Philipp, Ute: Charakterisierung von Heterosiseffekten für Wurfgröße bei der Maus durch DNA-Marker-Analysen
Charakterisierung von Heterosiseffekten für Wurfgröße
bei der Maus durch DNA-Marker-Analysen
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum agriculturarum
(Dr. rer. agr.)

eingereicht an der
Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Agr.-Ing. Ute Philipp ,
geb. am 19.09.1969 in Potsdam

Präsident
der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h. c. H. Meyer

Dekan
der Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät
Prof. Dr. Dr. h. c. E. Lindemann

Gutachter:
Prof. Dr. G. Leuthold
Prof. Dr. H. Geldermann

Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.1997

Abstract

Characterization of heterotic effects in litter size using DNA marker analyses in mice

Long dated research could not explain the genetic, biochemical and physiological base of heterosis up to date. The dissertation project is a part of a long term heterosis research project concerning the molecular genetic characterization of the reasons of heterosis. The objective of the dissertation was to find out chromosomal regions of the mouse with a presumable influence on the rise of heterosis in fertility. Both the overdominance and the dominance theory of heterosis have been considered. A reciprocal cross of inbred strains C57BL/6J and Balb/cJ with following F1 intercross was accomplished to establish a F2 generation. From the 948 female F2 animals were formed performance groups with extreme high and low litter sizes to analyse 56 microsatellites on these animals. The microsatellites are located in an average distance of 32 cM in the mouse genome. Twelve of these microsatellites characterize DNA loci with associations to fertility. Corresponding to the analyses based on the overdominance theory of heterosis a significant correlation between the degree of heterozygosity and heterosis in litter size have been demonstrated for six microsatellites. The microsatellites characterize regions on the chromosomes 17 (18.2 - 22.3 cM), 18 (50 cM), and 19 (8 - 12 cM). The DNA loci Ped (Preimplantation embryonic development, 19,5 cM), Cyp21a1 (Cytochrome P450, 21, hydroxylase, 18,7 cM) and H2 (Histocompatibility-2, MHC, 23 cM) showing associations to fertility are located on chromosome 17 in these region. On the base of dominance theory as the reason of heterosis a significant relation between the portion of genotypes with dominant performance allel and heterosis in litter size have been found for two microsatellites. The microsatellites are located on chromosome 5 (72 and 88 cM). The DNA loci Pdgfa (Plateled derived growth factor alpha, 77 cM) and Pmv12 (Polytropic murine leucemia viruses 12, 88 cM) with known associations to fertility are located on these chromosomal regions.

Keywords:
heterosis, DNA marker, fertility, mouse

Zusammenfassung

Charakterisierung von Heterosiseffekten für Wurfgröße bei der Maus durch DNA-Marker-Analysen

Langjährige Forschungsarbeiten konnten die genetische, biochemische und physiologische Basis der Heterosis bis heute nicht klären. Das Promotionsprojekt ist Bestandteil eines längerfristigen Heterosisforschungsprojektes zur molekulargenetischen Charakterisierung der Ursachen von Heterosis. Ziel der Dissertation ist die Analyse von Chromosomenregionen bei der Maus, von denen ein Einfluß auf die Entstehung von Heterosis für Fruchtbarkeit ausgeht. Dabei wurde sowohl die Superdominanz- als auch die Dominanztheorie der Heterosis berücksichtigt. Es wurde eine reziproke Kreuzung der Inzuchtstämme C57BL/6J und Balb/cJ mit anschließendem F1-Interkross zur Erzeugung einer F2-Generation durchgeführt. Von den 948 weiblichen F2-Tieren sind Leistungsgruppen mit extrem hoher und niedriger Wurfgröße gebildet worden, um an diesen Tieren 56 Mikrosatelliten zu analysieren. Die Mikrosatelliten sind im Genom der Maus in einem durchschnittlichen Abstand von 32 cM lokalisiert. 12 von diesen Mikrosatelliten charakterisieren DNA-Loci mit Assoziationen zur Fruchtbarkeit. Entsprechend den Analysen nach der Superdominanztheorie der Heterosis konnte für sechs Mikrosatelliten eine signifikante Beziehung zwischen dem Heterozygotiegrad und der Heterosis für Wurfgröße nachgewiesen werden. Die Mikrosatelliten charakterisieren Regionen auf den Chromosomen 17 (18,2 - 22,3 cM), 18 (50 cM) und 19 (8 - 12 cM). Auf Chromosom 17 befinden sich in diesem Bereich die mit Fruchtbarkeit assoziierenden Gene Ped (Preimplantation embryonic development, 19,5 cM), Cyp21a1 (Cytochrome P450, 21, steroid 21 hydroxylase, 18,7 cM) und H2 (Histocompatibility-2, MHC, 23 cM). Nach dem Dominanzmodell zur Erklärung von Heterosis konnte für zwei Mikrosatelliten eine signifikante Beziehung zwischen dem Anteil Genotypen mit dominantem Leistungsallel und der Heterosis für Wurfgröße ermittelt werden. Die Mikrosatelliten sind auf Chromosom 5 (72 und 88 cM) lokalisiert. In diesen chromosomalen Regionen befinden sich die mit Fruchtbarkeit assoziierten DNA-Loci Pdgfa (Plateled derived growth faktor alpha, 77 cM) und Pmv12 (Polytropic murine leucemia virus-12, 88 cM).

