Ergebnisse

↓55

Zur Durchführung der IE2-Struktur-Funktionsanalyse wurde die Aktivität verschiedener IE2-Mutanten im Vergleich zum Wildtypprotein untersucht. Im ersten Teil der Arbeit standen hierbei der Zellzyklusarrest, die Transaktivierungsfähigkeit und die Autoregulation im Mittelpunkt, wobei hauptsächlich bereits etablierte experimentelle Assays zum Einsatz kamen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Untersuchungen auf die DNA-Bindung des IE2-Proteins ausgedehnt. Da ein adäquater DNA-Bindungsassay hier nicht zur Verfügung stand, musste dieser zunächst etabliert werden.

3.1  Experimentelles System - Aktivitäten des Wildtyp IE2-Proteins

↓56

Sämtliche Experimente wurden in HCMV-permissiven U373-Zellen durchgeführt. Diese von einem Astrozytom abstammende Zelllinie gehört neben primären Fibroblasten zu den wenigen bekannten Zelllinien, die permissiv für HCMV sind (Jault 1994, Poland 1990). Aufgrund der bereits beschriebenen Schwierigkeiten, IE2 stabil in Zellen zu exprimieren, wurde auf ein transientes Transfektionssystem zurückgegriffen. Die hierbei verwendete IE2-cDNA entstammt dem HCMV-Stamm AD169.

Abbildung 4 zeigt die Aktivitäten des entsprechenden Proteins in den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchsassays. Wird IE2 transient in U373-Zellen exprimiert, so führt dies zu einem Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang. Ein derartiger Arrest ist in verschiedenen Zellen und experimentellen Systemen demonstriert worden (Kronschnabl et al., 2002;Murphy et al., 2000;Noris et al., 2002;Wiebusch und Hagemeier, 1999;Wiebusch und Hagemeier, 2001). In BrdU-Einbau-Experimenten, die den Nachweis neu-synthetisierter DNA erlauben, beobachtet man bei den IE2-transfizierten Zellen einen Anstieg der Population in der sehr frühen S-Phase (Wiebusch und Hagemeier, 2001). Wird der DNA-Gehalt der Zellen hingegen mittels Propidiumjodidfärbung bestimmt, so reicht die Auflösung des Signals in der FACS-Analyse nicht aus, um zwischen den Zellen der späten G1-Phase und der frühen S-Phase zu unterscheiden. Daher beobachtet man nach IE2-Transfektion einen Anstieg des G1-Peaks, da in diesem auch die Zellen der frühen S-Phase enthalten sind. In der vorliegenden Arbeit wurden alle Zellzyklusanalysen mittels Propidiumjodidfärbung durchgeführt, da diese Methode präzise genug ist, wenn lediglich die Fähigkeit zur Induktion eines Zellzyklusarrests untersucht und zwischen aktiven und inaktiven Mutanten unterschieden werden soll.

Abb. 4: Aktivitäten des HCMV IE2 Proteins

(A) Zellzyklusarrest. U373-Zellen wurden mit dem leeren Kontrollvektor (pSG5-3HA) oder dem IE2-Expressionsvektor (pSG5-3HA-IE2) transfiziert und 48 h nach Transfektion geerntet. Die Zellzyklusverteilung der transfizierten-Zellen wurde mittels Durchflußzytometrie und mithilfe der CellQuest Software ermittelt. In den Histogrammen ist der prozentuale Anteil der Zellen in der G1-, S- und G2-Phase angegeben. Der Arrest in IE2-transfizierten Zellen wird in einer solchen Darstellung deutlich im Anstieg des G1-Peaks (hier von 43% in SG5 auf 69% bei IE2). (B) Transaktivierung des UL112/113 Promotors. Zusammen mit dem IE2- bzw. SG5-Expressionsvektor wurden die Zellen mit einem UL112/113-Promotorkonstrukt (pHM142) transfiziert, dem als Reporter das Luciferasegen nachgeschaltet ist. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, die Luciferaseaktivität bestimmt und so die Aktivierung des Promotors ermittelt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 3 verschieden Transfektionen, wobei unterschiedliche DNA Präparationen zum Einsatz kamen. (C) Transaktivierung des c-fos- Promotors. Zusammen mit dem IE2- bzw. SG5-Expressionsvektor wurden die Zellen mit einem c-fos-Promotorkonstrukt (pfosCAT) transfiziert, dem als Reporter das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen nachgeschaltet ist. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und die CAT-Aktivität als Maß für die Promotoraktivierung bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 3 verschieden Transfektionen. (D) Autorepression des Major-Immediate-Early-(MIE-) Promotors. Zusammen mit dem IE2- bzw. pSG5-Expressionsvektor wurden die Zellen mit einem MIE-Promotorkonstrukt (pRR55) transfiziert, dem als Reporter das CAT-Gen nachgeschaltet war. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet und die CAT-Aktivität bestimmt. Dargestellt ist die relative Promotoraktivität im Vergleich zu kontroll-transfizierten Zellen (SG5). Transfektionen wurden viermal wiederholt, wobei unterschiedliche DNA-Präparationen zum Einsatz kamen. (E) Autorepression des MIE-Promotors bei mutierter crs. U373-Zellen wurden wie unter (D) beschrieben mit einem MIE Promotorkonstrukt (pRR55mut) transfiziert, bei dem die crs so mutiert ist, dass eine Bindung des IE2-Proteins nicht mehr möglich ist.

