Aus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Molecular Epidemiology, Clinical Molecular Diagnosis and Genetic Diversity of Cutaneous Leishmaniasis
in Jericho, Palestine

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum medicarum
(Dr. rer. medic)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Universitätsmedizin- Charité

Von
Amer Al-Jawabreh
Aus Palästina

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. W. Presber
2. Prof. Dr. W. Solbach
3. Prof. Dr. Ch. Jaffe

Datum der Promotion: 25th November, 2005

This research has been part of the scholarship granted to A. Al-Jawabreh by Deutsche Akademische Austauschdienst (DAAD).
The molecular work has been carried out at the laboratory of the Institut für Mikrobiologie und Hygiene- Universitätsmedizin- Charité, Berlin Germany under close supervision of Dr. G. Schoenian and the isolation and the diagnosis at ICS-Jericho Medical laboratory in Jericho, Palestine

Abstract

Parasitological diagnosis of cutaneous leishmaniasis is imperative before treatment. In this study we compared the sensitivity of the diagnosis of Giemsa-stained skin scrapings by standardized graded direct microscopy with that of ITS1-PCR. Out of the 60 squares scanned for amastigotes using x100 oil- immersion light microscopy, 45 (75%) gave usable results. Fifteen (25%) squares could not be microscopically scanned. Of the 23 microscopy-positive squares, 20 (87%) were positive by PCR. Of the 22 squares negative for microscopy, 18 (82%) were ITS1-PCR positive. ITS1-PCR showed a sensitivity of 87% with positive predictive value of 100% and a specificity of 100% with negative predictive value of 85%.

In-vitro cultivation using NNN medium and direct smear microscopy of Giemsa-stained slides, PCR amplifying region 1 of internal transcribed spacer (ITS1) using skin scrapings spotted on filter papers (FP) and unstained tissue smears (US) were compared on the basis of three gold standards: WHO case definition, combined and clinical gold standard. PCR using US was more sensitive than all other methods using the 3 gold standards. Of the 298 cases of CL from FP, US and in-vitro culture tested by PCR-RFLP using HaeIII and MnlI, 181(60.7%) contained DNA of L. major, 106 (35.6%) DNA of L. tropica, while 11 (3.7%) of the FP remained unidentified.

Molecular epidemiology was used to study the distribution of Leishmania species in Jericho. Spatial analysis showed three statistically significant clusters of CL, one cluster for L. major (Auja-Fasayil villages) and two clusters for L. tropica, (Zubaidat village and Nabi-Musa Bedouin encampment) were recorded. In the case of space-time, four clusters were detected: Zubaidat village for four years, A’uja-Fasayil villages for one year, Nabi-Musa for three years and Nuaimeh village for one year. Clusters for L. major were noted in A’uja-Fasayil villages for one year and Nuaimeh village for three years. L. tropica clusters were in Zubaidat village for one year, Nabi-Musa for four years and Aqbat-Jaber refugee camp for one year.

Microsatellites, or simple sequence repeats (SSR), are very useful genetic markers for population genetic studies. Ten pairs of PCR primers, annealing to the unique flanking regions, were designed to amplify microsatellite loci identified in the genome sequence of L. major on chromosomes 1, 3, 5, 21 and 35. The microsatellite repeats are (CA)n, (AT)n, (GTG)n, and (GACA)n with varying lengths. A total of 106 strains isolated in different endemic regions of Central Asia, Middle East and Africa were analysed in this study. Analysis of genetic distance revealed the existence of 7 discrete populations of L. major including two genetically isolated populations in the Middle East. This was confirmed by a Bayesian model-based clustering approach that assigned the individual strains to the same number of populations.

Keywords: Cutaneous leishmaniasis, L. major, L. tropica, ITS1-PCR, Genetic diversity, Molecular epidemiology, Jericho-Palestine, Microsatellites

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Sensitivität des Nachweises von Leishmanien in Giemsa-gefärbten Bioptaten aus Hautulzerationen mittels direkter Mikroskopie mit der Sensitivität der ITS1-PCR verglichen. Bei der ITS1-PCR wurde eine Sensitivität von 87 % mit einem positiven predictive value von 100 %, sowie eine Spezifität von 100 % mit einem negativen predictive value von 85 % nachgewiesen.

Weiterhin wurden vier verschiedene Nachweismethoden miteinander verglichen: die in vitro Kultivierung in NNN Medium, die direkte Mikroskopie von Giemsa gefärbten Hautbioptaten, die PCR Amplifizierung der ITS1 Region aus auf Filterpapier aufgetragenen Hautbioptaten (FP) sowie die ITS1-PCR von ungefärbten Hautbioptaten (US). Die PCR der US erwies sich als die sensitivste Methode.

Die Verbreitung von Leishmanien Arten in Jericho wurde mittels molekularer Epidemiologie untersucht. Die räumliche (Spatial) Analyse zeigte drei statistisch relevante Cluster innerhalb der kutanen Leishmaniose (CL): ein Cluster mit L. major und zwei L. tropica Cluster. Bei der Raum-Zeit–Analyse wurden vier Cluster von Kutanen Leishmaniose, zwei L. major und drei L. tropica Cluster nachgewiesen.

Insgesamt 106 Stämme, die aus verschiedenen endemischen Regionen in Zentralasien, im Nahen Osten und Afrika stammen, wurden mit 10 Mikrosatellitenmarkern untersucht. Die Auswertung erfolgte über zwei Analysemethoden: die Distanz-basierte und die Modell-basierte Methode. Anhand der L. major Genomsequenz wurden PCR-Primer zur Amplifizierung von Mikrosatellitenloci von L. major entwickelt, die auf den Chromosomen 1, 3, 5, 21 und 35 liegen. Sieben unterschiedliche L. major Populationen einschließlich zweier genetisch isolierter Populationen im Nahen Osten wurden mit diesen Markern nachgewiesen.

Eigene Schlagworte: Kutane Leishmaniose, L. major, L. tropica, ITS1-PCR, genetische Diversität, molekulare Epidemiologie, Jericho-Palästina, Mikrosatelliten

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30.08.2006