5. Summary

In Israel and the West Bank, three species of Leishmania are prevalent: L.major, L.tropica and L.donovani infantum ( L.d.infantum ). Cutaneous leishmaniasis (CL) is mostly caused by L.major in the Negev and the Jordan Valley. Its ecoepidemiology has been studied thoroughly in the past. CL due to L.tropica is more sporadic, but new foci have been emerging in recent years in the northern, more hilly parts of the country. The epidemiology is only poorly understood because only very few of the L.tropica foci within Israeli territory have been investigated so far. Only few data are available on L.tropica foci within the West Bank. The transmission is highly suspected to be zoonotic, but the reservoir animal species has not been identified yet. Since L. tropica infections may visceralize or become chronic (lupoid leishmaniasis) they need to be distinguished from L.major infections. Any emerging focus of CL therefore requires species specific identification.

L.d.infantum causes visceral leishmaniasis (VL) in humans and in canids in Israel and the West Bank. Human disease is mostly seen in infants in the West Bank (Jenin district). It is not frequently diagnosed but it poses a serious life threat, and outbreaks are theoretically possible at any time. In Israel, the disease predominantly affects dogs. Canine visceral leishmaniasis (CVL) is diagnosed more frequently than ever before in the country. It is an emerging disease, which is spreading in central Israel and is also a potential danger for humans. In the northern West Bank, L.tropica and L.d.infantum foci are overlapping. Since strains of L.tropica were reported to visceralize and L.d.infantum strains may be dermatotropic, it is obvious that the differentiation of the two species would be of clinical and epidemiological importance.

Apart from the endemic forms of leishmaniasis, imported forms, especially from the New World, are occasionally seen in Israel. Many young Israelis travel to Central and South America, and a few of them contract CL every year. Species-specific diagnosis is of great importance especially in these patients since only L.braziliensis infections require hospitalization and intravenous therapy with antimonal drugs.

The aim of this work was to establish field applicable methods for the diagnosis of leishmaniasis directly from clinical material. Furthermore, it was important to introduce species-specific diagnosis for the above-named reasons. Apart from improved diagnosis of patients, screening methods for epidemiological studies were needed. Dermal scrapings were collected from cutaneous lesions of patients and of rodents. The samples were preserved on sterile filter paper. Several DNA extraction methods were compared, ranging from thorough to crude purification. Apart from dermal scrapings, various other clinical specimens were successfully proceeded [page 108↓] (Giemsa stained smears and paraffin embedded biopsies). This showed that Giemsa stained smears and paraffin embedded biopsies are suitable for retrospective studies, if required. For skin scrapings from desert rodents, the chelex-extraction yielded excellent results. For the screening of many samples, the work can be facilitated to a great extent by using chelex-extraction instead of the phenol-chloroform or the guanidine extraction method. It was found that samples with a relatively high tissue and a low blood content yielded excellent results with the chelex method. If samples were bloody, the phenol-chloroform extraction was superior. Furthermore it was shown that inhibition of the PCR by interfering factors (predominantly hemoglobin) could be circumvented by using additives in the PCR, such as bovine serum albumin (BSA), formamide and dimethoxysulfoxid (DMSO). The DNA was subjected to different polymerase chain reactions (PCR), which targeted the kinetoplast minicircle DNA (kDNA) and later also another region, the intergenic transcribed spacer (ITS-1) within the ribosomal operon. The study primarily focused on primers Uni21/Lmj4, which amplified whole kDNA minicircles of the Old World species of Leishmania . These primers had never been tested systematically and the sensitivity was not known. L.tropica/L.infantum and L.major infections were distinguished by species-specific sizes of the minicircles. This PCR method was useful for the direct diagnosis of cutaneous leishmaniasis in individuals, but was not reliable enough to be employed for routine diagnosis. The genus-specific kDNA primer pair 13A/13B, which amplifies a conserved sequence of 120 bp, was highly sensitive and was successfully employed as a screening method in humans and in reservoir animals. Primers MP3H/MPL1 amplified a 70 bp sequence specific for the L.braziliensis complex. L.braziliensis infections were diagnosed in 7 patients using these primers. The course of the disease was monitored by PCR over several months. Only recently has species-specific diagnosis by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the amplified ITS-1 region (~300 bp) been published (El Tai et al ., 2000) and was adopted in our laboratory. It provided sensitive and species-specific diagnosis of both the Old World and New World species, and therefore covered all the requirements simultaneously.

