Identification of Avian pathogenic E. coli (APEC) genes important for the colonization of the chicken lung and characterization of the novel ExPEC adhesin I

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades 
doctor rerum naturalium 
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I 
der Humboldt-Universität zu Berlin

von 
Esther-Maria   Antão  
geb. Bragança  

(M. Sc. Microbiology)  

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin 
Prof. Dr. Christoph Markschies


Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I 
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön

Gutachter:
1. Univ.-Prof. Dr. Richard Lucius
2. Univ.-Prof. Dr. Lothar H. Wieler
3. Univ.-Prof. Dr. Dr. Ulf B. Göbel

Tag der mündlichen Prüfung: 08.02.2010

Summary

The extraintestinal pathogen, avian pathogenic E. coli (APEC), known to cause systemic infections in chickens, is responsible for large economic losses in the poultry industry worldwide. In order to identify genes, involved in the early essential stages of pathogenesis, namely adhesion and colonization, a lung colonization model of infection was established in 5-week old White leghorn specific-pathogen free (SPF) chickens, and Signature-tagged mutagenesis (STM) was applied to this model by generating and screening a total of 1,800 mutants of an APEC strain IMT5155 (O2:K1:H5; Sequence type complex 95).

The study led to the identification of new genes of interest, including adhesins, genes involved in capsule and LPS formation, regulators, transporters, metabolic enzymes and genes of putative function. Among the many genes identified was one coding for a novel APEC fimbrial adhesin (Yqi) not described for its role in APEC pathogenesis to date. Its gene product was temporarily designated ExPEC Adhesin I (EA/I). Deletion of the ExPEC adhesin I gene resulted in reduced colonization ability by APEC strain IMT5155 both in v i tro and in vivo. Furthermore, complementation of the adhesin gene restored its ability to colonize epithelial cells in vitro. The ExPEC adhesin I protein was expressed as a fusion protein in E. coli BL21 in vitro during the log phase as shown by SDS-PAGE and western blotting, to reveal a protein with a molecular mass of ~ 39 kDa. Electron microscopy of an afimbriate strain E. coli AAEC189 over-expressed with the putative EA/I gene cluster revealed short fimbrial like appendages protruding out of the bacterial outer membrane.

We observed that this adhesin coding gene yqi is prevalent among extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) isolates, including APEC (54.4%), uropathogenic E. coli (UPEC) (65.9%) and newborn meningitic E. coli (NMEC) (60.0%), and absent in all of the intestinal pathogenic E. coli strains tested, thereby validating the designation of the adhesin as ExPEC Adhesin I. In addition, prevalence of EA/I was most frequently associated with the E. coli phylogenetic group B2 and ST95 complex of the multi locus sequence typing (MLST) scheme, with evidence of a positive selection within this highly pathogenic complex.

This is the first report of the newly identified and functionally characterized ExPEC adhesin I and its role during APEC infection in chickens.

Keywords: Avian pathogenic E. coli (APEC), Signature-tagged mutagenesis (STM), Chicken lung infection model, ExPEC adhesin I (EA/I)

Zusammenfassung

Aviäre pathogene E. coli (APEC) sind extraintestinale Pathogene, die beim Huhn systemische Infektionskrankheiten hervorrufen. APEC sind verantwortlich für erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Geflügelindustrie. Zur Identifizierung bakterieller Gene, die an der Adhäsion und Kolonisierung des Wirtes beteiligt sind, wurde zunächst ein Lungen-Infektionsmodell in fünf Wochen alten spezifisch Pathogen-freien (SPF) Hühnern etabliert. In diesem Modell wurden 1.800 mittels Signature-tagged-Mutagenese (STM) hergestellten Mutanten des APEC Prototypstamms IMT5155 (O2:K1:H5; Sequenztyp-Komplex 95) auf ihre Fähigkeit zur Adhäsion und Kolonisierung im natürlichen Wirt getestet.

Die funktionelle Untersuchung führte zur Identifizierung bakterieller Gene, einschließlich Adhäsin-, LPS- und Kapsel-bildenden Genen, Regulator-, Transport- und Stoffwechselenzym-Genen, sowie Genen mit putativer Funktion. Die STM-Analyse erlaubte zudem die Identifizierung eines zuvor nicht charakterisierten putativen Fimbrien-bildenden Adhäsins (Yqi). Das Genprodukt wurde vorläufig als ExPEC Adhäsin I (EA/I) bezeichnet. Eine Deletion des EA/I-Gens führte zu einer Reduzierung der Adhäsionsfähigkeit des Wildtyp-Stammes IMT5155 sowohl in vitro in Zellkulturen als auch in vivo im Huhn. Eine Komplementierung des EA/I-Gens in trans resultierte in einer partiellen Wiederherstellung des Adhäsionsvermögens des Mikroorganismus an Epithel-Zellen in vitro. Das EA/I-Protein mit einer Größe von ~39 kDa wurde als Fusionsprotein in dem E. coli- Stamm BL21 in vitro exprimiert, und mittels SDS-PAGE und Western Blot nachgewiesen. Durch Überexpression des putativen EA/I-Operons in dem Fimbrien-negativen E. coli-Stamm AAEC189 konnten schließlich mittels elektronenmikroskopischer Aufnahmen Fimbrien-bildende Strukturen auf der äußeren Membran des Mikroorganismus dargestellt werden.

Das Vorkommen des yqi in den untersuchten extraintestinal pathogenen E. coli (ExPEC), einschließlich APEC (54.5%), uropathogenen E. coli (UPEC) (65.9%) und Neugeborenen-Meningitis-verursachenden E. coli (NMEC) (60.0%), bei gleichzeitigem Fehlen in allen untersuchten intestinal pathogenen E. coli bestätigt die Bezeichnung ExPEC Adhäsin I. Die Prävalenz des EA/I-Gens war am stärksten assoziiert mit Stämmen der B2-Phylogenetische-Gruppe sowie insbesondere mit Stämmen aus dem ST95-Komplex des Multi-Lokus-Sequenz-Typisierungs (MLST)-Schemas. DNA-Sequenzanalysen ergaben zudem erste Hinweise auf eine positive Selektion des EA/I-Gens innerhalb dieses ST95-Komplexes.

In der vorliegenden Promotionsarbeit gelang somit die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung des neuen ExPEC Adhäsin I, welches bei der APEC-Pathogenese im natürlichen Wirt Huhn eine Rolle spielt.

 

Eigene Schlagworte: Aviäre pathogene E. coli (APEC), Signature-tagged Mutagenese (STM), Lungen-Infektionsmodell, ExPEC Adhäsin I (EA/I)

Table of contents

Tables

Images



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML generated:
04.12.2014