. (°C)

Zeit (s)

1

Denaturieren

94

180

Denaturieren

94

15

25

Annealing

56

120

Synthese

72

120

1

Synthese

72

300


49

Für sechs der sieben Mikrosatelliten wurden zwei Multiplex-Ansätze mit je drei Mikrosatelliten etabliert. Ein Mikrosatellit konnte in keinen der beiden Multiplex-Ansätze eingehen, da sich seine Fragmentlängen mit denen von anderen Mikrosatelliten überlagerten. Alle drei PCR-Ansätze hatten ein Volumen von je 30 µl. Die Reaktionen verliefen unter folgenden Bedingungen:

MgCl2-Konzentration:

1,1 mM,

DNA-Konzentration:

200 - 1000 ng,

Taq-Polymerase:

3 U für Multiplex-Ansätze, 1 U für Einzelansatz.

Die Tabelle 11 zeigt die eingesetzten Primerkonzentrationen für die PCR-Reaktionen.

Tab. 11: PCR-Bedingungen für die Amplifizierung von Mikrosatelliten mit fluoreszenzmarkierten Primern

PCR-Ansatz

Mikrosatellit

Konzentration je Primer (µM)

Multiplex-Ansatz 1

D17Mit16

D8Mit191

D17Mit52

0,16

0,08

0,16

Multiplex-Ansatz 2

D13Mit136

D5Mit30

D7Mit22

0,13

0,16

0,16

Einzelansatz

D11Mit213

0,08

3.2.8.2. Polyacrylamidgel-Elektrophorese zur Auftrennung von Mikrosatelliten im A.L.F.-Sequenzierautomaten

Das Arbeiten mit dem A.L.F.-Sequenzierautomaten setzt die Markierung der Fragmente mit Fluorescein voraus. Die Fragmentanalyse erfolgt durch einen im unteren Teil des Geles fixierten Laserstrahl, der das Gel in der gesamten Breite durchdringt. In dieser Höhe befindet sich hinter der Glasplatte an jeder Trennspur eine Photozelle. Wenn eine Bande diese Stelle erreicht, werden die fluoreszierenden DNA-Fragmente durch das Laserlicht angeregt und emittieren Lichtsignale. Eine Registrierung dieser Lichtsignale im Computer schließt sich an.


50

Die Lösungen mit den PCR-Produkten wurden 10-fach verdünnt und anschließend in einem Volumenverhältnis mit der Bromphenolblaulösung von 2:1 aufgetragen. Außerdem wurden den Ansätzen jeweils ein interner Standard (95 und 216 bp bzw. 110 und 274 bp) zugesetzt. Die Auftrennung erfolgte unter denaturierenden Bedingungen, d.h. die Proben wurden unmittelbar vor dem Auftragen für 1,5 min einer Temperatur von 90 °C ausgesetzt und sofort auf Eis gestellt, um den denaturierten Zustand zu erhalten. Folgende Elektrophoresebedingungen wurden verwendet (Tab. 12).

Tab. 12: Laufbedingungen für die Polyacrylamidgel-Elektrophorese mit dem A.L.F.-Sequenzierautomaten

A.L.F.-Sequenzierautomat

Probenanzahl pro Gel

40

Gellänge

40 cm

Laufzeit

100 min

Bedingungen

Temperatur

1500 V, 45 mA, 34 W

50 °C

Laser: Leistung

Sampling Intervall

3 mW

1,25 s

Auftragsvolumen (µl)*

3

* Zwei Volumen PCR-Produkt und ein Volumen Bromphenolblaulösung

Zur Sicherung gleichbleibender, genauer Untersuchungsbedingungen wurden die Reagenzien standardisiert. Den Vergleichen der Fragmentlängen standen während der Optimierung der PCR die Genotypen jeweils mehrerer Tiere der beiden Inzuchtstämme und die entsprechenden F1-Nachkommen zur Verfügung, mit denen auch die Wiederholbarkeit der Genotypenbestimmungen überprüft werden konnte. Im Verlaufe der Reihenuntersuchungen wurden bei den PCR-Reaktionsansätzen für jeden Mikrosatellitenlocus Stammansätze hergestellt, so daß nachfolgend nur noch die DNA der einzelnen Tiere hinzugegeben werden mußte. Aufgrund der genauen Fragmentlängenanalyse mit dem A.L.F.-Sequenzierautomaten und der Möglichkeit der computergestützten Auswertung war bei der fluoreszenzmarkierten Darstellung der Mikrosatelliten eine genaue Erfassung der Fragmentlängen möglich. Auf dieser Datenbasis ließen sich direkt die homozygoten bzw. heterozygoten Genotypen der F2-Tiere


51

ablesen. Die Gelkapazität von 40 Proben konnte voll ausgenutzt werden, da interne Standards verwendet wurden.

