3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1  Klone aus dem Kreuzungsprogramm der Genbank Obst Dresden-Pillnitz

↓26

Im Rahmen dieser Versuche wurden die benötigten Pflanzen im Februar 2000 ausgewählt. Hie r bei handelt es sich um insgesamt 13 Klone, wobei 5 Klone aus dem Inst i tut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben, Genbank Obst Dresden-Pillnitz für das Forschung s vorhaben genutzt wurden. Diese Klone sind Kreuzungen aus der Naumburg-Pillnitzer Birnenu n terlagenzüchtung von verschiedenen Pyrus -Arten und -sorten (Tab. 1). Die verwendeten Klone sind Selektionen von Mildenberger & Fischer aus dem in den 1960er Jahren begonnenen Kreuzungsprogramm. Die Klone Pi-Bu 2 und Pi-Bu 3 sind in den neu angelegten Bundesgemei n schaftsversuch für Birnenunte r lagen aufgenommen worden ( Fischer 2003).

↓27

Tab. 1:Verwendete Selektionen aus der Naumburg-Pillnitzer Birnenunterlagenzüchtung von Mildenberger & Fischer

Klon-bezeichnung

Wuchsstärke

Elternarten oder -sorten

Pi-Bu 2

mittel - schwach

Pyrus communis L. 'Clapps Liebling' x Pyrus cossonii Rehder

Pi-Bu 3

mittel - stark

Pyrus pyrifolia ( Burm. f.) Nakai (frei abgeblüht)

Pi-Bu 4

schwach

Pyrus cossonii Rehder (frei abgeblüht)

Pi-Bu 5

sehr schwach

Pyrus amygdaliformis Vill. x Pyrus pyrifolia ( Burm. f.) Nakai

Pi-Bu 6

mittel - stark

Pyrus bretschneideri Rehd . x Pyrus amygdaliformis Vill.

Für die Versuche wurden von diesen Klonen Stecklinge zur Bewurzelung gewonnen. Gleichzeitig erfolgte eine In-vitro-Etablierung dieser Klone mit Sprosssegmenten.

Zusätzlich wurde die Sorte 'Kirchensaller Mostbirne' als Standard verwendet. Im we i teren Text wird die Sorte 'Kirchensaller Mostbirne' mit 'KS' abgekürzt. Für die Salzve r suche wurden von dieser Sorte Sämlinge angezogen. Gleichzeitig erfolgte eine In-vitro-Etablierung dieser Sorte aus Sprosssegmenten vorgetriebener Containerpfla n zen aus dem Gewächshaus.

3.1.2  Selektierte adulte Pyrus -Wildformen vom natürlichen Standort

↓28

Auf einem extremen Trockenstandort im Naturpark „Märkische Schweiz“ in der Nähe von Mü n cheberg (Bundesland Brandenburg, Landkreis Märkisch-Oderland), ca. 50km östlich von Berlin, wurden 7 Klone ausgewählt. Diese Klone zeichnen sich am Selektionsort durch eine überdurc h schnittlich hohe Vitalität, ein hohes Lebensalter und eine gerade Schaftform aus (Abb.1 und 2).

Abb. 1:Ausgewählte Klone am Standort Müncheberg (M 1, M 10 und M 10 links; von links nach rechts)

Alle ausgewählten Bäume gehören zu Pyrus communis L. aggr. und bilden morphologisch varia b le Übergangsformen zwischen der Holz-Birne ( Pyrus pyraster ) und der Kultur-Birne ( Pyrus co m munis L.). Bei einem Exemplar wurde eine Veredlung verm u tet. Aus diesem Grund wurde neben der vermeintlichen Sorte auch die Unterlage in Form eines Wurzelaustriebes zusätzlich in die U n tersuchungen mit einbezogen. Diese beiden Klone werden im folgenden Text als „M 1 – Sorte“ bzw. „M 1 – Unterl a ge“ bzeichnet (Tab. 2).

↓29

Abb. 2:Ausgewählte Klone am Standort Müncheberg (M 17, M 19 und M 21; von links nach rechts)

Für die Versuche erfolgte von diesen Klonen eine Saatgutbeerntung, wovon Sämlinge angezogen wurden. Gleichzeitig wurde eine In-vitro-Etablierung dieser Klone mit Sprossspitzen durchg e führt.

Tab. 2:Selektierte Klone vom Standort Müncheberg (ausgewählte Merkmale)

Klon-Nr.

