1 Einleitung

1.1  Das humane Zytomegalievirus (HCMV)

1.1.1  Taxonomie

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Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der Herpesviridae und wird innerhalb dieser der Unterfamilie der Beta-Herpesvirinae zugeordnet. Die Beta-Herpesviren zeichnen sich durch eine ausgeprägte Speziesspezifität, einen relativ langen Replikationszyklus und eine ausgesprochen langsame Vermehrung in der Zellkultur sowie einen charakteristischen zytopathischen Effekt aus. HCMV-infizierte Zellen zeigen ein auffälliges Größenwachstum, welches namensgebend für das Virus wirkte.

1.1.2 Genom

Herpesviren besitzen ein Genom aus linearer doppelsträngiger DNA, wobei das des humanen Zytomegalievirus mit 235 kbp das größte aller bekannten Viren ist. Für den in der vorliegenden Arbeit verwendeten HCMV Stamm AD169 wurde das Genom vollständig sequenziert (Chee et al., 1990) und bisher wurden mehr als 150 offene Leseraster (ORFs) identifiziert (Davison et al., 2003;Murphy et al., 2003;Murphy et al., 2003).

Bei allen Herpesviren findet man innerhalb des Genoms einmalig vorkommende (unique) und wiederholte (repeat) Sequenzabschnitte, die bei den Vertretern der jeweiligen Genera in unterschiedlichen Mustern angeordnet sind. Das Genom des Zytomegalievirus besteht aus einem langen (unique long – UL) und einem kurzen (unique short – US) nicht-repetitiven Sequenzabschnitt, welche jeweils von invertierten Einheiten repetitiver Sequenzen flankiert werden (siehe auch Abb. 2). Die offenen Leserahmen werden entsprechend ihrer Lokalisation innerhalb des langen oder kurzen nicht-repetitiven Sequenzabschnitts mit ULund US bezeichnet (Roizman, 1993).

1.1.3 Morphologie

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Das humane Zytomegalievirus besitzt eine für Herpesviren typische Morphologie. Das Virion besteht aus einem DNA-haltigen Kern in einem ikosaedrischen Capsid. Dieses Nukleokapsid ist umhüllt von einer Proteinmatrix, dem Tegument (Gibson, 1996;McGavran und Smith, 1965;Wright et al., 1964). Charakteristisch für die Herpesviren ist eine lipidhaltige äußere Hülle (envelope), in die verschiedene viral kodierte Glykoproteine eingelagert sind (Britt und Mach, 1996;Spaete et al., 1994).

Abb. 1: Schematische Darstellung des humanen Zytomegalievirus

Das humane Zytomegalievirus gehört zu den von einer Membran umhüllten DNA-Viren. Seine lineare doppelssträngige DNA ist in einem ikosaedrischen Capsid enthalten, welches von einer amorphen Proteinhülle, dem Tegument, umgeben ist. Nach außen schließt sich die Membran an, in die zahlreiche Glykoproteinkomplexe eingelagert sind.

1.1.4 Klinische Aspekte

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Das humane Zytomegalievirus ist ein ubiquitär vorkommendes Virus mit einer Durchseuchungsrate von etwa 80%, wobei die Infektion meist schon während der Kindheit erfolgt (Pass, 2001). Die primäre Infektion verläuft bei den meisten immunkompetenten Erwachsenen mild bis asymptomatisch und geht in ein lebenslang persistierendes Stadium der latenten Infektion über. In Einzelfällen kommt es zur Ausbildung eines mononukleose-ähnlichen Syndroms mit Fieber, Lymphknoten-schwellungen, Gastritis oder grippeähnlichen Erscheinungen.

Im Gegensatz dazu kann die Primärinfektion aber auch die Reaktivierung bei einem defizienten Immunsystem, wie bei dem sich entwickelnden Foetus, Transplantations- oder AIDS-Patienten, zu schweren Erkrankungen führen (Pass, 2001).

Die intrauterine Infektion, meist als Folge einer primären Infektion der Mutter, ist die häufigste kongenitale virale Infektion (Pass, 2001) und betrifft 0,7-4,1 % aller Lebendgeburten (Pass, 1999). Hier kann es zu Thrombozytopenie, Hepatosplenomegalie, Hörschäden und Entwicklungsdefekten aufgrund der Infektion des zentralen Nervensystems kommen. So tragen 10-15 % der infizierten Neugeborenen bleibende neurologische Schäden davon (Fowler und Pass, 1995;Fowler et al., 1992;Stagno et al., 1982).

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In immunsupprimierten Patienten, wie AIDS- oder Transplantationspatienten, kann eine Primärinfektion aber auch die Virusreaktivierung zu lebensbedrohlichen Krankheiten führen. Betroffen sind in diesen Patienten die Lunge, der Gastrointestinaltrakt, die Leber und das zentrale Nervensystem. Die häufigste ZNS-Erkrankung, gerade bei AIDS Patienten, ist die HCMV-Retinits, die zur Erblindung führen kann.

Da die Zahl der Patienten, die sich im Rahmen einer Organ- oder Knochenmarkstransplantation einer immunsuppressiven Therapie unterziehen müssen oder durch AIDS immunsupprimiert sind, in den letzten Jahren beständig gestiegen ist, kommt der HCMV Infektion und ihrer Behandlung eine immer größere Bedeutung zu.

Gegenwärtig stehen zur Behandlung einer HCMV-Infektion nur wenige Medikamente zur Verfügung. Hierzu gehören das Nukleosidanalogon Ganciclovir (GCV), das Nukleotidanalogon Cidofovir (CDV) und das Pyrophosphatanalogon Foscarnet (FOS). Sie alle inhibieren entweder direkt oder indirekt die HCMV DNA-Polymerase. Allerdings weisen diese Virostatika auch schweren Nebenwirkungen auf. Darüber hinaus ist vor allem im Rahmen einer Langzeittherapie das Auftreten resistenter HCMV-Stämme beobachtet worden (Cherrington et al., 1998;Smith et al., 1997). Aus diesem Grunde wird beständig nach neuen Therapieansätzen gesucht. Neuere, noch in der Entwicklung befindliche, Wirkstoffe inhibieren z.B. die Genprodukte UL89 und UL56, welche in den Reifungsprozess der Virionen und die Verpackung der viralen DNA involviert sind (Buerger et al., 2001;Krosky et al., 1998). Das Medikament Fomivirsen ist ein Antisense Oligonukleotid, welches gegen das Immediate Early Protein 2 (IE2) des HCMV gerichtet ist und so die Immediate Early Genexpression inhibiert (Cinatl et al., 2000;de Smet et al., 1999).