↓57

Abbildung 4A zeigt ein typisches Histogramm einer FACS-Analyse IE2- bzw. kontroll-transfizierter Zellen. Bei Transfektion des leeren Kontrollvektors pSG5, sind 43% der transfizierten Zellen dem G1-Peak zuzuordnen, der die Zellen der G1 und der frühen S-Phase enthält. In den IE2-transfizierten Zellen steigt der Anteil der Zellen im G1-Peak aufgrund des Anstiegs der Zellen in der frühen S-Phase 69% an. Der Prozentsatz der Zellen innerhalb des G1-Peaks ist demnach um 60 % angestiegen. Um verschiedene IE2 Mutanten in ihrer Zellzyklusarrestaktivität mit dem Wildtyp Protein vergleichen zu können, wurde der durch das Wildtyp IE2-Protein induzierte Anstieg im G1-Peak als 100 % Wildtyp-Aktivität definiert und die Aktivität der Mutanten entsprechend berechnet.

Die Transaktivierungsfähigkeit wurde mit Hilfe des frühen HCMV-Promotors UL112/113 untersucht (siehe Abb.4B). Wie bereits in der Einleitung erläutert, wird dieser Promotor durch das IE2-Protein sowohl über eine ATF/CREB- als auch über mehrere IE2-Bindungsstellen aktiviert (Arlt et al., 1994;Lang et al., 1995;Schwartz et al., 1996;Schwartz et al., 1994).

Das von uns verwendete UL112/113 Promotorkonstrukt, pHM142, enthält die Nukleotide –352 bis +37 des UL112/113 Promotors, dem das Luciferasegen als Reporter nachgeschaltet ist. Dieses Konstrukt enthält sowohl die beschriebenen IE2- als auch die ATF/CREB- Bindungsstelle. Wird es zusammen mit einem IE2 Expressionsplasmid in die U373 Zellen transfiziert, so ist im Lucifaseassay eine 50-bis 60-fache Induktion des Promotors im Vergleich zu Kontroll-transfizierten Zellen (Abb.4B) zu beobachten. Um die IE2 Mutanten in ihrer Aktivität mit dem Wildtyp Protein vergleichen zu können, wurde eine solche, durch den Wildtyp vermittelte Aktivierung des Promotors als 100 % Wildtypaktivität definiert und die Aktivitäten der Mutanten entsprechend berechnet. Um der Tatsache Rechnung zu tragen, dass das IE2-Protein auf verschiedenste Weise zur Promotoraktivierung führen kann, wurde die Transaktivierung eines weiteren Promotors getestet. Verwendet wurde hierfür der zelluläre c-fos Promotor, dessen Transaktivierung über Interaktionen des IE2-Proteins mit basalen Transkriptionsfaktoren vermittelt wird. Das eingesetzte Promotorkonstrukt (pfosCAT) enthält den murinen c-fos-Promotor, dem das Gen für die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) als Reporter nachgeschaltet ist. Bei einer Kotransfektion zusammen mit einem IE2-Expressionsplasmid ist eine ca. 70-fache Aktivierung des Promotors durch das IE2-Protein zu beobachten (Abb. 4C)