Höhe

in m

Stammdurch-messer in 1,3 m Höhe (in m)

Kronenform, Stellung und Astwinkel der Leitäste, Wuchsform

M 10

11,5

0,80

kugelig, Astwinkel spitz, Äste aufstrebend, dann bogig überhängend

M 17

10,0

0,63

kugelig, Astwinkel spitz, Leitäste aufstr e bend, dünnere Äste überhä n gend

M 19

9,5

0,77

flachkugelig, Äste waagerecht bis aufstr e bend

M 21

11,5

0,51

kugelig, Äste waagerecht bis leicht überhä n gend

M 10 links

7,5

0,26

kugelig, Astwinkel spitz, Äste aufstr e bend

M 1 Sorte

13,5

1,02

kugelig, Astwinkel spitz, Äste aufstr e bend

M 1 Unterlage

3,5

0,12

Astwinkel spitz, Äste aufstr e bend

↓30

Naturräumliche Gliederung und Bodenuntersuchungen am Standort

Die adulten Pyrus -Wildformen wurden im Naturpark Märkische Schweiz selektiert. Die natu r räumliche Haupteinheit ist die Ostbrandenburgische Platte. Der Naturpark Märkische Schweiz ist ein ungefähr 60 km nordöstlich von Berlin gelegenes, 205 km 2 umfasse n des Großschutzgebiet, das sich im Übergangsbereich vom südöstlichen Barnim zur Lebusplatte befindet. Auf den Grundm o ränenplateaus wird durch Ackerflächen mit großen Schlägen (40-150 ha), die vorwiegend konvent i onell bewirtschaftet werden (Kretschmer 1995), charakterisiert. Der unmittelbare Standort befindet sich an der südöstlichen Grenze der Barnimplatte, im Übergangsbereich zum Buckower Kessel- und H ü gelland.

Das Selektionsgebiet der ausgewählten Pyrus -Wildformen befindet sich ca. 9 km östlich der Stadt Strausberg und ca. 12 km nordwestlich der Stadt Müncheberg.

↓31

Der Feldgehölzstreifen, in dem die selektierten adulten Pyrus- Exemplare (M 10, M 17, M 19, M 21, M 10 links) wachsen, quert die Landstraße 34 zwischen den Dörfern Ruhl s dorf und Bollersdorf. Die Hecke ist schon 1863 auf einer Feldmanöverkarte als Heckens truktur erkennbar. In späteren Karte n ausgaben ist sie 1920 als Hecke und 1942 als Baumreihe, die die Gemeindegrenze markiert , eingetr a gen (Abb. 3).

Abb. 3:Kartenausschnitt des Untersuchungsgebietes um 1940

Der Einzelbaum M 1 ist das letzte Exemplar eines ehemals mit Bäumen bepflanzten alten Wirtschaft s weges , der 600 m hinter der Kreuzung der Landstraßen 34 und 35, von der L35 Richtung Waldsieversdorf nach links abzweigt. Er ist seit 1978 in der topografischen Karte als bemerkenswerter Einzelbaum an einem Nebenweg ve r zeichnet.

↓32

Geomorphologisch gesehen gehören die Hochflächen der Ostbrandenburgischen Platte zum älteren Jungmoränengebiet des Nordostdeutschen Tieflandes. Während der weic h selzeitlichen Vereisung vor 20.000 Jahren stieß das Inlandeis bis zur Brandenburger Ei s randlage vor und hinterließ nach dem Rückschmelzen die Grundmoränenplateaus der Ostbrandenburgischen Platte. Diese lehmigen Grundmoränen wurden vielfach von Sa n deraufschüttungen der von Nordwesten über Barnim- und Lebushochfläche verlaufenden jüngeren Frankfurter Staffel oder von Flugsand überprägt. Es en t standen Endmoränenhöhen, Täler und große Dünengebiete. Die Schmelzwasser der Pommerschen Ei s randlage schufen die Buckower Rinne, die im Stöbbertal über das Rote Luch verlaufend, Barnim- und Lebusplatte voneinander trennt.

Relative Niederschlagsarmut und überwiegend sandig bis sandig-lehmige Substrate prägten die B o denbildung, deren Hauptprozesse Verbraunung und Lessivierung sind. So entwickelten sich auf der eher sandigen Grundmoräne von Barnim- und Lebusplatte Fahlerden, Bänderparabraunerden und Bä n der-Braunerden. Auf lehmreicheren Sanden entlang der Frankfurter Staffel bildeten sich Braunerden, Pararendzinen, Regosole und Bänderparabraunerden. Die mittlere Ackerzahl in der Region beträgt 30, bei einer

We r tespanne von 15-37 der Gemeindemittel ( Scholz 1962, Dalchow 1995, Schatz 2000). Die Böden entwickelten sich über kalkreichen Geschiebemergeldecken (Kalkgehalt 10-20%), teilweise ist ihre Lag e rung gestört. Meist sind die Geschiebemergeldecken stark übersa n det. Sandige sickerwasserbestimmte Substrattypen mit Tieflehm herrschen fast überall vor. Schwach bis mäßig gebleichte Podsole, auch mäßig gebleichte Braunerden treten auf. Typisch ist die kleinräumige, sehr heterogene Verteilung einzelner Bodenformen mit der Hauptbodenart lehmiger Sand. Trotz einheitlicher Bewirtschaftung herrschen auf großen Schlägen meist sehr differenzierte Standortbedingungen (Kretschmer 1995).