1.1.5 Latenz und Reaktivierung

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Das humane Zytomegalievirus etabliert nach der Primärinfektion im Wirt eine lebenslange Latenz. Latenz ist hier definiert als persistierende Infektion bei der die virale DNA vorhanden ist, aber keine infektiösen Viren produziert werden (Banks und Rouse, 1992). Die genauen Mechanismen der Latenz und der Reaktivierung sind noch unklar. Eine Hauptort der HCMV Latenz sind die Vorläuferzellen von Monozyten/Granulozyten im Knochenmark (Kondo et al., 1996;Mendelson et al., 1996;Sindre et al., 1996;Slobedman und Mocarski, 1999;Taylor-Wiedeman et al., 1991). In diesen latent infizierten Zellen liegt die virale DNA als zirkuläres Genom vor. Welche viralen Proteine funktionell in Latenz und Reaktivierung involviert sind, ist noch unklar. Zwar wurden Latenz-assoziierte Transkripte identifiziert, doch ist ihnen noch keine funktionelle Bedeutung zugeschrieben worden (Kondo und Mocarski, 1995). Die Reaktivierung scheint daher vor allem von zellulären Faktoren abzuhängen. Als ein wichtiges Ereignis bei der Reaktivierung wird die Zytokin-vermittelte Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen unter proinflammatorischen Bedingungen angesehen (Meier und Stinski, 1996;Soderberg-Naucler et al., 1997;Soderberg-Naucler und Nelson, 1999). Experimentell infizierte myeloide Vorläuferzellen reaktivieren latentes Virus, wenn sie in der Gegenwart von IFNγ oder TNFα kultiviert werden (Hahn et al., 1998), und in einem Mausmodell konnte durch die Behandlung latent infizierter Tiere mit TNFα die IE Genexpression in der Lunge induziert werden (Hummel et al., 2001). Die Kontrolle der viralen IE-Genexpression scheint hierbei von großer Bedeutung zu sein, da sie essentiell für die Virusreplikation ist (Greaves und Mocarski, 1998;Marchini et al., 2001;Mocarski et al., 1996). So scheint die Aktivierung der IE Genexpression, sei es durch TNFα und nachfolgende Aktivierung von NFκB (Hummel und Abecassis, 2002;Prosch et al., 2002), durch Inhibition zellulärer Repressoren (Bain et al., 2003), oder durch Veränderung der Chromatinstruktur (Murphy et al., 2002), eine wichtige Rolle bei der Reaktivierung des Virus zu spielen.

1.1.6 Der lytische Infektionszyklus

Wie bei allen Herpesviren ist die Genexpression des humanen Zytomegalievirus zeitlich reguliert und lässt sich in drei Phasen unterteilen, und zwar die sehr frühe (immediate early, α-), frühe (delayed early, β-) und späte (late, γ-) Phase der Infektion (Mocarski, 1993).

Nach dem Eintritt des Virus in die Wirtzelle gelangt zunächst das Capsid zu den Kernporen, durch die das Genom in das Nukleoplasma entlassen wird. Das lineare DNA-Genom zirkularisiert und liegt dann als Episom im Kernplasma vor. Die Transkription und Replikation der viralen DNA findet im Zellkern statt (Mocarski, 2001).

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In der ersten Phase der Infektion werden die sogenannten immediate early Gene exprimiert, dies geschieht unabhängig von de novo Proteinsynthese. Die immediate early Proteine aktivieren die Expression der delayed early und der späten Gene und regulieren so den Ablauf der lytischen Infektion. Insgesamt kennt man vier Genomregionen, die sehr früh während des lytischen Infektionszyklus durch das Tegumentprotein pp71 aktiviert werden: UL36-38, ie1/ie2 (UL122-123), TRS1-IRS1 und US3 (Colberg-Poley, 1996;Stinski et al., 1983). Die überwiegende Mehrheit der Transkripte wird jedoch an einem einzigen Lokus generiert, und zwar dem UL122-123, der deswegen auch als major immediate early (MIE)-Genregion bezeichnet wird (Chee et al., 1990).

Der sehr frühen Genexpression folgt die zweite, sogenannte early Phase der Infektion. Sie beginnt definitionsgemäß vor der viralen DNA Replikation und ist abhängig der vorangegangenen Expression der sehr frühen Genprodukte. Die early Phase lässt sich weiter unterteilen in die β1 (early) und β2 (early late) Phase unterteilen, je nach Zeitpunkt der maximalen Proteinexpression sowie der Sensitivität gegenüber Inhibitoren der viralen DNA-Synthese (Mocarski, 1993). Während der early Phase werden vor allem die Nichtstrukturproteine gebildet. Hierzu gehören die Enzyme und nukleinsäurebindenden Proteine, die für die Replikation des Virusgenoms erforderlich sind.

Die DNA-Replikation beginnt ungefähr 16 h nach der Infektion und erreicht ihr Maximum nach 60 bis 80 h (Stinski, 1978). Das zirkularisierte Virusgenom im Zellkern permissiver Zellen wird nach dem Prinzip des „rolling circle“ repliziert (McVoy et al., 1997). Als Ausgangsort für die DNA-Synthese dient ein spezifischer Replikationsorigin innerhalb der UL-Region, der oriLyt (Anders et al., 1992;Masse et al., 1992). Der Replikationsapparat setzt sich im wesentlichen aus sechs HCMV-kodierten Proteinen zusammen, und zwar aus der DNA Polymerase (UL54), einem DNA Prozessivitätsfaktor (UL44), einem Einzelstrang-bindenden Protein (UL57) und einem aus drei Untereinheiten bestehenden Helikase-Primase-Komplex (UL70, UL102 und UL105) (Anders und McCue, 1996). Darüber hinaus sind zusätzliche HCMV Gene identifiziert worden, die eine Rolle bei der Replikation spielen. Hierzu gehören IE regulatorische Proteine (UL36-38, IRS1/TRS1 und UL122/123) wie auch zwei nukleär lokalisierte early Proteine (UL84, UL112/113) (Iskenderian et al., 1996;Pari und Anders, 1993;Pari et al., 1993). Die virale DNA-Synthese läuft in abgegrenzten nukleären Replikationskompartimenten ab, welche am Rande bestimmter Kernstrukturen, den PODs, entstehen (Penfold und Mocarski, 1997). Wie gezeigt werden konnte, akkumuliert an PODs während einer Infektion die virale DNA von Adenoviren, SV40, HSV-1 und HCMV (Ishov und Maul, 1996;Ishov et al., 1997). Darüber hinaus sind sie auch die Orte der IE Transkription in HCMV (Ishov et al., 1997). Die von der UL112/113 Genregion exprimierten Phosphoproteine (Wright et al., 1988) regulieren die Bildung dieser Replikationszentren (Ahn et al., 1999;Penfold und Mocarski, 1997) und scheinen eine besondere Rolle bei der Rekrutierung der anderen viralen Replikationsfaktoren zu spielen. Die genaue Funktion des UL84 Genprodukts, einem 75 kDa Phosphoprotein, ist noch unklar. Während Sarisky und Hayward es als für die Replikation essentiellen Faktor identifizierten (Sarisky und Hayward, 1996), hatte in einer neueren Studie seine Abwesenheit keinen Einfluss auf die oriLyt-abhängige DNA-Synthese (Reid et al., 2003). In infizierten Zellen konnte gezeigt werden, dass das UL84 Protein zusammen mit UL44 und dem IE2 Protein in den viralen Replikationskomplexen kolokalisiert (Xu et al., 2002). Darüber hinaus kann es auch direkt mit dem IE2 Protein interagieren (Spector und Tevethia, 1994), was zu einer Inhibition der IE2-vermittelten Transaktivierung und zu einer Verstärkung der negativen Autoregulation durch IE2 führt (Gebert et al., 1997). Das IE2-Protein, das wie die UL112/113 Proteine zu sehr frühen Zeitpunkten in der Nähe der PODs nachgewiesen werden kann (Ahn et al., 1999), scheint ebenfalls für eine effiziente oriLyt-abhängige DNA Replikation in primären humanen Fibroblasten benötigt zu werden (Sarisky und Hayward, 1996), aber auch hier ist die genaue Funktion noch unklar.