↓58

Die Fähigkeit zur Repression des MIE Promotor/Enhancer wurde mithilfe eines Reporterkonstrukts (pRR55) bestimmt, welches die IE1/IE2 Promotor/Enhancer Region des HCMV AD169 enthält, und zwar den Bereich zwischen Position –671 und +52 relativ zur Transkriptionsstartstelle. Diesem Promotor ist ebenfalls das CAT-Gen als Reporter nachgeschaltet. Wird dieses Konstrukt zusammen mit dem leeren Kontrollvektor pSG5 in U373-Zellen transfiziert, so zeigt der MIE Promotor eine hohe Basalaktivität (Abb.4D). Eine Kotransfektion mit einem IE2-Expressionsvektor jedoch führt zu einer ausgeprägten Repression. Wie in Abb.4D dargestellt, wurde die Aktivität des Promotors in kontroll-transfizierten Zellen als 100 % Promotoraktivität definiert und dies als Referenzwert verwendet. In Anwesenheit des IE2-Proteins sinkt diese Aktivität durch die Autorepression auf nur noch 10–20% ab.

Dass die in den IE2-transfizierten Zellen beobachtete Repression des MIE Promotors auf die Bindung des IE2-Proteins an die crs zurückzuführen ist, zeigt Abbildung 4E. Hier wurde ein Promotorkonstrukt verwendet (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von S. Prösch, Institut für Virologie, Charité, Berlin), das dem pRR55 entspricht, bei dem jedoch die crs mutiert ist, so dass eine Bindung des IE2-Proteins nicht mehr möglich ist. Hier bleibt die Promotoraktivität nahezu unverändert.

3.2 Struktur-Funktionsanalyse des IE2-Proteins

Wie bereits gezeigt werden konnte, spielt der C-Terminus des IE2-Proteins auch für den Zellzyklusarrest eine wichtige Rolle, da seine Deletion bis zur Aminosäure (AS) 450 (1-450) zu einem Aktivitätsverlust führt. Im Gegensatz dazu ist eine IE2-Mutante, bei der lediglich die letzten 36 AS deletiert wurden, noch in der Lage, einen Zellzyklusarrest zu induzieren (Wiebusch und Hagemeier, 1999). Um genauer zu definieren, wo zwischen AS 450 und 544 die Grenze dieser zellzyklusregulatorischen Domäne liegt, wurde dieser Bereich mittels C-terminaler Deletionsmutanten weiter untersucht. Diese Mutanten sind in Abbildung 5A schematisch dargestellt, ihre Expressionslevel zeigt Abb. 5B. Die Aktivität dieser Mutanten bezüglich der Induktion eines Zellzyklusarrests wurde relativ zum Wildtypprotein bestimmt. Das Ergebnis ist in Abbildung 5C dargestellt.

↓59

Abb. 5: Einfluss C-terminaler Sequenzen auf die Zellzyklusarrest-Aktivität des IE2 Proteins.

(A) Schematische Darstellung der Deletionsmutanten. (B) U373 Zellen wurden mit den jeweiligen Deletionskonstrukten transfiziert und 48h später geerntet. Ein Aliquot der Zellen wurde für die Präparation von Zellextrakten verwendet, der Rest für die durchflußzytometrische Analyse. Zur Bestimmung der Expressionslevel wurden gleiche Proteinmengen gelelektrophoretisch aufgetrennt und die Menge des IE2 Proteins durch Immunoblot-Analyse mittels eines gegen das HA-Epitop gerichteten Antikörpers nachgewiesen (C) Relative Aktivität der IE2-Mutanten bezüglich Induktion eines Zellzyklusarrests im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Die Zellzyklusverteilung der transfizierten Zellen wurde wie beschrieben mittels FACS-Analyse ermittelt und der prozentuale Anstieg des G1-Peaks als Maß für den Zellzyklusarrest bestimmt. Der bei dem wt IE2-Protein beobachtete Effekt wurde als 100 % wt-Aktivität definiert und die Aktivität der Mutanten relativ dazu bestimmt. Dargestellt ist das Ergebnis aus mindestens 3 unabhängigen Transfektionen sowie die Standardabweichung.