↓33

Die Ostbrandenburgische Platte unterliegt dem Einfluss des Mecklenburgisch- Brandenburgischen Ü bergangsklimas ( Schatz 2000). In den Sommermonaten machen sich ozeanische Einflüsse stärker b e merkbar, im Winter kontinentale . Der östliche Teil des Barnims und der Lebusplatte, besonders deren höhere Lagen gehören zum kältesten Gebiet des Flachlandes und weisen eine starke Jahre s schwankung der Temperatur auf (Tab. 3).

Tab. 3:Klimakenngrößen des Untersuchungsstandortes (nach Schatz 2000)

 

Mecklenburgisch-Brandenburgisches Übe r gangsklima

Barnim-Platte

Buckower Kessel- und Hügellan d schaft

Jahresmittelt emperatur

 

7,5 - 8,5°C

7,5 - 8,5°C

Monatsmittel Juli

17,5 - 18,5 °C

17,5 - 18,5°C

17,5 - 18,0°C

Monatsmittel Januar

-1,5 - 0°C

-1,5 - 0°C

-1,5 - 0°C

Jährliche Niederschlagssu m men

490 - 590 mm

520 - 590 mm

510 - 570 mm

Die photometrische Bestimmung der Nährstoffgehalte und die Bestimmung der pH- Werte der verschiedenen Bodenproben aus 0-30 bzw. 30-60 cm Tiefe erbrachte folgende Ergebnisse in u n mittelbarer Nähe der selektierten Bäume (Tab. 4).

↓34

Tab. 4: Ergebnisse der Nährstoffanalysen in mg/100 g Boden

 

M 1

M 10

M 17

M 21

M 10 links

0-30 cm

     

Mg

-

2,31

2,29

2,22

-

NO3-N

0,43

0,81

0,80

0,44

0,9

K2O

21,28

15,03

10,29

11,11

10,11

P2O5

11,70

8,09

5,71

3,33

5,61

pH

4,82

3,85

3,80

4,09

4,25

30-60 cm

     

Mg

2,16

5,49

3,30

< 1,08

-

NO3-N

0,76

0,88

0,88

0,86

0,65

K2O

15,13

9,89

8,79

< 1,08

7,61

P2O5

9,73

8,79

8,79

5,40

5,43

pH

4,31

3,98

4,0

4,36

4,22

Mit zunehmender Tiefe nehmen größtenteils die Gehalte an Mg, NO 3 -N und P 2 O 5 zu. Im Gege n satz dazu nehmen die Gehalte von K 2 O mit zunehmender Tiefe ab.

Auffällig sind die niedrigen pH-Werte zwischen 3,8 und 4,82, die denen von Podsolen entspr e chen. Für das Untersuchungsgebiet Buckower Kessel- und Hügelland werden schwach bis mäßig gebleichte Podsole als Bodenform angegeben ( Scholz 1962).

↓35

Da nur der Nitratstickstoffgehalt ermittelt wurde, der NH 4 -Anteil und der organischer Stic k stoff in Form von Huminstoffen, Vegetationsrückständen, lebender und abgestorbener Biomasse unberüc k sichtigt blieb, ist die Versorgung mit Stickstoff schwierig zu bewe r ten. Die höheren NO 3 -N Gehalte in 30 bis 60 cm Tiefe sind durch Verlagerung mit dem Sickerwasser der Wi n terniederschläge erklärbar.

Der Vergleich der gemessenen Nährstoffgehalte mit den Werten der Phosphorversorgung von B ö den nach Alt (in Krüssmann 1997) ergibt eine mittlere Phosphorversorgung.

Die Kaliumgehalte sind gleichmäßiger verteilt, sie entsprechen überwiegend einem mittleren Versorgung s grad.

↓36

Die Gehalte an Magnesium entsprechen an allen Standorten einem niedrigen Versorgung s grad

Die Variabilität der Bodenarten besonders in 60 bis 90 cm Tiefe (in die Nährstoffanalysen nicht mit einb e zogen) entspricht den Angaben von Kretschmer (1995), wonach große Heter o genität der Bodenformen auf kleinstem Raum mit der Hauptbodenart lehmiger Sand typisch für das Buckower Kessel- und Hüge l land ist.