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Als letzte Phase schließt sich die späte Phase der Infektion an, in der typischerweise die Strukturproteine des Virions gebildet werden. Sie lässt sich unterteilen in die γ1- (leaky late) und γ2- (true late) Phase. Während die Transkription der γ1-Phase durch Inhibition der viralen DNA Synthese lediglich reduziert wird, ist sie während der γ2-Phase obligat von der viralen DNA-Replikation abhängig (Stinski, 1978).

Im Zellkern findet der Zusammenbau der verschiedenen Strukturproteine zu Partikelvorläufern statt. Zuerst interagieren die Capsidproteine zu partikulären Vorstufen, die noch keine DNA enthalten. Dann wird ein Genomäquivalent in das Vorcapsid eingeschleust und an die nun DNA-haltigen Capside binden sich die Tegumentproteine. Sie assoziieren sich mit der inneren Kernmembran, in welche die Glykoproteine eingelagert sind. Von hier aus werden sie über das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche transportiert, wo ihre Freisetzung erfolgt. Dies ist mit der Lyse der Wirtszelle verbunden. Wie gezeigt werde konnte, gelangen neben den Virionproteinen auch vorgefertigte mRNAs in die neu gebildeten Viruspartikel (Bresnahan und Shenk, 2000;Greijer et al., 2000). Welche Funktion sie erfüllen, ist jedoch noch unklar.

1.1.7 Einflüsse auf die Wirtszelle - der Zellzyklus

Wie andere Herpesviren ist auch das humane Zytomegalievirus in der Lage, den Zellzyklusstatus der infizierten Zelle zu beeinflussen. In vivo infiziert HCMV normalerweise quieszente Zellen, in denen nur limierte Mengen an Desoxy-ribonukleotiden und Kofaktoren für die DNA Replikation vorhanden sind. Dieser Mangel an S-Phase Faktoren stellt wahrscheinlich eher ungünstige Voraussetzungen für die virale DNA-Replikation dar. Nach HCMV-Infektion beobachtet man in diesen Zellen jedoch einen Anstieg der zellulären Transkription und Translation (Stinski, 1978), wie er in ähnlicher Weise auch bei einer Stimulation durch Wachstumsfaktoren auftritt. So führt die HCMV-Infektion in quieszenten Zellen z.B. zu einer Induktion der fos-, jun- und myc-Genexpression (Boldogh et al., 1990).

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Darüber hinaus findet man in diesen wie auch in infizierten proliferierenden Zellen eine starke Erhöhung der Cyclin E-Cdk2-Aktivität und des Phosphorylierungsgrades von pRb (Jault et al., 1995). Quieszente, primäre Zellen werden durch die HCMV-Infektion aus G0 zurück in den Zellzyklus getrieben, zu einem Übertritt in die S-Phase und einer Induktion der zellulären DNA-Synthese kommt es jedoch nicht (Bresnahan et al., 1996;Dittmer und Mocarski, 1997;Jault et al., 1995;Lu und Shenk, 1996). Vielmehr führt HCMV in produktiv infizierten humanen Fibroblasten zu einem Zellzyklusarrest in G1 (Dittmer und Mocarski, 1997;Jault et al., 1995;Lu und Shenk, 1996), wobei diese Zellen biochemisch Merkmale einer frühen S-Phase aufweisen (Bresnahan et al., 1996;Dittmer und Mocarski, 1997). Trotz Abwesenheit zellulärer Replikation ist die Expression S-Phase spezifischer Gene in HCMV-arretierten Zellen hochreguliert. Dazu zählen vor allem Replikationsfaktoren wie Topoisomerase II (Benson und Huang, 1990) und PCNA (Dittmer und Mocarski, 1997) sowie Enzyme des Nukleotidmetabolismus (Colberg-Poley und Santomenna, 1988;Isom, 1979;Lembo et al., 1999). Ferner wird auch Cyclin B in HCMV-arretierten Zellen exprimiert (Dittmer und Mocarski, 1997;Jault et al., 1995). Die Cyclin A-Expression hingegen ist auf transkriptioneller Ebene reprimiert (Salvant et al., 1998) und es ist keine Cyclin A-assozierte Kinaseaktivität zu beobachten (Bresnahan et al., 1996;Jault et al., 1995). Dies wird teilweise als mögliche Ursache für den Arrest am G1/S-Übergang betrachtet (Fortunato et al., 2000).

Die Stimulation der Nukleotid- und Replikationsfaktorsynthese bei gleichzeitiger Inhibition der zellulären DNA-Synthese scheint eine essentielle Voraussetzung für einen produktiven Replikationszyklus des Virus zu sein. Bei einer Infektion permissiver humaner Fibroblasten, die sich zum Zeitpunkt der Infektion bereits in der S- oder späteren Phasen des Zellzyklus befinden, kommt es zu einer Verzögerung der viralen Genexpression sowie der Replikation (Salvant et al., 1998), was vermutlich auf eine Inhibition der IE-Genexpression zurückzuführen ist (Fortunato et al., 2002). Darüber hinaus bewirkt eine Inhibition der Thymidylat-Synthetase, der Topoisomerase II oder von Cdk2 eine abortive Infektion (Benson und Huang, 1988;Bresnahan et al., 1997;Lembo et al., 2000).

Der genaue Mechanismus der HCMV-vermittelten Inhibition der zellulären DNA-Synthese ist noch unklar. Allerdings konnte gezeigt werden, dass HCMV an den zellulären Replikationsorigins das sogenannte Replikationslicensing verhindert. In HCMV-infizierten Zellen kommt es nicht zur vollständigen Assemblierung des zellulären Replikationsinitiationskomplexes, da die Bindung des Mini-Chromosom-Maintenance (MCM)- Komplexes an das Chromatin inhibiert ist (Biswas et al., 2003;Wiebusch et al., 2003).

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Bisher wurden zwei virale Faktoren identifiziert, die an der Induktion eines Zellzyklusarrests in HCMV-infizierten Zellen beteiligt sein könnten.

Das Tegumentprotein pUL69, ein Transkriptionsfaktor, führt bei transienter Expression in Zellen zu einem G1-Arrest (Lu und Shenk, 1999). Nach einer Deletion dieses Proteins sind rekombinante Viren nur noch eingeschränkt in der Lage, einen Zellzyklusarrest induzieren (Hayashi et al., 2000). Als zweiter wichtiger viraler Faktor gilt das IE2 Protein, welches ebenfalls einen Zellzyklusarrest induzieren kann. Auf seine zellzylusregulatorischen Eigenschaften soll später noch genauer eingegangen werden.