Die Mutante 1-544 führte in den transfizierten Zellen zu einen Zellzyklusarrest, ihre Aktivität lag bei ca. 80 % des Wildtypproteins. Dem gegenüber führte eine weitere Deletion um 30 Aminosäuren zu einem deutlichen Funktionsverlust. Die Mutante 1-513 weist nur noch 40% der Wildtyp-Aktivität auf. Eine weitere Verkürzung des Proteins hat nur noch geringe Effekte. Die Aktivität der restlichen Mutanten liegt bei ca. 30 % des Wildtyps. Aufgrund der Limitierungen des Assays wurde diese Restaktivität als vernachlässigbar und die Mutanten dementsprechend als inaktiv eingestuft.

Bei den Expressionsleveln der Mutanten fallen teilweise Schwankungen im Vergleich zum Wildtyp auf. Diese sind jedoch nicht für die beobachteten Funktionsverluste verantwortlich, da in voran gegangenen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass auch bei geringeren Expressionsleveln die IE2-Proteinmenge nicht limitierend ist (Wiebusch, 2001). Expressionsschwankungen dieser Art wurden zudem auch bei anderen Mutanten beobachtet, (siehe Abb. 7 B, del430 versus Wildtyp), ohne dass sie mit einem Funktionsverlust assoziiert waren.

↓60

Daher ist davon auszugehen, dass vor allem die Sequenzen zwischen Aminosäure 497 und 544 eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung des Zellzyklusarrests spielen, wobei der größte Funktionsverlust zwischen den Mutanten 1-543 und 1- 513 zu beobachten war.

Durch den Verlust der C-terminalen aziden Aktivierungsdomäne ist bereits die Mutante mit der kleinsten Deletion, 1-543, transkriptionell inaktiv (Pizzorno et al., 1991;Wiebusch und Hagemeier, 1999). Zudem ist sie nicht mehr in der Lage, den MIE Promoter zu reprimieren (Hermiston et al., 1990;Stenberg et al., 1990). Daher ist davon auszugehen, dass auch die anderen nächst kürzeren C-terminalen Deletionsmutanten inaktiv in Bezug auf Transaktivierung und Autorepression sind, weshalb von ihrer weiteren Analyse abgesehen wurde. Der äußerste C-Terminus enthält demzufolge wichtige Sequenzen für die Transaktivierung und die Autoregulation, während die Zellzyklusarrestfunktion durch eine Deletion dieser Sequenzen nicht wesentlich beeinträchtigt wird. In diesem Bereich des Proteins ist somit zumindest die zellzyklusregulatorische Domäne von den anderen beiden klar abzugrenzen. Unklar ist jedoch, wie weit sich die für die Transaktivierung und Autoregulation benötigten Domänen in Richtung N-terminal der Aminosäure 544 erstrecken.

Um zu untersuchen, ob in dem Bereich zwischen AS 497 und 544 eine Trennung der verschiedenen Aktivitäten möglich ist, wurden kleinere Manipulationen vorgenommen. Hierfür wurden jeweils 7 aufeinanderfolgende Aminosäuren durch Alanine ersetzt. In diesen Mutanten bleibt die C-terminale Aktivierungsdomäne intakt, so dass potentiell die Möglichkeit gegeben ist, dass sie sowohl transaktivieren als auch autoreprimieren können.

↓61

Die Mutanten und die Position der Aminosäure-Austausche sind schematisch in Abbildung 6A dargestellt. Angegeben in der Bezeichnung der Mutanten ist jeweils die erste Aminosäure, die durch Alanin ersetzt wurde, bei der Mutante pm501 sind dies demnach die Aminosäure 501-507. Wie in Abbildung 6B zu sehen, zeigen die Mutanten dem Wildtyp vergleichbare Expressionslevel.

In Abbildung 6C ist die relative Zellzyklusarrestaktivität der Mutanten dargestellt. Alle Mutanten zeigen hier einen deutlichen Funktionsverlust. Ihre Aktivität liegt im Durchschnitt bei 50% des Wildtyps, sie besitzen demnach noch eine geringe Restaktivität. Bezüglich der Transaktivierung zeigen ebenfalls alle Mutanten das gleiche Bild (Abb. 6D). Trotz der Anwesenheit der Aktivierungsdomäne ist die Transaktivierungsfähigkeit durch die relativ kleinen Aminosäureaustausche gänzlich verloren gegangen. Wie Abbildung 6E zeigt, ist auch die Fähigkeit zur Autorepression des MIE Promotors durch die Mutationen stark beeinträchtigt worden. In IE2-transfizierten Zellen sinkt die Promotoraktivität durch die Repression des IE2-Proteins auf 10-20%. Bei den Mutanten hingegen ist keine ausgeprägte Repression des Promotors zu erkennen, die Aktivität des Promotors liegt bei 70-80%.