3.2.9. Schätzung des Dominanzgrades

Bei den F2-Tieren markiert der Besitz verschiedener elterlicher Allele an Mikrosatellitenloci zugleich die Vererbung der betreffenden Chromosomenabschnitte. Von den so als Markerloci verwendeten Mikrosatelliten wurde der Dominanzgrad (für den damit markierten Chromosomenabschnitt) nach folgender Formel berechnet (FALCONER, 1980):

Dominanzgrad = d/a

d:

Dominanzabweichung, Differenz zwischen dem Merkmalswert der heterozygoten Tiere und dem Merkmalsmittel der Tiere mit verschiedenen homozygoten Genotypen,

a:

Additive Genwirkung, halbe Differenz zwischen Merkmalswerten von Tieren mit den verschiedenen homozygoten Genotypen.

Dabei wurden alle für den jeweils betrachteten Mikrosatellitenlocus untersuchten Tiere in die Berechnung einbezogen. In Abhängigkeit der Werte des Dominanzgrades wurden die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Mikrosatellitenloci daraufhin statistisch überprüft, ob sie mit Superdominanz oder Dominanz assoziiert waren.

3.2.10. Statistische Auswertung der Ergebnisse

Die statistische Auswertung des Datenmaterials erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS Version 6.1 für Windows. Die Beziehung zwischen dem Heterozygotiegrad verschiedener Leistungsgruppen bzw. dem Anteil Genotypen, die mit Dominanz assoziiert auftraten, und der Heterosis für Wurfgröße wurde anhand einer 2 x 2 Kontingenztafel mit dem Chi-Quadrat-Test nach Pearson untersucht. Im Falle erwarteter Häufigkeiten unter 5 wurde der Exakte Test nach Fisher genutzt. Als Signifikanzniveau galt der für biologische Systeme übliche Wert von alpha = 0,05.


52

3.2.10.1. Statistische Analyse von Geneffekten

Mikrosatelliten-Genotypen, die im Zusammenhang mit einer superdominanten Genwirkung auftraten, wurden, ausgehend von folgendem Modell, statistisch geprüft:

AA < Aa > aa.

Nach der Superdominanztheorie ist Heterosis an das Auftreten heterozygoter Genotypen gebunden. Es wurde geprüft, ob die für Fruchtbarkeits-Heterosis relevanten Markerloci in der Hochleistungsgruppe gegenüber der Niedrigleistungsgruppe einen signifikant erhöhten Anteil heterozygoter Genotypen aufwiesen.

Mikrosatelliten-Genotypen, die im Zusammenhang mit einer dominanten Genwirkung auftraten, wurden, ausgehend von folgendem Modell, statistisch geprüft:

AA = Aa > aa.

Nach der Dominanztheorie ist Heterosis an das Vorhandensein dominanter Leistungsallele gebunden. Es wurde geprüft, ob die für Fruchtbarkeits-Heterosis relevanten Markerloci in der Hochleistungsgruppe gegenüber der Niedrigleistungsgruppe einen signifikant erhöhten Anteil Genotypen mit Dominanz assoziiertem Allel aufwiesen.

3.2.10.2. Berechnung der Allelfrequenzen für Mikrosatellitenloci

Ausgehend von der Kreuzung zweier, in bezug auf die betrachteten Markerloci, genetisch divergenter Inzuchtstämme ist bei Zufallspaarung eine F1 mit einem Heterozygotiegrad von 100 % und in der F2 ein Heterozygotiegrad von 50 % zu erwarten. In der F2 sollten somit die beiden Allele A und a in einem Verhältnis von 1 : 1 auftreten. Für Mikrosatellitenloci, die an F2-Tieren erweiterter Leistungsgruppen typisiert wurden, erfolgte die Berechnung der Allelfrequenzen nach folgenden Formeln:


53

q = (0,5 H + Q) / N,

p = 1-q.

Hierbei bedeuten:

q

Frequenz für das Allel A,

p

Frequenz für das Allel a,

Q

Anzahl homozygoter Genotypen für das Allel A,

H

Anzahl heterozygoter Genotypen,

N

Stichprobenumfang.

Signifikante Abweichungen der beobachteten von den zu erwartenden Allelfrequenzen wurden mit dem Chi-Quadrat-Wert nach Pearson (p le 0,05) berechnet.


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