1.1.8 Die major immediate early (MIE)-Genregion

Wie bereits erwähnt, wird der größte Teil der immediate early Transkripte von der MIE- Genregion (UL122-123; ie1/ie2) generiert. Sie repräsentiert den wohl am besten untersuchten Genlocus innerhalb des HCMV-Genoms. Die ie1/ie2-Genregion kodiert für die immediate early Proteine IE1 und IE2 sowie weitere Spleißprodukte und Isoformen. Sie befindet sich innerhalb des langen, nicht repetitiven Sequenzabschnitts des HCMV Genoms und ihre offenen Leserahmen werden dementsprechend als UL122 und UL123 bezeichnet. Die Regulation der IE1/IE2-Genexpression erfolgt über einen starken und komplex-regulierten Promotor-Enhancer (Boshart et al., 1985;Meier und Pruessner, 2000;Meier und Stinski, 1996;Nelson et al., 1990). Darüber hinaus kann auch der Modulator, der vom Enhancer durch die sogenannte unique region getrennt ist, die Expression beeinflussen (Meier und Stinski, 1996). Die Funktion der unique region ist bislang noch unklar. In Abbildung 2 ist die Lokalisation und der Aufbau der MIE Genregion dargestellt.

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Abb. 2: Lokalisation und Aufbau der MIE Genregion

Die MIE-Genregion befindet innerhalb des langen, nicht repetitiven Sequenzabschnitts (UL-Segment) des Genoms. Ihre offenen Leserahmen werden als UL122 und UL123 bezeichnet. Der regulatorische Bereich der ie1/ie2-Genregion besteht aus dem Modulator, der unique region, dem Enhancer und dem MIE-Promotor. Dargestellt ist die Lokalisation im Genom sowie der Aufbau der MIE-Genregion. Ferner zeigt die Abbildung den Aufbau der Transkripte für das IE1 und das IE2 Protein sowie einige Isoformen.

Genprodukte

Die ie1/ie2-Genregion besteht aus 5 Exons und enthält zwei Polyadenylierungs-Signalsequenzen in Exon 4 und Exon 5 (Stenberg et al., 1984) so dass durch alternative Spleißvorgänge verschiedene mRNAs transkribiert werden können. Das mengenmäßig am meisten gebildete immediate-early Protein ist das IE1 Protein (Bezeichnung: IE1, IE-72 oder pUL123), ein nukleär lokalisiertes Phosphoprotein (69-72 kD), das von einer mehrfach gespleißten mRNA aus den Exons 1-4 translatiert wird. Das IE1 Protein aktiviert über die NFκB-Bindungsstellen im MIE Promotor seine eigene Expression und ist auch an der Aktivierung der delayed early und späten Genexpression beteiligt (Mocarski et al., 1996). Virale Mutanten, in denen das IE1 Protein komplett deletiert ist, sind noch in der Lage, zu replizieren, wenn mit einer hohen MOI (multiplicity of infection) infiziert wird. Das IE1 Protein scheint jedoch essentiell zu sein, wenn Zellen nur mit einer geringen MOI infiziert werden, denn hier beobachtet man bei IE1-deletierten Viren in den Zellen eine deutlich reduzierte Expression der delayed early Gene, was zu einem Wachstumsdefekt der mutierten Viren führt (Ahn und Hayward, 2000;Gawn und Greaves, 2002;Greaves und Mocarski, 1998).

Das IE2 Protein (Bezeichnungen: IE2, IE-86 oder UL122a) ist ebenfalls ein nukleäres Phosphoprotein, dessen aminoterminale 85 Aminosäuren mit denen des IE1 Proteins identisch sind. Es fungiert als potenter transkriptioneller Aktivator der viralen Genexpression. Das IE2 Protein des HCMV Stammes AD169, das auch in der vorliegenden Arbeit Verwendung fand, besteht aus 580 Aminosäuren (die in der Literatur üblicherweise angegebenen 579 AS beziehen sich auf das IE2 Protein aus dem HCMV Town Stamm) und weist im SDS-Polyacrylamidgel eine Größe von 80-86 kDa auf. Während das IE1 Protein den MIE Promotor aktiviert, ist das IE2-Protein in der Lage, diesen zu reprimieren. Beide MIE-Proteine können jedoch synergistisch zur transkriptionellen Aktivierung einiger early und late Gene von HCMV beitragen (Depto und Stenberg, 1989;Kerry et al., 1994). Andere Promotoren werden durch IE2 alleine aktiviert und IE1 oder andere IE-Genprodukte können diesen Effekt nur verstärken (Colberg-Poley et al., 1992;Klucher et al., 1993;Malone et al., 1990). Neben IE1 und IE2 werden durch alternative Spleißvorgänge mehrere kürzere IE-Isoformen gebildet, wie z.B. IE55/IE2 (55kDa) (Baracchini et al., 1992), IE18/IE2 (18 kDa) (Spector, 1996;Stenberg, 1996) und IE19/IE1 (38 kDa) (Shirakata et al., 2002). Ihre Funktion während der viralen Infektion ist zum Teil noch unklar, allerdings konnte für das IE55-Protein gezeigt werden, dass es wie IE1 den MIE Promotor aktivieren kann (Baracchini et al., 1992). So scheint die eigentliche Nettoaktivierung des Promotors von dem Verhältnis des IE1, IE2 und IE55 zueinander abzuhängen. Im Gegensatz zu den bisher genannten IE-Proteinen ist das mengenmäßig am stärksten produzierte Genprodukt der MIE Genregion, das IE2338aa/IE2p40 (338 Aminosäuren, 40 kDa), ein Protein der späten Phase (true late protein). Es wird durch Transkription von einem intern im UL122-Leserahmen gelegenen Promotor generiert und entspricht den C-terminalen Sequenzen des IE2 Proteins (Jenkins et al., 1994;Stenberg, 1996).

Regulation der Genexpression

Der MIE Modulator

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Der Modulator befindet sich zwischen Position –750 und –1150 relativ zum Transkriptionsstart. Er wurde identifiziert aufgrund seiner Eigenschaft, in transienten Transfektionen die Transkription entweder zu stimulieren oder zu reprimieren, je nachdem welcher Zelltyp verwendet wurde bzw. welchen Differenzierungsgrad die Zellen aufwiesen (Nelson und Groudine, 1986;Nelson et al., 1987). Wie sich zeigte, reprimiert der Modulator die Transkription in undifferenzierten Tera-2-Zellen (Shelbourn et al., 1989) und monozytischen THP-1-Zellen (Huang et al., 1996), vermag dies jedoch nicht mehr, sobald die Zellen differenziert bzw. stimuliert wurden. Die Mechanismen der Regulation der Transkription durch den Modulator sind noch unklar, zumal er in einigen Zelltypen wie z.B. B-Lymphozyten und Fibroblasten auch zu einer Promotoraktivierung führen kann (Lubon et al., 1989;Nelson et al., 1987). Teilweise scheint die Bindung verschiedener zellulärer Proteine wie z.B. des Transkriptionsfaktors YY1 mit zur Repression in undifferenzierten Zellen beizutragen (Liu et al., 1994;Sinclair et al., 1992). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Repression des MIE Promotors in undifferenzierten Zellen auch über eine Veränderung der Chromatinstruktur vermittelt wird und diese hauptsächlich im Bereich der Modulatorregion stattfindet (Murphy et al., 2002;Nelson und Groudine, 1986). Für die IE-Genexpression scheint der Modulator jedoch nicht essentiell zu sein. Eine Deletion dieser Region in rekombinanten Viren hatte keinen Einfluss auf die ie1/ie2-Genexpression, sei es in differenzierten oder in undifferenzierten Zellen (Meier und Stinski, 1997).