Abb. 6: Überlappung regulatorischer Domänen im C-Terminus des IE2-Proteins: Zellzyklusarrest, Transaktivierung und Autorepression.

(A) Schematische Darstellung der verwendeten Mutanten. Jeweils 7 aufeinanderfolgende Aminosäuren wurden durch Alanine ersetzt. Angegeben ist die Position der ersten Aminosäure an, die ausgetauscht wurde. (B) Expressionslevel der Mutanten im Vergleich zum Wildtyp-Protein (Immunoblotanalyse, siehe Abb. 5) (C) Aktivität der Mutanten bezüglich Zellzyklusarrestinduktion. Zur Ermittlung der Zellzyklusarrest-Aktivität wurde wie unter Abb.5 vorgegangen. (D) Transaktivierung des UL112_/113 Promotors. Zur Bestimmung der Transaktivierungsaktivität wurden U373-Zellen mit den jeweiligen Expressionsplasmiden zusammen mit dem UL112/113-Promotor-Reporterkonstrukt transfiziert. 48h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Luciferaseaktivität in den Zellextrakten gemessen. Die Induktion des Promotors, die in wt IE2 transfizierten Zellen im Vergleich zu den kontroll-transfizierten Zellen ermittelt wurde (in der Regel 50 –60 fach, Vergleich Abb. 4B) wurde als 100% Wt-Aktivität definiert und die Aktivität der Mutanten relativ dazu bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten. (E) Autorepression des MIE Promotors durch das wt IE2 Protein und die AS-Austauschmutanten. U373 Zellen wurden mit den jeweiligen Expressionsplasmiden zusammen mit dem MIE-Promotor-Reporterkonstrukt transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die CAT-Aktivität in den Zellextrakten gemessen. Als Bezugswert diente die Basalaktivität des Promotors in kontroll-transfizierten Zellen (SG5). Dargestellt sind die Mittelwerte aus mindestens 4 unabhängigen Experimenten.

↓62

Die vorgenommenen Aminosäureaustausche haben in Hinblick auf alle untersuchten Aktivitäten zu einem deutlichen Funktionsverlust geführt. Zwischen den einzelnen Mutationen konnten keine signifikanten Unterschiede in ihren Effekten beobachtet werden. Die C-terminalen Sequenzen zwischen AS 501 und 544 scheinen demnach für die Funktionalität des IE2-Proteins eine wichtige Rolle zu spielen und repräsentieren einen Bereich, in dem, anders als im äußersten C-Terminus, die regulatorischen Proteindomänen überlappen. Unterschiede waren lediglich im Ausmaß des Funktionsverlustes festzustellen. Besonders auffällig ist hier der Gegensatz zwischen dem absoluten Funktionsausfall bei der Transaktivierung und der residualen Aktivität bei der Induktion eines Zellzyklusarrests. Dies könnte darauf hindeuten, dass Aminosäuren außerhalb des Bereichs zwischen Aminosäure 501 und 544 zur Zellzyklusarrestaktivität mit beitragen, die bei Verlust des C-Terminus geringe Restaktivität vermitteln können. Im Gegensatz dazu sind die C-terminalen Aminosäuren für die Transaktivierung essentiell und kann ein Verlust nicht durch andere Bereiche des Proteins kompensiert werden.