Schlagwörter:
Heterosis, DNA-Marker, Fruchtbarkeit, Maus


Seiten: [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteCharakterisierung von Heterosiseffekten für Wurfgröße bei der Maus durch DNA-Marker-Analysen
Widmung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1.Heterosis
2.1.1.Hypothesen über die Ursachen der Heterosis
2.1.1.1.Superdominanzhypothese
2.1.1.2.Dominanzhypothese
2.1.1.3.Epistasiehypothese
2.1.2.Bedeutung verschiedener Heterosishypothesen
2.1.3.Formen der Heterosis
2.2.Stand der Heterosisforschung
2.2.1.Heterosisforschung in der Pflanzenzucht
2.2.2.Heterosisforschung in der Tierzucht
2.2.3.Bedeutung und Nutzung der Heterosis in der Landwirtschaft
2.3.Die Wurfgröße als quantitatives Merkmal
2.4.DNA-Loci mit Assoziationen zur Fruchtbarkeit
3 Material und Methoden
3.1.Material
3.1.1.Tiere
3.1.2.Labormaterialien
3.1.3.Puffer und Lösungen
3.1.4.Geräte
3.2.Methoden
3.2.1.Zuchtversuch
3.2.2.Bildung von Tiergruppen mit unterschiedlicher Wurfgröße
3.2.3.Recherchen in der Datenbank Mouse Genome Database zur Auswahl von Mikrosatelliten
3.2.4.Auswahl von Mikrosatelliten
3.2.5.Isolierung genomischer DNA aus Gewebe
3.2.6.Kontrolle der DNA
3.2.7.Analyse von Mikrosatelliten mit Hilfe der Silbernitratfärbung
3.2.7.1.Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern
3.2.7.2.Polyacrylamidgel-Elektrophorese zur Auftrennung unmarkierter Mikrosatelliten
3.2.8.Analyse von Mikrosatelliten mit dem A.L.F.-Sequenzierautomaten
3.2.8.1.Amplifizierung von Mikrosatelliten mit fluoreszensmarkierten Primern
3.2.8.2.Polyacrylamidgel-Elektrophorese zur Auftrennung von Mikrosatelliten im A.L.F.-Sequenzierautomaten
3.2.9.Schätzung des Dominanzgrades
3.2.10.Statistische Auswertung der Ergebnisse
3.2.10.1.Statistische Analyse von Geneffekten
3.2.10.2.Berechnung der Allelfrequenzen für Mikrosatellitenloci
4 Ergebnisse
4.1.Zuchtversuch
4.1.1.Wurfgrößen der Tiere der Inzuchtlinienkreuzung C57BL/6J x Balb/cJ
4.1.2.Heterosiseffekte für das Leistungsmerkmal Wurfgröße
4.1.3.Wurfgrößen von Tieren verschiedener Leistungsgruppen
4.2.DNA-Analytik zur Typisierung von Mikrosatelliten
4.2.1.Isolierung genomischer DNA aus Gewebe
4.2.2.Darstellung der Mikrosatelliten im Polyacrylamidgel
4.2.3.Schätzung des Dominanzgrades
4.2.4.Ergebnisse der statistischen Analyse von Geneffekten
4.2.5.Heterozygotiegrad von F2-Tieren verschiedener Leistungsgruppen für Wurfgröße
4.2.6.Allelfrequenzen von Mikrosatellitenloci
4.2.7.Vergleichende Analyse von zwei eng gekoppelten Mikrosatellitenloci
5 Diskussion
5.1.Beiträge experimenteller Arbeiten zur Heterosisforschung am Tier
5.2.Inzuchtlinienkreuzung C57BL/6J x Balb/cJ
5.3.Auswahl verschiedener Leistungsgruppen für Wurfgröße in der F2
5.4.Stichprobengröße von Leistungsgruppen ausgewählter F2-Tiere
5.5.Mikrosatelliten zur Charakterisierung von F2-Tieren verschiedener Leistungsgruppen für Wurfgröße
5.6.DNA-Analytik zur Typisierung von Mikrosatelliten
5.7.Analyse von Heterosiseffekten mit Hilfe von Markerloci
5.7.1.Statistische Analyse von Mikrosatelliten auf der Grundlage des Superdominanzmodells der Heterosis
5.7.2.Statistische Analyse von Mikrosatelliten auf der Grundlage des Dominanzmodells der Heterosis
5.8.Allelfrequenzen und Heterozygotiegrade von Mikrosatelliten in den Leistungsgruppen
5.9.Schlußfolgerungen und Ausblick
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Beispiele für Heterosisprojekte bei Nutztieren