Der MIE Enhancer

Der MIE Enhancer gehört zu den stärksten bekannten Enhancern (Thomsen et al., 1984) und findet eine breite Anwendung zur heterologen Genexpression in experimentellen und therapeutischen Vektoren. Die starke Aktivierung, die durch den MIE Enhancer vermittelt wird, ist auf eine dichte Anhäufung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen zurückzuführen (Niller und Hennighausen, 1990;Niller und Hennighausen, 1991). Hierzu gehören unter anderem Bindungsstellen für CREB/ATF, NF-κB/Rel, Sp1, AP1, NF-1 und YY-1 (dargestellt in (Meier und Stinski, 1996). Kurz nach Infektion der Wirtszelle werden mehrere Transkriptionsfaktoren, wie z.B. NF-κB, AP-1, Sp-1 und CREB/ATF, induziert und aktivieren die Expression vom MIE Promotor/Enhancer durch die Bindung an repetitive Sequenzelemente, die je nach ihrer Größe als 16-, 18-, 19- und 21 bp repeats bezeichnet werden (Thomsen et al., 1984). Wie bereits erläutert, spielen die NF-κB Bindungsstellen eine wichtige Rolle bei der IE1-vermittelten Aktivierung des Promotors (Cherrington und Mocarski, 1989). Die 19-bp repeats enthalten ein cAMP-responsives Element (ATF-Bindungsstelle), über die eine Transaktivierung durch das pp71-Virionprotein vermittelt wird (Liu und Stinski, 1992). Aufgrund der vielen verschiedenen Bindungsstellen variiert die Aktivität des Enhancers in Abhängigkeit vom Zelltyp und der zellulären Differenzierung (Meier und Stinski, 1996). Seine Aktivität hängt ab von der Anwesenheit der jeweiligen Transkriptionsfaktoren und wird zusätzlich beeinflusst vom benachbarten Modulator.

Der MIE Promotor

Der MIE Promotor erstreckt sich von –50 bis +1 relativ zum Transkriptionsstart. Er wird mit fortschreitender Infektion durch einen IE2-abhängigen Prozess reprimiert (Stenberg, 1996). Hierbei bindet das IE2-Protein, vermutlich als Homodimer (Macias et al., 1996) an ein spezifisches Signal, die cis-repression sequence (crs) nahe dem Transkriptionsstart (Cherrington et al., 1991;Liu et al., 1991;Pizzorno und Hayward, 1990).

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Die crs wurde identifiziert als ein 14-bp Sequenzelement mit teilweise palindromischer Struktur (Cherrington et al., 1991;Liu et al., 1991;Pizzorno und Hayward, 1990). Sie besteht aus 2 Kopien des Dinukleotids CG, die durch einen A/T-reichen Abschnitt von 10 Nukleotiden getrennt sind. Über die crs kann eine IE2-abhängige Repression auch auf heterologe Promotoren übertragen werden (Cherrington et al., 1991;Liu et al., 1991;Pizzorno und Hayward, 1990). Die Repression durch das IE2 Protein ist unabhängig von der Orientierung der crs, aber abhängig von der Lokalisation, da die Repression abnimmt, wenn der Abstand zwischen der crs und der TATA Box erhöht wird (Lee et al., 1996). In Mutationsanalysen konnte gezeigt werden, dass die flankierenden CG Dinukleotide kritisch für die Bindung sind und dass zudem der Abstand zwischen den Dinukleotiden, bestimmt durch die Anzahl der internen Nukleotide, entscheidender ist, als deren genaue Sequenz (Chiou et al., 1993;Waheed et al., 1998). Allerdings scheint der A/T-reiche Charakter der internen Nukleotide die Bindung zu begünstigen (Waheed et al., 1998). Wie die Repression des Promotors durch das IE2 Protein vermittelt wird, ist noch nicht in allen Einzelheiten bekannt. Da die crs zwischen der TATA Box und dem Transkriptionsstart des MIE Promotors lokalisiert ist, scheint dies die Assemblierung des Transkriptionsinitiationskomplexes sterisch zu behindern. So konnte gezeigt werden, dass das IE2 Protein die Transkription vom MIE Promotor nur während der Assemblierung des Transkriptionsinitiationskomplexes reprimieren kann, nicht aber während des Elongationsprozesses (Wu et al., 1993). Die crs erstreckt sich von Position –13 bis –1 relativ zum Transkriptionsstart. In in vitro Analysen konnte die Bindung eines noch unbekannten zellulären Proteins von ca. 105 kDa Größe in diesem Bereich nachgewiesen werden, welches einen aktivierenden Einfluss auf den Promotor hat. Da die Bindungsstelle dieses aktivierenden Proteins mit der des IE2 Proteins überlappt, ist es möglich, dass das IE2-Protein die Bindung des Aktivators verhindert. (Huang und Stinski, 1995;Macias et al., 1996).

Innerhalb des MIE Promotor/Enhancers sind weitere crs-ähnliche IE2-Bindungsstellen identifiziert worden. Sie liegen im Bereich von –240 bzw. –170 und können in transienten Transfektionsexperimenten zur Repression des Promotors durch IE2 mit beitragen (Huang und Chen, 2002).

Auch im Promotor des US3-Gens, welches ebenfalls ein immediate early Gen ist, konnte eine crs unmittelbar vor dem Transkriptionsstart identifiziert werden (Biegalke, 1995). Eine Mutation dieser crs führt im viralen Kontext zu einer gesteigerten US3-Genexpression zu späten Zeitpunkten der Infektion (Lashmit et al., 1998).

1.1.9 Das IE2-Protein

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Das IE2-Protein repräsentiert den wichtigsten Regulationsfaktor innerhalb des lytischen Infektionszyklus. Es ist ein essentieller Transaktivator der viralen Genexpression und vermittelt die Repression des MIE Promotors zu späten Zeiten der Infektion. In Übereinstimmung damit können HCMV-Mutanten, in denen das IE2-Protein deletiert oder durch Mutationen inaktiviert ist, keinen produktiven Replikationszyklus vollziehen, da die Aktivierung der early Gene blockiert ist (Heider et al., 2002;Marchini et al., 2001;White et al., 2004).