During the study, a new focus of L.tropica was identified in the West Bank, in Wadi Albethan, a village east of Nablus. A survey of desert rodents trapped in the Negev revealed a new rodent species ( Gerbillus dasyarus ) as a possible host for Leishmania parasites. The diagnosis of L.braziliensis infections was achieved for the first time in the country. Species-specific diagnosis directly from clinical samples is now available in Israel. The methods are ready to be introduced in other laboratories in the country or elsewhere, and have been adapted for possible routine use in clinical laboratories. They are suitable for diagnosis as well as for epidemiological studies.


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Zusammenfassung

Die Leischmaniose ist endemisch in Israel und in den palästinensischen Gebieten (West Bank). Drei Arten von Leishmanien kommen in Israel vor, L.major, L.tropica und L.donovani infantum (L.d.infantum), welche im wesentlichen zwei Krankheitsbilder verursachen: Die kutane Leischmaniose, oder auch Orientbeule, wird überwiegend von L.major verursacht, und eher seltener, jedoch in zunehmendem Maße auch von L.tropica. Die viszerale Leischmaniose, oder auch Kala Azar, wird in Israel von L.d.infantum hervorgerufen.

Die Epidemiologie von L.major, der häufigsten und auch harmlosesten Spezies im Land, ist weitgehend erforscht. L.major ist vor allem in den Wüstengegenden des Landes verbreitet (Negev, Arava), im besonderen auch in Jericho („Jerichobeule“) und im Jordantal. L.major kommt als eine Zoonose vor, Wüstennagetiere wie z. B. die fette Sandratte (Psammomys obesus) dienen als Reservoir. L.tropica ist vergleichsweise wenig erforscht. Diese Spezies kommt eher sporadisch im nördlichen, höher gelegenen Teil des Landes vor (Galiläa, Samaria, Westjordanland). Immer wieder sind in den letzten Jahren neue Ausbrüche aufgetreten, von denen die meisten noch wenig erforscht, geschweige denn mit Sicherheit identifiziert worden sind (vor allem im Westjordanland). Es wird angenommen, daß es sich auch bei den L.tropica Infektionen um eine Zoonose handelt (im Unterschied zur bekannten Anthroponose bei L.tropica in den größeren Städten des Nahen Ostens), jedoch ist das tierische Reservoir bislang nicht bekannt. Da L.tropica Infektionen insgesamt schwerwiegender sind, in seltenen Fällen auch zu einer viszeralen Manifestation, oder auch in eine chronische, lupoide Form führen können, müssen sie von L.major Infektionen differenziert werden. Insbesondere ist es wichtig, daß neu auftretende Foci spezies-spezifisch identifiziert werden.

Die viszerale Leischmaniose ist ebenfalls ein ernstzunehmendes Problem im Land: Die Erkrankung ist tödlich, wenn sie nicht rechtzeitig diagnostiziert und therapiert wird. Vor allem sind Kleinkinder im nördlichen Westjordanland betroffen. Die Inzidenz ist nicht hoch, jedoch gibt es offensichtlich einen funktionierenden Infektionszyklus, der die Voraussetzung ist für mögliche Ausbrüche der Erkrankung in der Zukunft. In Israel sind bislang nur sehr wenige Fälle von Kala Azar aufgetreten, doch ist in den letzten Jahren deutlich geworden, daß die viszerale Leischmaniose bei Hunden weit verbreitet ist und daher auch für den Menschen eine potenzielle Gefahr besteht. Da das klinische Bild nicht eindeutig auf den Errerger hinweist (L.d.infantum kann sich in seltenen Fällen kutan, und L.tropica kann sich viszeral manifestieren), ist auch hier eine spezies-spezifische Diagnostik geboten.