Dort, wo die funktionellen Domänen im C-Terminus des Proteins überlappen, scheinen sie Teil einer komplexen, regulatorischen Domäne zu sein. Die C-terminale Grenze dieser Domäne wird markiert durch die Mutante 1-544, da sie zwar nicht mehr transaktiviert und autoreguliert, aber noch in der Lage ist, einen Zellzyklusarrest zu induzieren. Unklar ist jedoch noch, wo die N-terminale Grenze dieser Domäne liegt. Um dies zu untersuchen, wurde die Mutationsanalyse auf den N-terminalen Bereich des Proteins ausgedehnt. Verwendet wurden hierfür interne Deletionsmutanten, da in ihnen sowohl die N-terminale Aktivierungsdomäne als auch mindestens eine NLS erhalten bleiben konnte. In früheren Untersuchungen hat sich gezeigt, dass die N-terminalen Aminosäuren 1-195 weder für die Induktion eines Zellzyklusarrests (Wiebusch und Hagemeier, 1999), noch für die Autoregulation (Pizzorno et al., 1991) benötigt werden. Aus diesem Grunde konzentrierte sich die Analyse auf den Bereich zwischen Aminosäure 200 bis 470, wobei jeweils 20 Aminosäuren deletiert wurden. Eine Schema der verschiedenen Mutanten ist in Abbildung 7A dargestellt, Abbildung 7B zeigt ihre Expressionslevel. Die Mutanten del230 und del260 zeigen im Vergleich zum Wildtyp und den übrigen Mutanten ein verändertes Laufverhalten im Gel. Hier sind Teile des Proteins deletiert worden, die posttranslationalen Modifikationen unterworfen sind. Innerhalb dieser Region sind bereits mehrere Phosphorylierungsstellen identifiziert worden (Harel und Alwine, 1998). Eine Mutation oder Deletion solcher Phosphorylierungsstellen kann nicht nur den Phosphorylierungsgrad des Proteins, sondern auch seine Konformation beeinflussen. Dass dies eine Veränderung des Laufverhaltens im Gel verursachen kann, ist bereits für ähnliche IE2-Mutanten beschrieben worden (Harel und Alwine, 1998;Sommer et al., 1994).

Abb. 7: Einfluss N-terminaler Sequenzen auf den Zellzyklusarrest, die Transaktivierung sowie die Autorepression.

(A) Schematische Darstellung der internen Deletionsmutanten. Jeweils 20 Aminosäuren wurden mittels gerichteter Mutagenese deletiert. Angegeben im Namen der Mutante ist jeweils die erste Aminosäure, die deletiert wurde. (B) Wie in Abb. 4 und 5 angegeben, wurden Zellextrakte hergestellt und die Expression der IE2-Mutanten im Vergleich zum wt-Protein bestimmt. (C) Aktivität der Mutanten im Vergleich zum wt-Protein bezüglich Zellzyklusarrestinduktion. Zur Durchführung siehe Abb. 4A. (D) Transaktivierung des UL112/113 Promotors durch das IE2-Protein und die Mutanten. Zur Durchführung siehe Abb.4 B. (E) Autorepression des MIE Promotors durch das wt-IE2 Protein und die internen Deletionsmutanten. Zur Durchführung siehe Abbildung 4D.

↓63

Untersucht man die Deletionsmutanten auf ihre Funktionsfähigkeit bezüglich der drei Aktivitäten und vergleicht dies mit dem Wildtyp-Protein (Abb. 7C - E), so fällt zunächst auf, dass es keine großen Funktionsverluste gibt. Hinsichtlich eines Zellzyklusarrests (Abb. 7C) erreichen alle Mutanten Wildtypaktivität, bis auf zwei Ausnahmen. Die Mutante del260 und die Mutante del470 erreichen nur ca. 60% des Wildtypproteins. Diese beiden Mutanten zeigen auch in Bezug auf die Transaktivierung (Abb. 7D) einen Funktionsverlust. Im Gegensatz zu der Mutante del470, die gänzlich inaktiv ist, besitzt die Mutante del260 jedoch noch eine Restaktivität von 30%. Eine weitere Mutante, del330, zeigt ebenfalls einen ca. 50%igen Aktivitätsverlust im Hinblick auf die Transaktivierung, während ihre Zellzyklusarrestaktivität bei der des Wildtyps liegt. Bei allen anderen Mutanten ist die Transaktivierungsfähigkeit nicht wesentlich beeinflusst. In Abbildung 7E ist die Autorepression des MIE Promotors dargestellt. Hier zeigen alle dem Wildtyp vergleichbare Aktivitäten. Einzige Ausnahme ist wiederum die Mutante del470, da bei ihr die Promotoraktivität bei ca. 70 % liegt. Insgesamt zeigt diese Mutante ein Verhalten, wie es auch bei den C-terminalen Austauschmutanten beobachtet wurde. Sie ist eingeschränkt in ihrer Fähigkeit, einen Zellzyklusarrest zu induzieren und inaktiv in Bezug auf Transaktivierung und Autorepression. Die in ihr deletierten Sequenzen (AS 470-489) scheinen demnach Teil der C-terminalen regulatorischen Domäne zu sein. Im Gegensatz dazu ist die Mutante del430 in allen Funktionen aktiv. Die in ihr deletierten Sequenzen werden für die Funktionalität nicht benötigt. Das bedeutet, dass diese Mutation außerhalb der C-terminalen regulatorischen Domäne liegen muss und vielmehr deren N-terminale Grenze markiert. Die anderen beiden Mutanten, bei denen Einschränkungen in der Funktionalität beobachtet wurden, liegen damit ebenfalls außerhalb der C-terminalen Domäne. Sie unterscheiden sich von der Mutante del470 darin, dass mindestens eine der untersuchten Funktionen trotz Mutation unverändert bleibt. Damit markieren diese beiden Mutanten Sequenzen im Protein, die nur für bestimmte Funktionen, nämlich Transaktivierung und Zellzyklusarrest, benötigt werden, während sie für die Autoregulation entbehrlich sind.