Modifikationen

Das IE2-Protein ist zahlreichen posttranslationalen Modifikationen unterworfen. Dies führt vermutlich auch dazu, dass es trotz einer errechneten Molekülmasse von ca. 64 kDa im SDS-Polyacrylamidgel bei einer Größe von 82 bis 86 kDa auftritt. Im IE2-Protein befinden sich mehrere Glykosylierungsstellen und insgesamt über 100 Serine, Threonine und Tyrosine, die potentiell durch Proteinkinasen phosphoryliert werden können. Für einige dieser Aminosäuren konnte nachgewiesen werden, dass sie in vivo und in vitro durch zelluläre Kinasen phosphoryliert werden (Harel und Alwine, 1998). Allerdings ist noch unklar, welche Bedeutung die Phosphorylierung einzelner Aminosäuren für die Funktionalität des Proteins hat. Ein Virus, bei dem einzelne Phosphorylierungsstellen im IE2-Protein mutiert wurden, zeigte kein verändertes Wachstumsverhalten (Heider et al., 2002).

Zusätzlich kann das IE2-Protein durch eine kovalente Bindung an die Ubiquitin-Homologe SUMO-1 und SUMO-2 modifiziert werden (Ahn et al., 2001;Hofmann et al., 2000;Lee et al., 2003), was zum Auftreten einer 105 kDa-Variante des IE2-Proteins führt. Diese sogenannte SUMOylierung scheint die Transaktivierung des Proteins zu beeinflussen. Bei einer Mutation der bisher identifizierten SUMOylierungs-Stellen an Aminosäure 175 und 180 kommt es zu einer Reduktion der Transaktivierungsfähigkeit (Hofmann et al., 2000). Die genaue Funktion der IE2-SUMOylierung während der Infektion ist jedoch noch unklar.

Transaktivierung

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IE2 kann zusammen mit IE1 synergistisch verschiedene early und late Promotoren aktivieren. Darüber hinaus fungiert IE2 allein auch als promiskuöser Transaktivator zahlreicher Promotoren zellulären oder viralen Ursprungs, wie z.B. des zellulären Cyclin E Promotors, des c-fos Promotor sowie des HIV-LTR Promotor (dargestellt in (Mocarski, 2001;Spector, 1996;Stenberg, 1996).

Die Mechanismen der IE2-vermittelten Transaktivierung sind nicht in allen Einzelheiten bekannt. IE2 scheint auf verschiedenen Wegen aktivieren zu können, hierbei sind sowohl Protein-Protein- als auch Protein-DNA-Interaktionen beteiligt. Einige Promotoren, wie der zelluläre c-fos Promotor, der hsp70-Promotor und der HIV-LTR-Promotor, werden durch IE2 über einen TATA-Box-abhängigen Mechanismus aktiviert. Die wird vermutlich über eine Interaktion des IE2 mit basalen Transkriptionsfaktoren wie TFIIB (Caswell et al., 1993) und TBP (Hagemeier et al., 1992;Jupp et al., 1993) vermittelt. So scheint das IE2-Protein als eine Art Adapter zu fungieren, der die TFIID-assoziierten Faktoren auf dem Promotor stabilisiert. Darüber hinaus kann es selbst auch TAF-ähnliche Funktionen übernehmen (Lukac et al., 1997).

Das IE2-Protein kann auch mit Promotor-spezifischen Transkriptionsfaktoren wie z.B. CREB (Lang et al., 1995;Schwartz et al., 1996), AP-1 (Scully et al., 1995), Egr-1 (Yoo et al., 1996) oder Sp1/Pu.1 (Wara-aswapati et al., 1999) interagieren und auf diese Weise eine Promotoraktivierung vermitteln.

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Neben der Interaktion mit Transkriptionsfaktoren scheint die direkte DNA-Bindung bei der Transaktivierung eine Rolle zu spielen. In einigen Promotoren, wie dem frühen UL112/113 Promotor sowie dem zellulären Cyclin E Promotor, konnten crs-ähnliche Sequenzen identifiziert werden. Sie ermöglichen die Bindung von IE2 und tragen so zur Promotoraktivierung bei (Arlt et al., 1994;Bresnahan et al., 1998;Schwartz et al., 1994). Im UL112/113 Promotor befinden sich drei starke IE2-Bindungsstellen im Bereich zwischen –290 bis –120 relativ zum Transkriptionsstart und eine schwächere Bindungsstelle zwischen Position –71 und –66. Eine Deletion der Bindungsstellen im Bereich zwischen –290 und –120 führt zu einer Reduktion der IE2-vermittelten Aktivierung des Promotors, allerdings kann der verbleibende Promotor immer noch signifikant aktiviert werden. Wie sich zeigte, wird die Aktivierung hier im wesentlichen über eine ATF/CREB Bindungsstelle (Nukleotide –78 bis –56) erreicht, da das IE2 Protein direkt mit CREB wie auch mit p300 und dem CREB-bindenden Protein (CBP) interagieren kann (Lang et al., 1995;Schwartz et al., 1996). Während der viralen Infektion scheinen, je nach Zeitpunkt, beide Mechanismen der Aktivierung zum Einsatz zu kommen (Rodems et al., 1998).

Ein weiterer Mechanismus der Transaktivierung besteht in der Interaktion des IE2-Proteins mit Chromatin-modellierenden Faktoren. Histon-Acetyltransferasen führen zur Acetylierung der Histone, was die Histon-DNA-Interaktion abschwächt und zu einer Lockerung der Chromatinstruktur führt (Loidl, 1994). In vivo ist eine solche Hyperacetylierung verbunden mit einer Aktivierung der Genexpression (Hebbes et al., 1988;Pazin und Kadonaga, 1997;Turner, 1991). Von einigen Transkriptionsfaktoren, wie z.B. CREB und p300, konnte bereits gezeigt werden, dass sie intrinsische Histon-Acetyltransferase-(HAT-) Aktivität besitzen (Bannister und Kouzarides, 1996;Martinez-Balbas et al., 1998;Ogryzko et al., 1996). Auch das IE2-Protein scheint in der Lage zu sein, über Interaktion mit Histon-Acetyltransferasen Einfluss auf die Chromatinstruktur zu nehmen. So lässt sich sowohl in HCMV-infizierten wie auch in IE2-transfizierten Zellen HAT-Aktivität ko-immunopräzipitieren. Darüber hinaus konnte die direkte Interaktion des IE2-Proteins mit der Histon-Acetyltransferase P/CAF nachgewiesen werden (Bryant et al., 2000;Klucher et al., 1993).

Weitere Interaktionspartner des IE2-Proteins sind zellzyklus-regulatorische Proteine wie das Rb-Protein sowie p53, wenngleich die biologische Funktion dieser Interaktionen noch unklar ist. IE2 bindet pRb (Hagemeier et al., 1994;Sommer et al., 1994) und kann seine repressorische Wirkung auf E2F-responsive Promotoren aufheben (Fortunato et al., 1997;Hagemeier et al., 1994). In Rb-negativen Saos-2-Zellen kann IE2 die Ausbildung eines „flat cell“ Phänotyps, der durch pRb Überexpression erzeugt wird, entgegenwirken (Fortunato et al., 1997).