Neben den endemischen Formen der Leishmaniose kommen mit zunehmender Häufigkeit auch eingeschleppte Leishmaniosen aus Zentral- und Südamerika vor. Es ist üblich, daß junge Israelis [page 110↓]nach ihrer Entlassung aus der Armee für einige Monate reisen (als Rucksacktouristen). Mit besonderer Häufung werden Infektionen aus dem bolivianischen Regenwald (L.braziliensis) beobachtet. Da die Infektionen durch L.braziliensis mit einem besonderen Risiko verbunden sind (mögliche spätere mukokutane Leischmaniose, Espundia), müssen diese Patienten für drei Wochen systemisch mit Pentostam behandelt werden (wie bei Kala Azar). Dies ist selbstverständlich mit hohen Kosten verbunden (Hospitalisierung), außerdem ist die Therapie nebenwirkungsreich. Bislang wurden alle Reiserückkehrer aus Amerika, bei denen eine kutane Leischmaniose aufgetreten war, ohne eine spezies-spezifische Diagnostik vorsichtshalber therapiert.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine sensitive und spezies-spezifische PCR Diagnostik der Leishmaniose im Land zu etablieren. Neben einer verbesserten Diagnostik bei Patienten war es wichtig, auch Methoden für epidemiologische Studien (z.B. screening von Reservoirtieren) zur Verfügung zu stellen. Für die PCR-Diagnostik wurden vor allem Wundabstriche aus Läsionen (von Patienten und auch Tieren) mithilfe einer sterilen, chirurgischen Klinge gewonnen und auf Filterpapier konserviert. Daneben wurden auch andere Proben bearbeitet und für ihre Eignung zur PCR-Diagnostik geprüft, z. B. Giemsa gefärbte Abstriche, Paraffin eingebettete Biopsien (für eventuelle retrospektive Studien in der Zukunft). Auch wurde peripheres Blut von erkrankten Hunden untersucht (1 Tropfen auf Filterpapier), um gleichzeitig auch die Diagnostik der viszeralen Leischmaniose voranzutreiben.

Um die Diagnostik zu vereinfachen (Anpassung für ein nicht forschungsorientiertes Labor), wurden verschiedene Extraktionsmethoden ausprobiert und ihre Eigenschaften näher untersucht. Alle getesteten Methoden (Phenol-Chloroform, Guanidin, Chelex, „Crude“) waren erfolgreich, d.h. PCR-Resultate wurden direkt von klinischem Material gewonnen. Interessanterweise wurden gerade mit einer sehr einfachen und schnellen Methode (Chelex) exzellente Resultate erzielt (28 von 30 Psammomys-Ohr-Proben waren positiv). In diesem Falle waren jedoch auch die Proben ideal (überwiegend Gewebe und wenig blutig). In anderen Fällen zeigte sich, daß PCR-Inhibition ein wesentliches Problem sein kann und daher differenziert werden muß, welche Proben einer gründlichen Aufreinigung bedürfen (Phenol-Chloroform-Extraktion). Es wurden Versuche unternommen, die PCR-Hemmung zu verhindern, indem zusätzliche Substanzen der Reaktion beigefügt wurden (Bovines Serumalbumin, Dimethylsulfoxid, Formamid). Dadurch konnten störende Substanzen, wie z.B. Hämoglobin, tatsächlich effektiv abgefangen werden, sodaß dann die PCR-Reaktionen auch bei grob zubereiteten Proben (z.B. nur Proteinase-K-Verdau plus Lyse) durchaus möglich war.