Wie in der Einleitung erläutert, kann IE2 auf verschiedene Art und Weise Promotoren transaktivieren. Während die Transaktivierung bestimmter heterologer Promotoren durch IE2 nur von der Anwesenheit der TATA-Box abhängt, ist in HCMV Promotoren die Interaktion mit Promotor-spezifischen Transkriptionsfaktoren sowie die direkte Bindung von IE2 an die DNA von größerer Bedeutung. Um dieser Tatsache Rechnung zu tragen, wurde die Transaktivierungsfähigkeit der IE2 Mutanten zusätzlich auch an dem heterologen c-fos Promotor überprüft, bei dem für die Transaktivierung lediglich basale Promotorsequenzen benötigt wird. Hier geht man davon aus, dass die Transaktivierung über Interaktion des IE2-Proteins mit basalen Transkriptionsfaktoren vermittelt wird (Hagemeier et al., 1992;Lukac et al., 1994). Bei einer Kotranksfektion dieses Konstrukts mit einem IE2-Expressionsplasmid ist in U373-Zellen in der Regel eine ca. 70-fache Induktion des Promotors im Vergleich zu Kontroll-transfizierten Zellen zu beobachten (siehe Abb. 4C). Wiederum wurde die Aktivität der Mutanten relativ zum Wildtyp-Protein bestimmt. Abbildung 8 zeigt die Transaktivierungsfähigkeit der Mutanten auf dem c-fos und dem UL112/113 Promotor. Wie man sieht, gibt es trotz der unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen keine wesentlichen Unterschiede zwischen den beiden Promotoren. Lediglich die Mutante del260 ist auf dem c-fos Promotors noch etwas schwächer als auf dem UL112/113 Promotor, während es bei der Mutante del330 genau umgekehrt ist.

Abb. 8: Transaktivierung des UL112/113-Promotors und des c-fos-Promotors durch das wt IE2-Protein und die Mutanten.

U373-Zellen wurden mit den jeweiligen Expressionsplasmiden sowie entweder mit einem UL112/113-Promotor- oder einem c-fos Promotor-Reporterkonstrukt transfiziert. 48h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die CAT-Aktivität bestimmt. Die Induktion des Promotors, die in wt IE2 transfizierten Zellen im Vergleich zu den kontroll-transfizierten Zellen ermittelt wurde (bei dem UL112/113-Promotor in der Regel 50 –60-fach, bei dem c-fos Promotor 60-70-fach) wurde als 100% wt-Aktivität definiert und die Aktivität der Mutanten relativ dazu bestimmt. Die Abbildung zeigt einen Vergleich der Transaktivierung beider Promotoren. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten sowie die Standardabweichung.

↓64

In früheren Publikationen ist gezeigt worden, dass die Aminosäuren 290 bis 579 notwendig für die Autoregulation sind und schon kleine Mutationen zu einem Funktionsverlust führen (Ahn et al., 1998;Pizzorno et al., 1991). Dies steht teilweise im Widerspruch zu den hier beobachteten Ergebnissen (Abb.7D). Aus diesem Grund wurden einige der Mutanten auf einem weiteren MIE Promotorkonstrukt (pIE1cat) getestet, das die Nukleotide -302 bis +72 des MIE Promotors vor einem CAT-Reportergen enthält. Das Ergebnis dieser Analyse ist in Abbildung 9 dargestellt.