3.2 Methoden

3.2.1  In-vitro-Methoden zur Regeneration

Etablierung

↓37

Die Explantate wurden von Februar bis Mai 2000 entnommen. Die Sprosse wurden auf ca. 1 cm Länge geschnitten und für eine Stunde unter fließendem Wasser gere i nigt und anschließend in 0,2%igem Quecksilberchlorid, unter Zusatz von zwei Tropfen Tween 20 für 3 min desinfiziert. Danach wurden die Explantate dreimal mit sterilem destilliertem Wasser nachgespült und die desinfizierten Explantate auf einem Medium nach Murashige & Skoog (1962) zur Regenerat i on aufgesetzt.

Vermehrung

Für die Medienoptimierung wurde die ‘KS’ ausgewählt. Die Grundlage bildete jeweils das Basi s medium nach Murashige & Skoog (1962) (Tab. 5). Es wurden 7 Nährm e dienvarianten (VM 1, VM 20, VM 36, VM 37, VM 38, VM 39 und VM 40), die sich in der Hormon- und BAP-Konzentration unterschieden, erarbeitet. Alle Medien enthielten 30 g/l Saccharose, 8 g/l Agar. Der pH-Wert wurde auf 5,8 eingestellt. Eine Ausnahme bildete VM 40, hier wurde die Konzen t ration der Makro- und Mikronährstoffe halbiert. VM 1, VM 20, VM 37 und VM 40 beinhalteten 1 mg/l BAP, VM 36 2,5 mg/l BAP. Die Medien von VM 1 und VM 20 enthielten 0,001 mg/l IES. NES mit 1 ml/l wurde nur im Med i um VM 38 verwendet.

↓38

Tab. 5:Zusammensetzung des MS-Grundmediums nach Murashige & Skoog (1962)

Bestandteil

Menge

   

Makrostammlösung

NH 4 NO 3

KNO 3

CaCl 2 x H 2 O

MgSO 4

KH 2 PO 4

16,5 g/l

19,0 g/l

4,4 g/l

1,8 g/l

1,7 g/l

100 ml/l

 

Mikrostammlösung

ZnSO 4 x 4 H 2 O

H 3 BO 3

MnSO 4 x H 2 O

KJ

Na 2 MoO x H 2 O

CuSO 4 x 5 H 2 O

CoCl 2 x 6 H 2 O

0,62 g/l

0,86 g/l

2,23 g/l

0,083 g/l

0,025 g/l

0,0025 g/l

0,0025 g/l

10 ml/l

 

Eisen

Na 2 EDTA x 2 H 2 O

FeSO 4 x 7H 2 O

7,45 g/l

5,57 g/l

5 ml/l

 

Myo-inositol

100 mg/l

   

Thiamin-HCl

0,1 ml/l

   

Pyridoxin-HCl

0,5 ml/l

   

Nicotinic

0,5 ml/l

   

Biotin

0,2 ml/l

   

Die erfolgreich etablierten Sprosse wurden zur Vermehrung auf das modifizierte MS-Medium aufgesetzt. 15 Explantate je Variante dienten als Versuchsmaterial. Als Ku l turgefäße dienten 150 ml Erlenmeyerkolben. Je Kolben wurden 6 Sprosse mit einer Länge von 20 bis 25 mm angesetzt. Je Subkultur wurde die durchschnittliche Anzahl gebildeter Sprosse in Abhängigkeit vom ve r wendeten Medium ermittelt. Eine Subkultur dauerte zuerst 4 Wochen, wurde aber ab der 2. Su b kultur auf 6 Wochen verlängert. Nach dieser Zeit erfolgte ein Umsetzen auf ein frisches Nährm e dium. Im

Wachstum s raum wurden die Kulturen bei Weißlicht (Leuchtstofflampen- neutralweiß), einem 16/8 Tag-Nacht Rhythmus und 22°C ±2 K zur Vermehrung angeregt (Abb. 4).

↓39

Abb. 4:Sprossvermehrung der Klone im Wachstumsraum

Für die Versuche zur Prüfung auf Salztoleranz wurde die Anzahl der Klone reduziert und nur noch mit 5 Klonen in vitro weitergearbeitet. Es wurden die Klone ausgewählt, die in vitro die höchsten Vermehrungsraten zeigten. Von den Klonen aus Müncheberg wurden Baum M 1 (Sorte) und M 21, aus Dresden-Pillnitz Pi-Bu 2 und Pi-Bu 3 sowie die 'KS' ausgewählt.