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Für die PCR wurden verschiedene Oligonukleotid-Paare eingesetzt. Zunächst wurde das Problem der Differenzierung von L.major und L.tropica angegangen, da dies eine vorrangige Aufgabe war. Zu diesem Zweck wurden die eigens dafür entwickelten Primer Uni21/Lmj4 (Eresh et al., 1993) getestet. Diese Primer amplifizieren ganze „Minicircle“ der Kinetoplasten-DNA (kDNA), die in 10.000 Kopien pro Organismus vorkommen, und daher potenziell als sehr sensitiv eingestuft wurden. Diese Primer-Paar konnte tatsächlich Leischmania-DNA direkt aus klinischem Material amplifizieren, die Sensitivität war jedoch insgesamt nicht zuverlässig genug für eine mögliche Einführung als Routinemethode. Für epidemiologische Anwendungen wurde das genus-spezifische Primer Paar (13A/13B, ebenfalls kDNA-Primer, Rodgers et al., 1990) verwendet, welches sich als hoch sensitiv erwies, jedoch keine spezies-spezifische Diagnostik leisten konnte.

Die Diagnostik der importierten Leischmaniosen aus der Neuen Welt erforderte den Einsatz eines weiteren Primer-Paares. Um eine hohe Sensitivität zu gewährleisten wurde dafür ebenfalls ein kDNA-Primerpaar eingesetzt (MP3H/MPL1, Lopez et al., 1993), welches die Spezies des L.braziliensis-Komplexes spezifisch amplifizieren, daneben jedoch keine andere Spezies erkennt. Dadurch konnten mehrere L.braziliensis-Infektionen bei Reiserückkehrern identifiziert werden. Um gleichzeitig auch die Infektionen zu erfassen, die nicht durch L.braziliensis verursacht waren, wurden dieselben Patientenproben auch mit den genus-spezifischen Primern untersucht. Gegen Ende der experimentellen Arbeit wurde eine vierte Methode eingeführt (El Tai et al., 2000), die eine sowohl sensitive als auch gleichzeitig spezies-spezifische Diagnostik für fast alle Spezies ermöglichte. Diese Primer (LITSRn/L5.8S) amplifizieren eine 300 bp Sequenz des ribosomalen Operons (Intergenic transcribed spacer, ITS-1). Diese Sequenz besteht aus konservierten und variablen Anteilen. Die konservierten Anteile ermöglichen eine Amplifikation aller Spezies (genus-spezifisch). Die variablen Anteile der Sequenz (spezies-spezifisch) werden für die spezies-spezifische Diagnostik genutzt, mithilfe von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP-Analyse). Zwar ist der Restriktionsverdau des PCR-Produktes ein zusätzlicher Schritt, doch wird dieser durch die Überlegenheit der Methode völlig gerechtfertigt.

Während der experimentellen Phase sind „nebenbei“ recht interessante Ergebnisse erzielt worden: Es wurde ein neuer L.tropica–Fokus identififiziert. In einem palästinensischen Dorf in der Nähe von Nablus (Wadi Albethan, Westjordanland) wurde ein Neuausbruch der kutaner Leischmaniose beobachtet, von dem ein großer Teil der Bevölkerung betroffen war (keine genauen epidemiologischen Daten). Die PCR von Wundabstrichen auf Filterpapier bewährte sich in dieser ersten realen Feldstudie.


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In einer umfangreicheren Studie an Wüsten-Nagetieren (Ohr-Wundabstriche auf Filterpapier) wurde eine neue Tierspezies als mögliches Reservoir gefunden, die vorher nicht als solche bekannt war (Gerbillus dasyarus). Die genus-spezifische PCR war schwach positiv bei mehreren Individuen, 1 amastigoter Parasit wurde in einem Giemsa gefärbten Ausstrich nachwiesen (Bestätigung der PCR-Ergebnisse).

Direkte (d.h. von klinischem Material, nicht von Kulturen), spezies-spezifische PCR-Diagnostik der Leischmaniasis ist in Israel zum ersten Mal durchgeführt und jetzt etabliert worden, L.braziliensis Infektionen sind zum ersten Mal spezies-spezifisch im Land nachgewiesen worden. Die Erfahrungen aus dieser Forschung können helfen, geeignete Konservierungs-, Extraktions- und PCR-Methoden für die Diagnose der Leischmaniose auch in anderen Labors zu übernehmen, sowohl in endemischen als auch in nicht-endemischen Ländern.


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