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IE2 konnte auch im Komplex mit p53 nachgewiesen werden (Speir et al., 1994) und kann dessen Funktion als transkriptioneller Aktivator inhibieren. Die biologische Funktion dieser Interaktion ist allerdings noch unklar. Die Checkpoint-Funktion des p53 wird durch seine Interaktion mit dem IE2 nicht beeinträchtigt (Bonin und McDougall, 1997) und mögliche anti-apoptotische Aktivitäten, die für das IE2 Protein beschrieben worden sind, scheinen nicht von p53 abhängig zu sein (Zhu et al., 1995).

Autorepression

Zusätzlich zu seiner Rolle als essentieller Transaktivator fungiert das IE2 Protein auch als transkriptioneller Repressor seines eigenen Promotors. Wie bereits erläutert ist hierfür die Bindung des IE2 an die crs verantwortlich. Die IE2-vermittelte Repression des MIE Promotors ist in verschiedenen Zellsystemen nachgewiesen worden (Hermiston et al., 1990;Macias und Stinski, 1993;Pizzorno und Hayward, 1990;Pizzorno et al., 1991;Pizzorno et al., 1988;Stenberg et al., 1990). Schwierigkeiten bereitete jedoch lange Zeit der direkte Nachweis der DNA Bindung, da in Zellextrakten von IE2-transfizierten oder HCMV-infizierten Zellen bzw. mit in vitro translatiertem IE2-Protein keine DNA-Bindung beobachtet werden konnte (Chiou et al., 1993). Aus diesem Grunde wurden die meisten Studien hierzu mit IE2-Protein, welches in bakteriellen Systemen exprimiert wurde, durchgeführt. Mit Hilfe dieser rekombinanten Proteine, aber auch in einem Yeast-One-Hybrid Assay konnte so die IE2-DNA-Bindung untersucht werden (Ahn et al., 1998;Chiou et al., 1993;Jupp et al., 1993;Lang und Stamminger, 1993;Waheed et al., 1998). Ein mögliche Ursache für die beobachteten Schwierigkeiten könnte in den besonderen Bindungseigenschaften des IE2-Proteins begründet sein. IE2 bindet an die DNA über Interaktionen mit der kleinen Furche (Lang und Stamminger, 1994) und diese Bindung ist sensitiv gegenüber bestimmten nicht-spezifischen Kompetitor-DNAs wie poly(dIdC)·(dIdC) (Chiou et al., 1993;Lang und Stamminger, 1993). Bei einem Vergleich der bisher identifizierten IE2-DNA-Bindungsstellen fällt zudem auf, dass es keine eigentliche Konsensussequenz gibt. So scheint die Bindung des IE2-Proteins weniger durch die exakte Sequenz als durch strukturelle Eigenschaften der DNA bestimmt zu werden (Lang und Stamminger, 1994). In einer Studie wurde eine mögliche Maskierung der Bindungsaktivität des IE2 durch posttranslationale Phosphorylierung diskutiert (Waheed et al., 1998), von anderer Seite konnte jedoch eine Bindung des IE2 nachgewiesen werden, wenn das Protein aus Extrakten von transient transfizierten non small cell lung cancer Zellen (NCI-H1299) über eine Heparin-Sepharose Cl6B Säule aufgereinigt wurde (Huang und Chen, 2002). Dies ist möglicherweise ein Hinweis darauf, dass die in vitro Bindungsfähigkeit durch die Art der Präparation der Proteinextrakte beeinflusst wird.

Zellzyklusregulation

Wie bereits erwähnt wurde, konnte in neueren Untersuchungen gezeigt werden, dass IE2 auch zellzyklusregulatorische Aktivitäten besitzt, deren Effekte denen des HCMV ähnlich sind. Die transiente Expression des IE2-Proteins führt in verschiedenen Zelllinien und auch in primären Fibroblasten zu einem Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang (Kronschnabl et al., 2002;Murphy et al., 2000;Noris et al., 2002;Wiebusch und Hagemeier, 1999;Wiebusch und Hagemeier, 2001). Dieser Zellzyklusarrest findet in der Gegenwart von erhöhten Cyclin E-Leveln statt (Wiebusch et al., 2003;Wiebusch und Hagemeier, 2001). Zudem sind, ähnlich wie in HCMV infizierten Zellen, die mRNA Level zahlreicher in den Nukleotidmetabolismus und die DNA Replikation involvierter Gene erhöht (Song und Stinski, 2002). In Übereinstimmung damit kann IE2 in quieszenten Zellen den Wiedereintritt in den Zellzyklus und die S-Phase induzieren (Castillo et al., 2000;Sinclair et al., 2000). So scheint IE2, ähnlich wie das HCMV, sowohl pro- als auch antiproliferative Aktivitäten in sich zu vereinen (Wiebusch et al., 2003).

1.1.10 Struktur-Funktionsanalysen des IE2-Proteins

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Aufgrund seiner essentiellen Rolle während des Replikationszyklus sowie seiner zahlreichen Funktionen stand das IE2-Protein im Mittelpunkt vieler Untersuchungen. Ein wesentliches Ziel war und ist dabei die Identifikation der funktionellen Domänen innerhalb des Proteins und die Frage nach der biologischen Relevanz einzelner Funktionen. Da es nicht möglich ist, replikationsfähige IE2-defiziente Viren zu generieren, und komplementierende Zelllinien nicht zur Verfügung stehen, beruhen die meisten Studien auf transienten Transfektionssystemen. Zwar gibt es mittlerweile auch Untersuchungen mit rekombinanten Viren, deren IE2 mutiert ist, doch hat sich gezeigt, dass die beobachteten Effekte nur sehr eingeschränkt auf den Wegfall einzelner Funktionen, mit Ausnahme der Transaktivierung, zurückzuführen sind (Heider et al., 2002;Sanchez et al., 2002;White et al., 2004). Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des IE2 Proteins und seiner funktionellen Domänen.

Abb. 3: Regulatorische Domänen des HCMV IE2-Proteins

Schematische Darstellung des IE2-Proteins und die Lage seiner funktionellen und Protein-bindenden Domänen. Das IE2-Protein besitzt zwei Signalsequenzen für die nukleäre Lokalisation (NLS, Aminosäuren (AS) 145-151 und 313-346) und am N- sowie am C-Terminus jeweils eine unabhängige, azide Aktivierungsdomänen (AD). Eine postulierte Zinkfingerdomäne (pZF) befindet sich zwischen AS 428 und 452.

Das IE2-Protein besitzt zwei Signalsequenzen für die nukleäre Lokalisation (NLS) zwischen den AS 145-151 und AS 313 –346, von denen mindestens eine vorhanden sein muss, um die Lokalisation im Zellkern zu gewährleisten (Pizzorno et al., 1991).