Tab. 2: Zuchtversuch zur Ermittlung der Anzahl von Genorten für die Ausprägung der Merkmale Sechs-Wochen-Gewicht und Wurfgröße bei der Maus
Tab. 3: Phänotypische und genetische Korrelationskoeffizienten für das Merkmal Wurfgröße bei der Labormaus
Tab. 4: DNA-Loci mit Einfluß auf das Fruchtbarkeitsgeschehen und deren Lokalisation im Genom der Maus
Tab. 5: Zusammenstellung von Mikrosatelliten, die mit Fruchtbarkeit assoziierte Loci der Maus charakterisieren (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)
Tab. 6: Zusammenstellung ausgewählter Mikrosatelliten, ihre Lokalisationen und Fragmentlängen für die Mäuse-Inzuchtlinien C57BL/6J und Balb/cJ (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)
Tab. 6: (Forts.) Zusammenstellung ausgewählter Mikrosatelliten, ihre Lokalisationen und Fragmentlängen für die Mäuse-Inzuchtlinien C57BL/6J und Balb/cJ (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)
Tab. 6: (Forts.) Zusammenstellung ausgewählter Mikrosatelliten, ihre Lokalisationen und Fragmentlängen für die Mäuse-Inzuchtlinien C57BL/6J und Balb/cJ (Datenbank MGD, Stand Mai 1996)
Tab. 7: Programmvarianten der PCR zur Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern
Tab. 8: PCR-Bedingungen zur Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern
Tab. 8: (Forts.) PCR-Bedingungen zur Amplifizierung von Mikrosatelliten mit unmarkierten Primern
Tab. 9: Bedingungen für die Polyacrylamidgel-Elektrophorese zur Auftrennung unmarkierter Mikrosatelliten
Tab. 10: PCR-Programm für die Amplifizierung von Mikrosatelliten mit fluoreszenzmarkierten Primern
Tab. 11: PCR-Bedingungen für die Amplifizierung von Mikrosatelliten mit fluoreszenzmarkierten Primern
Tab. 13: Wurfgrößen in verschiedenen Generationen der Inzuchtlinienkreuzung C57BL/6J x Balb/cJ
Tab. 14: Heterosis für Wurfgröße der Inzuchtlinienkreuzung C57BL/6J x Balb/cJ
Tab. 15: Zusammensetzung der Hochleistungsgruppe 1 bezüglich Tierzahlen und Wurfgrößen
Tab. 16: Zusammensetzung der Niedrigleistungsgruppe 1 bezüglich Tierzahlen und Wurfgrößen
Tab. 17: Leistungsgruppen für Wurfgröße in der F2 zur Untersuchung spezifischer Mikrosatelliten
Tab. 18: Mikrosatelliten-Genotypen, die mit einem Dominanzgrad > 1 assoziiert auftraten
Tab. 19: Mikrosatelliten-Genotypen, die mit einem Dominanzgrad zwischen 0 und 1 assoziiert auftraten
Tab. 20: Mikrosatelliten-Genotypen, die mit einem negativen Dominanzgrad assoziiert auftraten
Tab. 21: Schätzung des Dominanzgrades vergleichend mit F2-Tieren extremer und erweiterter Leistungsgruppen
Tab. 22: Mikrosatellitenloci, deren Genotypen mit superdominanter Genwirkung assoziiert auftraten
Tab. 23: Vergleich der Wahrscheinlichkeit p unter Einbeziehung von F2-Tieren verschiedener Wurfgrößen
Tab. 24: Mikrosatellitenloci, deren Genotypen mit dominanter Genwirkung assoziiert auftraten
Tab. 25: Vergleich der Wahrscheinlichkeit p unter Einbeziehung von F2-Tieren verschiedener Wurfgrößen
Tab. 26: Allelfrequenzen von Mikrosatellitenloci, die an F2-Tieren erweiterter Leistungsgruppen typisiert wurden
Tab. 27: Allelfrequenzen von 56 Mikrosatellitenloci der Hoch- und Niedrigleistungsgruppe 1
Tab. 28: Genotypen von zwei Mikrosatellitenloci, die einen Chromosomenbereich charakterisieren, und dazugehörige Dominanzgrade
Tab. 29: Heterozygotiegrade für jeweils zwei eng gekoppelte Mikrosatellitenloci von F2-Tieren der Hoch- und Niedrigleistungsgruppe 1

