Struktur-Funktionsanalyse des Immediate-Early Proteins 2 (IE2) des humanen Zytomegalievirus

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biologin Jasmin Asmar

geboren am 2. Dezember 1972 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Detlev H. Krüger
2. Prof. Dr. Christian Hagemeier
3. PD Dr. Martin Messerle

Tag der mündlichen Prüfung: 25. November 2004

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Das humane Zytomegalievirus (HCMV)
    • 1.1.1  Taxonomie
    • 1.1.2 Genom
    • 1.1.3 Morphologie
    • 1.1.4 Klinische Aspekte
    • 1.1.5 Latenz und Reaktivierung
    • 1.1.6 Der lytische Infektionszyklus
    • 1.1.7 Einflüsse auf die Wirtszelle - der Zellzyklus
    • 1.1.8 Die major immediate early (MIE)-Genregion
    • 1.1.9 Das IE2-Protein
    • 1.1.10 Struktur-Funktionsanalysen des IE2-Proteins
  • 1.2 Zielsetzung der Arbeit
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Allgemeine Materialien
  • 2.2 Bakterienkultur und Plasmidisolierung
  • 2.3 Klonierung der IE2-Mutanten
  • 2.4 Ligation, Transformation und DNA-Minipräparation
  • 2.5 Gerichtete in vitro Mutagenese nach der Kunkel-Methode
  • 2.6 DNA-Sequenzierung
  • 2.7 Zellkultur
  • 2.8 Transfektionen
  • 2.9 Zellernte für die Durchflußzytometrie
  • 2.10 Zellextraktion zur Immunoblot-Analyse
  • 2.11 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
  • 2.12 Immunoblot-Analysen
  • 2.13 Proteinbestimmung nach Bradford
  • 2.14 CAT-Elisa
  • 2.15 Luciferase-Assay
  • 2.16 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
• 3  Ergebnisse
  • 3.1  Experimentelles System - Aktivitäten des Wildtyp IE2-Proteins
  • 3.2 Struktur-Funktionsanalyse des IE2-Proteins
  • 3.3 Die IE2-DNA-Bindung
    • 3.3.1  Etablierung eines DNA Bindungsassays für das HCMV IE2-Protein
    • 3.3.2 Die DNA-Bindung C-terminaler IE2-Mutanten
    • 3.3.3 Die DNA-Bindung interner Deletionsmutanten
    • 3.3.4 Die postulierte Zinkfingerdomäne
• 4 Diskussion
  • 4.1  Die IE2-DNA-Bindung
  • 4.2 IE2-Struktur-Funktionsanalyse
    • 4.2.1  Der C-Terminus
    • 4.2.2 N-terminale Sequenzen
    • 4.2.3 Die postulierte Zinkfingerdomäne
  • 4.3 Aufbau und Lokalisation der regulatorischen Domänen des IE2-Proteins
• 5 Zusammenfassung
• Literatur
• Abkürzungsverzeichnis
• Veröffentlichungen
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Oligonukleotide für die Mutagenesereaktionen
• Tabelle 2: Mengenverhältnis von Effektor zu Reporterplasmid im Transfektionsansatz

Bilder

• Abb. 1: Schematische Darstellung des humanen Zytomegalievirus
• Abb. 2: Lokalisation und Aufbau der MIE Genregion
• Abb. 3: Regulatorische Domänen des HCMV IE2-Proteins
• Abb. 4: Aktivitäten des HCMV IE2 Proteins
• Abb. 5: Einfluss C-terminaler Sequenzen auf die Zellzyklusarrest-Aktivität des IE2 Proteins.
• Abb. 6: Überlappung regulatorischer Domänen im C-Terminus des IE2-Proteins: Zellzyklusarrest, Transaktivierung und Autorepression.
• Abb. 7: Einfluss N-terminaler Sequenzen auf den Zellzyklusarrest, die Transaktivierung sowie die Autorepression.
• Abb. 8: Transaktivierung des UL112/113-Promotors und des c-fos-Promotors durch das wt IE2-Protein und die Mutanten.
• Abb. 9: Repression des MIE-Promotors durch interne Deletionsmutanten.
• Abb. 10: Etablierung eines DNA-Bindungsassays für das IE2-Protein.
• Abb. 11: IE2 aus Extrakten transfizierter Zellen bindet an eine crs enthaltende Zielsequenz.
• Abb. 12: Einfluss der Menge an poly (dA-dT)·(dA-dT)-Kompetitor-DNA auf die Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins.
• Abb. 13: Einfluss verschiedener Kompetitor DNAs auf die Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins.
• Abb. 14: Titation der Menge des eingesetzten Zellextraktes.
• Abb. 15: Bindung des IE2-Proteins an die crs
• Abb. 16: Nachweis der Spezifität der IE2-DNA-Interaktion über Kompetition mit nicht-markierter DNA
• Abb. 17: Spezifische DNA-Bindung des IE2-Protein aus Extrakten transfizierter U373-Zellen.
• Abb. 18: Nachweis der IE2-DNA-Interaktion während der viralen Infektion.
• Abb. 19: IE2-vermittelte Repression des MIE Promotors in HeLa-Zellen.
• Abb. 20: C-terminale Mutationen zerstören die DNA-Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins.
• Abb. 21: DNA-Bindung der internen Deletionsmutanten.
• Abb. 22: Die putative Zinkfingerdomäne wird für die DNA-Bindung nicht benötigt.
• Abb. 23: Funktionelle Domänen im HCMV IE2-Protein.