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Zwei unabhängige, azide Transaktivierungsdomänen am N- und am C-Terminus sind essentiell für die Transaktivierung (Pizzorno et al., 1991). Darüber hinaus ist jedoch fast die gesamte C-terminale Hälfte des Proteins, beginnend von Aminosäure 195, in die Transaktivierung involviert (Malone et al., 1990;Pizzorno et al., 1991;Stenberg et al., 1990). Innerhalb der Transaktivierungsdomäne befinden sich auch die Sequenzen, die für die Interaktion mit basalen Transkriptionsfaktoren verantwortlich sind. So erfordert die Bindung an TFIIB die Aminosäuren 290 bis 542 (Caswell et al., 1993) und die Bindung an TBP die Aminosäuren 290 bis 504 sowie 47 bis 153 (Caswell et al., 1993;Jupp et al., 1993). Zusätzlich scheint diese Region an der Interaktion des IE2 mit Promotor-spezifischen Transkriptionsfaktoren beteiligt zu sein, so ist z.B. die minimale CREB Bindungsdomäne zwischen Aminosäure 290 und 410 lokalisiert worden (Lang et al., 1995). Die für die Autoregulation und DNA Bindung verantwortlichen Proteindomänen liegen ebenfalls im C-Terminus des Proteins. Die Autoregulation erfordert den Bereich zwischen Aminosäure 290 und 579 (Hermiston et al., 1990;Pizzorno et al., 1991;Stenberg et al., 1990). Die DNA-Bindungsdomäne liegt innerhalb dieser Region und reicht von Aminosäure 346 bis 579 (Chiou et al., 1993). Allerdings scheinen auch Sequenzen außerhalb dieser Domäne einen Einfluss auf die DNA-Bindungsfähigkeit des IE2 Proteins zu besitzen, da eine interne Deletion zwischen Aminosäure 313 und 346 in einem yeast one hybrid-Assay, zu einem Verlust der DNA-Bindung führte (Ahn et al., 1998). Rückschlüsse darauf, welche Bereiche des Proteins in Autoregulation und DNA-Bindung involviert sind, ermöglichten auch die Untersuchungen der IE2-Isoformen IE55 und IE2p40. Das IE55 Protein ist nicht in der Lage, den MIE Promotor zu reprimieren. Es aktiviert ihn vielmehr und gleicht damit in seiner Funktion dem IE1-Protein (Baracchini et al., 1992). Da dem IE55 im Vergleich zum IE2 lediglich die Aminosäuren 365 bis 519 fehlen, scheint diesen eine besondere Bedeutung bei der Vermittlung dieser Funktionen zuzukommen. Das late IE2p40-Protein hingegen, welches durch die Transkription von einem internen Promotor generiert wird und die C-terminalen 338 Aminosäuren IE2 Proteins enthält, ist in der Lage, den MIE Promotor zu reprimieren (Jenkins et al., 1994). Wie gezeigt werden konnte, erfolgt die Bindung des IE2-Proteins an die DNA als Dimer und eine Mutation innerhalb der Dimerisierungsdomäne, die sich zwischen AS 388 und 542 befindet, führt zu einem Verlust der DNA-Bindung (Ahn et al., 1998;Chiou et al., 1993). Eine besondere Rolle bei der DNA-Bindung wurde einer postulierten Zinkfingerdomäne zwischen den Aminosäuren 428 und 452 zugeschrieben. Hierbei handelt es sich um einen singulären Cystein-Histidin-Zinkfinger. Untersuchungen haben gezeigt, dass durch Mutation entweder der Cysteine oder der Histidine sowohl die DNA-Bindung als auch die Fähigkeit zur Autoregulation komplett zerstört wird (Bresnahan et al., 1998;Jupp et al., 1993;Macias et al., 1996;Macias und Stinski, 1993;Tsai et al., 1997).

Auch die Zellzyklusarrestfunktion scheint hauptsächlich durch den C-Terminus des Proteins vermittelt sein werden (Wiebusch und Hagemeier, 1999).

Im Gegensatz zu den bisher genannten Funktionen, sind die für die p53- und pRB- Bindung erforderlichen Aminosäuren hauptsächlich im N-Terminus des IE2 Proteins lokalisiert. Die Bindung an p53 erfolgt über die Aminosäuren 1-135 und in verschiedenen Studien konnten drei Bereiche identifiziert werden, die für die pRb-Bindung verantwortlich sind: AS 85-135, AS 136-290, AS 291-364 (Sommer et al., 1994) oder AS 290-390 (Hagemeier et al., 1994).

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Wie Abbildung 3 zeigt, scheint vor allem der C-Terminus ein besondere Rolle für die Funktionsfähigkeit des Proteins zu spielen. Da hier eine Vielzahl der regulatorischen Domänen zu überlappen scheint, erschwert dies eine gezielte Analyse einzelner Aktivitäten. Allerding sind noch immer nicht alle funktionellen Domänen im Detail charakterisiert, da sie teilweise nur mittels größerer Mutationen analysiert wurden. Feinere Mutationsanalysen des IE2-Proteins sollten daher dazu beitragen, das in Abbildung 3 dargestellte Schema zu präzisieren.

1.2 Zielsetzung der Arbeit

Das HCMV IE2 Protein ist ein multifunktionales Protein, das essentiell für den lytischen Infektionszyklus ist. Somit sind Viren, in denen das IE2 Protein deletiert oder schwerwiegend mutiert wurde, nicht replikationsfähig (Heider et al., 2002;Marchini et al., 2001). Gleichzeitig stehen, wahrscheinlich aufgrund des IE2-vermittelten Zellzyklusarrests, stabil exprimierende Zelllinien nicht zur Verfügung, um den IE2-Verlust in trans zu komplementieren. Da gerade im C-Terminus des Proteins zahlreiche regulatorische Domänen zu überlappen scheinen, stellt dies eine weitere Schwierigkeit bei der spezifischen Analyse einzelner Funktionen dar.

Aus diesem Grunde ist eine präzise Kenntnis der funktionellen Domänen im IE2-Protein absolut notwendig, wenn es darum geht, einzelne Funktionen gezielt zu manipulieren, um ihre physiologische Bedeutung zu untersuchen. Bisher ist ein solch gezieltes Ausschalten von Funktionen, mit Ausnahme der Transaktivierung, nicht möglich. Nicht alle funktionellen Domänen sind im Detail untersucht und charakterisiert worden und Informationen zur Struktur des Proteins stehen noch nicht zur Verfügung. Bei bisher publizierten rekombinanten Zytomegalieviren mit mutiertem IE2 Protein konnten die beobachteten Effekte daher nur bedingt auf den Verlust einzelner Funktionen zurückgeführt werden (Heider et al., 2002;Sanchez et al., 2002;White et al., 2004).

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Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte deshalb eine Struktur-Funktionsanalyse des HCMV IE2 Proteins durchgeführt werden. Ziel der Analyse war es, die unterschiedlichen funktionellen Domänen des IE2 Proteins zu definieren und zu untersuchen, inwieweit diese Domänen überlappen oder strukturell unabhängig sind. Dies sollte als Hinführung zur Identifikation diskriminierender Mutationen dienen, die zukünftig im viralen Kontext untersucht werden sollen. Im Fokus der Untersuchungen standen die Zellzyklusarrest-Funktion, die Transaktivierung, sowie die Autorepression und DNA-Bindung. Alle diese Aktivitäten sollten innerhalb des gleichen experimentellen Systems, nämlich der Expression in permissiven Zellen, untersucht werden. Da ein adäquater Assay für die DNA-Bindung noch nicht zur Verfügung stand, musste ein entsprechendes System zunächst etabliert werden.


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12.10.2006