Bewurzelung

↓40

Die letzte Subkultur erfolgte für 6 Wochen unter gleich bleibenden Kulturbedingungen im Wachstumsraum auf 4 verschiedenen Bewurzelungsmedien (BM 14 bis BM 17). Je Medium wu r den 10 Erlenmeyer -kolben mit 6 Sprossen mit einer Länge von 20 bis 30 mm angesetzt. Die B e wurzelungsmedien waren modifiziert nach ( Murashige & Skoog 1962). Die Medien enthielten im Gegensatz zum verwendeten Vermehrungsmedium nur die halbe Konzentration an Makr o nährstoffen und Saccharose. Die Medien unte r schieden sich nur in ihrer Konzentration an Indol-3-Buttersäure (IBS). Das Medium BM 14 war frei von IBS, bei BM 15 wurden 1 mg/l, bei BM 16 wurden 2 mg/l und bei BM 17 wurden 3 mg/l dem Medium zugesetzt.

Nach 6 Wochen wurden die Sprosse aus den Kulturgefäßen entnommen. Die Anzahl bewurzelter Sprosse und die Anzahl gebildeter Wurzeln je Spross wurden gezählt.

↓41

Akklimatisierung im Gewächshaus

Die bewurzelten und noch nicht bewurzelten Sprosse wurden Ende März 2002 in Jiffy-7-Torfquelltöpfe pikiert. Das Aufquellen der Jiffy-7-Pots erfolgte mit destilliertem Wa s ser. Dabei wurden die Torfquelltöpfe nur mit 70% ihrer maximalen Saugfähigkeit (35 ml pro Jiffy-7) aufg e quollen. Nach dem Auspflanzen der Sprosse wurden die Jiffy-7 Torfquelltöpfe in Pikierkisten (50 x 32 x 6 cm) mit Abdeckhaube gestellt. In die ca. 1 cm breiten Lücken zwischen den Torfquelltö p fen wurde Torfmoos ( Sphagnum spec. ) gelegt. Die Temperatur in den Pikierkisten betrug 22°C ± 2 K.

Nach dem Anwachsen der Pflanzen ohne weiteres zusätzliches Wässern erfolgte nach 4 bis 6 W o chen die allmähliche Abhärtung durch eine schrittweise Reduzierung der Luf t feuchte (Abb. 5).

↓42

Abb. 5:Akklimatisation von Klon M 1 (links) und Klon Pi-Bu 3 in Jiffy-7-Pots

Ende Mai 2002 wurden die akklimatisierten Sprosse in ein Grundbeet unter einem F o lientunnel aufgepflanzt. Vorher wurde die Akklimatisationsrate (Prozentsatz überlebender Pflänzchen) e r fasst.

Nach einer 4-monatigen Kultur im Grundbeet wurde der Sprosszuwachs der Klone in Abhängi g keit vom ursprünglichen Bewurzelungsmedium gemessen. Anfang Nove m ber 2002 wurden die Pflanzen gerodet und für weitere Salzbelastungsversuche ex v i tro in Mitscherlichgefäße getopft.

3.2.2  NaCl–Behandlung in vitro

↓43

Ein NaCl-Steigerungsversuch wurde angelegt, um die Salzverträglichkeit der Pyrus -Klone zu e r mitteln. 5 Klone dienten dabei als Versuchspflanzen:

Müncheberg

M 21

Müncheberg

M 1 (Sorte)

Dresden-Pillnitz

Pi-Bu 2

Dresden-Pillnitz

Pi-Bu 3

Kirchensaller Mostbirne

'KS'

Im ersten Versuch der drei In-vitro-Versuche musste auf M 1 (Sorte) und 'KS' verzic h tet werden, weil das Versuchsmaterial dieser Klone nicht au s reichte.

↓44

Die Versuche dauerten jeweils 6 Monate. Als Grundmedium für die Versuche wurde VM 1 eingesetzt. Bei allen Versuchen betrug der Stichprobenumfang 50 Explantate je Variante (Tab. 6).

Es wurden folgende Bonituren durchgeführt:

↓45

Tab. 6:Versuchszeitraum und NaCl-Behandlungsstufen der In-vitro-Versuche

Versuchsbeginn

Versuchsende

Steigerungsstufen in mM NaCl

Juni 2001

November 2001

25, 50, 100, 200

Februar 2002

August 2002

50, 75, 100

Februar 2003

August 2003

25, 50

3.2.3  NaCl-Behandlung in vivo

Die je 3 Versuche erfolgten in der Klimakammer und im Gewächshaus.