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Zuchtschema der Inzuchtlinienkreuzung C57BL/6J x Balb/cJ
Abb. 2: Verteilung der insgesamt berücksichtigten Mikrosatelliten auf den Chromosomen 1 - 9 (* Mikrosatelliten als Wiederholungsmarker typisiert)
Abb. 3: Verteilung der insgesamt berücksichtigten Mikrosatelliten auf den Chromosomen 10 - X (* Mikrosatelliten als Wiederholungsmarker typisiert)
Abb. 4: Ermittelte Wurfgrößen in den verschiedenen Generationen (P, F1, F2)
Abb. 5: Darstellung der extremen Leistungsgruppen für Wurfgröße in der F2
Abb. 6: Darstellung der erweiterten Leistungsgruppen für Wurfgröße in der F2 (HLG 2: Hochleistungsgruppe 2, NLG 2: Niedrigleistungsgruppe 2, MLG: Mittelleistungsgruppe)
Abb. 7: Mikrosatellit DXMit130 nach Silbernitratfärbung im Polyacrylamidgel (Nach Einscannen vergrößerte, nicht nachbehandelte Fragmentlängenmuster
C: C57BL/6J, B: Balb/cJ, F1: C57BL/6J x Balb/cJ
CC: Homozygoter Genotyp vom Inzuchtstamm C57BL/6J
BB: Homozygoter Genotyp vom Inzuchtstamm Balb/cJ
CB: Heterozygoter Genotyp)
Abb. 8: Multiplex-Darstellung von drei Mikrosatelliten
Abb. 9: Durchschnittliche Wurfgrößen (geborene Tiere/Wurf) der F2-Tiere mit den Genotypen AA, Aa und aa für Mikrosatelliten mit signifikanter Beziehung zwischen Heterozygotiegrad und Heterosis für Wurfgröße
Abb. 10: Durchschnittlicher Heterozygotiegrad von F2-Tieren der
Abb. 11: Heterozygotiegrade für Mikrosatellitenloci, vergleichend an F2-Tieren verschiedener Leistungsgruppen für Wurfgröße (geborene Tiere/Wurf)
a) Locus D7Mit22
b) Locus D17Mit16
c) Locus D17Mit52
d) Locus D5Mit30
e) Locus D11Mit213
f) Locus D13Mit136

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