NaCl-Behandlung in der Klimakammer

↓46

Versuchsbedingungen: Die Klimakammern wurden jeweils auf einen 12-h-Tag pr o grammiert. Es wurde eine Beleuchtungsstärke von 10 klx eingestellt. Die Temperat u ren betrugen 20°C am Tag und 15°C in der Nacht, die Luftfeuchtigkeit 70% am Tag und 80% in der Nacht (Abb. 6). Im Versuchsjahr 2003 wurde von einer Variante bei Klon M 21 (in vitro vermehrt) die Temperatur im Versuchsverlauf gesteigert und die Luftfeuchtigkeit reduziert (Tab. 7). Diese Variante wird im fogenden Text mit „HT“ (h ö here Temperatur) bezeichnet.

Tab. 7:Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Klimakammer 2003 bei M 21 (in vitro vermehrt)

 

1. bis 4. Woche

5. bis 8. Woche

9. bis 10. Woche

Temperatur

25°C am Tag

20°C in der Nacht

30°C am Tag

25°C in der Nacht

32°C am Tag

25°C in der Nacht

Luftfeuchtigkeit

65% am Tag

80% in der Nacht

60% am Tag

75% in der Nacht

55% am Tag

75% in der Nacht

Abb. 6:Klon M 21 zum Versuchsbeginn in der Klimakammer 2002

↓47

Es wurden 3 l Töpfe verwendet. Als Substrat wurde Einheitserde Typ T der Fa. Hagera, mit 70% Torf (mittlere Struktur), 30% Ton, pH 5,7, Düngungstyp hoch, eing e setzt. Dem Substrat wurden 10% Perlite beigemischt. Die Pflanzen wurden je nach Bewässerungsbedarf mit 25-100 ml NaCl-Lösung der jeweiligen Konzentrationen jeden zweiten Tag bewässert (Tab. 8). Die Ve r suchsdauer betrug jeweils 10 Wochen. Auf eine Behandlung mit 600 bzw. 400 mM NaCl wurde in den Versuchen 2 und 3 verzichtet, da bei diesen hohen Konzentrationen die Letalitätsgrenzen e r reicht wu r den.

Tab. 8:Verwendete Klone und NaCl-Stufen für die Versuche in der Klimakammer

Versuche

Zeitpunkt

Steigerungsstufen in mM NaCl

Verwendete Klone

Versuch 1

15.05.2001 -

31.07.2001

100, 200, 400, 600

’KS’ (Sämlinge)

Versuch 2

26.04.2002 -

08.07.2002

100, 200, 300, 400

’KS’ (Sämlinge )

M 21 (Sämlinge)

Versuch 3

10.04.2003 -

01.07.2003

100, 200, 300

‘KS’ (Sämlinge)

M 21 (Sämlinge)

M 21 (in vitro vermehrt)

M 21 (in vitro vermehrt, HT)

NaCl Behandlung im Gewächshaus

↓48

Die Pflanzen wurden im Foliengewächshaus in 5 l Mitscherlichgefäßen kultiviert. Das Gewäch s haus wurde schattiert und an den beiden Längsseiten geöffnet. Als Substrat wurde gleichermaßen wie in der Klimakammer die Einheitserde Typ T verwendet. Die Pflanzen wurden je nach Bewä s serungsbedarf mit 100-200 ml NaCl-Lösung der jewe i ligen Konzentrationen jeden zweiten Tag bewässert (Abb.7). Der erste Versuch hatte eine Dauer von 14 Wochen, die beiden folgenden Ve r suche hatten eine Dauer von 10 Wochen (Tab. 9). Auf eine Behandlung mit 600 bzw. 400 mM NaCl wurde in den Versuchen 2 und 3 verzichtet, da bei diesen hohen Konzentrationen die Letal i tätsgrenzen erreicht wurden.

Abb. 7:Gefäßversuch im Gewächshaus 2001

Tab. 9: Verwendete Klone und NaCl-Stufen für die Versuche im Gewächshaus

Versuche

Zeitpunkt

Steigerungsstufen in mM NaCl

Verwendete Klone

Versuch 1

03.08.2001 -

21.11.2001

100, 200, 400, 600

’KS’ (Sämlinge)

M 21 (Sämlinge)

M 17 (Sämlinge)

M 10 links (Sämlinge)

Pi-Bu 3 (Stecklinge)

Pi-Bu 4 (Stecklinge)

Versuch 2

07.06.2002 -

23.08.2002

100, 200, 300, 400

‘KS’ (Sämlinge)

M 21 (Sämlinge)

M 10 (Sämlinge)

Pi-Bu 2 (Stecklinge)

Pi-Bu 4 (Stecklinge)

Pi-Bu 6 (Stecklinge)

Versuch 3

03.06.2003 -

13.08.2003

100, 200, 300

’KS’ (in vitro vermehrt)

M 21 (Sämlinge)

M 1 Sorte (in vitro ve r mehrt)

Pi-Bu 2 (in vitro vermehrt)

↓49

Salzstressbonitur in vivo

Die Kontrolle der Blattschädigungen erfolgte ab Behandlungsbeginn sowohl in den Klimaka m mern als auch im Gewächshaus im Abstand von 7 Tagen. Dabei wurden die Trieblängen der Pflanzen gemessen (Versuchsanfang und -ende). Außerdem wurden die nekrotischen Blätter e r fasst.

Analog zu den In-vitro-Versuchen wurde wiederum eine Toleranz- und Letalitätsgre n ze definiert. Die Toleranzgrenze liegt bei einem Anteil von bis zu 50%, die Letalität s grenze bei einem Anteil von über 80% abgestorbener Blätter.

↓50

Analyse des Chloridgehaltes

Die Natrium- und Chloridgehalte wurden in den Blättern, Wurzeln, Wurzelhälsen, Sprossen und Sprossspitzen bestimmt. Um die Chloridverteilung als einen möglichen Hinweis auf die Salzve r träglichkeit von Pyrus zu nutzen, wurde der Chloridgehalt in den o.g. Pflanzenteilen analysiert. Die Proben wurden 24 Stunden bei 105°C getroc k net. Dann wurden die Proben gemahlen. 1 g wurde zur Analyse eingewogen und in 50 ml destilliertes Wasser eingerührt. Die Proben wurden für eine Stunde in einem Schüttelwa s serbad mit 100°C erhitzt und anschließend zentrifugiert. Die Chloridme s sung erfolgte mit dem Eppendorf -Chloridmeter. Zur Analyse wurde die Elektrolytl ö sung des Herstellers verwendet (7,5 ml Essigsalpetersäurelösung und 0,5 ml Gelat i nelösung).

Analyse des Natriumgehaltes

↓51

Um auch die Natriumverteilung als einen möglichen Hinweis auf die Salzverträglichkeit von P y rus zu nutzen, wurde der Natriumgehalt in den o.g. Pflanzenteilen anal y siert. Die Proben wurden 24 Stunden bei 105°C getrocknet, danach gemahlen. 0,5 g der gemahlenen Proben wurden mit H 2 SO 4 und H 2 O 2 oxidiert. Die Natriummessung erfolgte mit dem Flammphotometer.

3.2.4  Bodenuntersuchungen

Am Selektionsort der Müncheberger Klone wurden Bodenuntersuchungen durchgeführt. Die Bodenproben wurden im Frühjahr 2002 mit Hilfe eines Probestechers entnommen. Drei En t nahmenstellen befanden sich am Anfang, in der Mitte und am Ende des Heckenabschnittes in d e nen die Pyrus -Exemplare M 10, M 17, M 19 und M 21 stehen. Weitere zwei Beprobungen wurden direkt bei den Bäumen M 1 Sorte und M 10 links vorgenommen, mit jeweils drei Einzelproben in den Bodentiefen 0-30, 30-60 und 60-90 cm. Im Labor wurden die Nährstoffgehalte (N, P, K, Mg) und der pH-Wert der Pr o ben ermittelt.

3.2.5  Morphologische und genetische Untersuchungen zur Charakterisierung der selektierten Müncheberger Klone

Die Erfassung der Merkmale von Baumhabitus, Blättern und Früchten erfolgte zur Untersche i dung und Identifizierung der selektierten Klone (Tab. 10). Von jedem Exem p lar wurden jeweils 50 Blätter und Früchte für die morhologische Charakterisierung entno m men.

↓52

Tab. 10:Erfasste morphologische und phänologische Merkmale

Merkmale

Bemerkungen

Habitus

Form der Krone

Stellung und Astwinkel der Leitäste

Dornigkeit der Zweige

Wuchsform

Stammumfang in 1,3 m Höhe

Blattmerkmale

Blattform

Blattgröße (Spreitenlänge und Spreitenbreite)

Blattstiellänge

Verhältnis aus Spreitenlänge / Spreitenbreite

Verhältnis aus Blattstiellänge / Spreitenlänge

Fruchtmerkmale

Frucht (Form, Höhe, Breite, Lage der breitesten Stelle, Verhältnis aus Fruchthöhe / Fruchtbreite, Reifezeit, Geschmack, Steinzellen, Samengröße und -form)

Fruchstiel (Form, Position, Länge, Durchmesser)

Kelch (Lage und Ausprägung der Kelchblätter an der reifen Frucht)

Fruchtschale (Farbe und Berostung)

Blattaustrieb

Blätter geschoben, beginnende Blattentfaltung, vol l ständige Blattentfaltung

Blüte

Blühbeginn, Vollblüte, Blühende

Um die Verschiedenheit der ausgewählten Klone auf genetischer Ebene nachzuwe i sen, wurden Untersuchungen in Form von Isoenzymanalysen (Stärkegel-Elektrophorese) an insgesamt 23 au s gewählten Pyrus -Exemplaren aus den Hecke n systemen des Selektionsstandortes Müncheberg und der Referenzsorte 'KS' durchg e führt. Gleichzeitig sollte der Nachweis erbracht werden, dass es sich bei M 1 (Sorte bzw. Unterlage) um eine Sorten-Unterlagen-Kombination handelt. Diese U n tersuchungen wurden am Fachgebiet Forstgenetik, Arbeitsgruppe Müller - Starck, der Techn i schen Universität München durchgeführt. In Vorversuchen fanden Tests von ca. 20 Enzymsyst e men auf ihre Eignung zur Ermittlung ihrer genetischen Variation an Knospen statt. Für die Ch a rakterisierung wurden 11 Enzymsysteme ausgewählt.

Diese kodieren bei der Gattung Pyrus mindestens 17 polymorphe Genloci (Tab. 11). Die method i schen Grundlagen der Stärkegel-Elektrophorese, einschließlich der Herste l lung und Anfärbung der Gele, beziehen sich auf Angaben von Bergmann et al. (1993), Kim (1979 und 1985), Müller - Starck (1985), Murphy et al. (1996), Smithies (1955), Yeh & O´Malley (1980) und Zander (2000).

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Tab. 11:Untersuchte Enzymsysteme

Enzymsysteme

Abkürzung

Aspartataminopeptidase

AAP

Aspartataminotransferase

AAT

Aconitase

ACO

Alkoholdehydrogenase

ADH

Isocitratdehydrogenase

IDH

Leucin-Aminopeptidase

LAP

Malatdehydrogenase

MDH

6-Phosphoglucomutase

6PGDH

Phosphoglucoseisomerase

PGI

Phosphoglucomutase

PGM

Shikimatdehydrogenase

SKDH

Die Grundlage der Stärkegel-Elektrophorese bildet ein Gel, bestehend aus Stärke, Saccharose und Gelpuffer. Aus Knospen und Rinde wurde ein Enzymrohextrakt gewonnen, der in Extrakt i onspuffer homogenisiert wurde. An die Aufbringung der Proben auf das Gel schloss sich die L a gerung auf der Kühlplatte der Elektrophoresekammer an. Über Pufferbrücken wurde eine Ve r bindung mit den Elektrodenpuffern der Ka m merwannen hergestellt. Nach dem Anschluss an eine Gleichstromquelle erfolgte die elektrophoresische Trennung bei gleich bleibender Stromstärke, ansteigender Stromspannung und konstanter Temperatur. Nach dem Trennvorgang wurde die e n zymatische Aktivität sich t bar gemacht.

Dazu wurden die Gelscheiben, je nach zu untersuchendem Enzymsystem, mit speziellen Färbelösungen behandelt. Durch die chemische Reaktion wurden die Enzymmuster (Zymogramme) sichtbar.

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Im Anschluss an die Fixierung der angefärbten Gele erfolgte die Auswertung der Z y mogramme. Hierfür wurden die Zonen eines Enzymsystems mit Großbuchstaben bezeichnet, wobei die Zone der höchsten Mobilität das „A" erhielt, die nächste „B" und so fort. Die Anzahl der gebildeten Banden hängt von der Menge der Polypeptide ab, aus denen das jeweilige Enzym besteht. Das am schnellsten wandernde Allel (Bande) wurde mit „1" nummeriert, homozygote Allele durch Verdopplung der Nummer ang e zeigt, heterozygote Allele durch entsprechende Nummernkombinationen (Zander 2000).

Ziel war es, die genetische Heterozygotie bzw. den individuellen Heterozygotiegrad zu bestimmen, um Aussagen über die genetische Ähnlichkeit und das Verwandschaft s verhältnis der Pyrus -Exemplare treffen zu können.

3.2.6  Statistische Methoden

Bei allen Auswertungen wurden die Mittelwerte mit der Varianzanalyse und dem paarweise mu l tiplen Vergleichstest auf signifikante Unterschiede (α = 0,05) unter Verwendung des Statistikpr o gramms SPSS für Windows geprüft. Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden durch Buchstaben gekennzeichnet. Mittelwerte, die mit gleichen Buchstaben beschriftet sind, unte r scheiden sich nicht. Die Graphiken wurden unter Verwendung von Microsoft Excel 2000 erstellt.


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19.05.2005