Die Basalaktivität dieses Promotorkonstrukts ist etwas höher als bei dem zuvor verwendeten Promotorkonstrukts. In kontroll-transfizierten Zellen konnte eine CAT-Konzentration von ca. 1000 pmol/ml gemessen werden, bei dem zuvor verwendeten Konstrukt (pRR55) waren es in der Regel nur ca. 500 pmol/ml. Dies könnte auf eine unterschiedliche Transfektionseffizienz der beiden Promotorkonstrukte zurückzuführen sein. Durch die Kotransfektion mit einem IE2-Expressionsplasmid ist auch bei dem Konstrukt pIE1cat eine deutliche Abnahme der Promotoraktivität zu beobachten, wenngleich der Effekt etwas schwächer ist als zuvor beobachtet (Vergleich Abb. 4D und Abb 9). Die Kotransfektion mit den internen Deletionsmutanten ergibt ein ähnliches Bild wie zuvor. Allerdings ist auch hier das Ausmaß der Repression geringer und dies verringert den beobachteten Unterschied zwischen der Mutante del470 und den übrigen, aktiven Mutanten.

Abb. 9: Repression des MIE-Promotors durch interne Deletionsmutanten.

Autorepression des MIE Promotors durch das wt IE2 Protein und interne Deletionsmutanten. U373 Zellen wurden mit den jeweiligen Expressionsplasmiden zusammen mit dem MIE-Promotor-Reporterkonstrukt pIE1CAT, das die Nukleotide –303 bis +72 des MIE Promotors vor einem CAT-Reportergen enthält, transfiziert, 48 h später geerntet und die CAT-Aktivität in den Zellextrakten bestimmt. Als Bezugswert diente die Basalaktivität des Promotors in kontroll-transfizierten Zellen (SG5). Dargestellt sind die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten.

↓65

Die bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass es im C-Terminus des IE2-Proteins eine Region (Aminosäuren 470 bis 544) gibt, in der wichtige regulatorische Domänen überlappen. Mutationen innerhalb dieser Region führen zu weitreichenden Funktionsverlusten. Sie scheint daher eine zentrale Kerndomäne („Core“) darzustellen. Im Gegensatz dazu ist es in dem sich N-terminal anschließenden Teil des Proteins möglich, Sequenzen zu identifizieren, die nur für bestimmte Funktionen erforderlich sind. Darüber hinaus gibt es hier auch Abschnitte, die für die Funktionalität des Proteins nicht benötigt werden.

3.3 Die IE2-DNA-Bindung

Da die DNA-Bindung des IE2 Proteins als eine Grundvoraussetzung für die Fähigkeit zur Autoregulation gilt (Lang und Stamminger, 1993;Liu et al., 1991;Macias und Stinski, 1993;Pizzorno und Hayward, 1990), sollte im folgenden auch die DNA-Bindungsfähigkeit der Mutanten direkt untersucht werden. Wie bereits in der Einleitung erläutert, war es in der Vergangenheit nur eingeschränkt möglich, die IE2-Bindungsaktivität mithilfe von Extrakten transfizierter Zellen nachzuweisen. Daher wurden die meisten bisher publizierten Untersuchungen zur IE2-DNA Bindung mit bakteriell exprimiertem rekombinanten IE2 Protein durchgeführt (Ahn et al., 1998;Chiou et al., 1993;Jupp et al., 1993;Lang und Stamminger, 1993;Waheed et al., 1998). In der Regel wurden hier zur besseren Aufreinigung GST-Fusionsproteine verwendet und es hat sich gezeigt, dass zum Nachweis einer DNA-Bindung nur der C-Terminus ab Aminosäure 290 benötigt wird. In der vorliegenden Arbeit sollte jedoch das gleiche experimentelle System, nämlich die Expression in permissiven Zellen, für die Untersuchung der DNA-Bindung verwendet werden, um eine direkte Vergleichbarkeit der Aktivitäten zu gewährleisten. Darüber hinaus sollten die Mutationen im Kontext des gesamten Proteins analysiert werden. Aus diesem Grunde musste zunächst ein adäquater Bindungsassay etabliert werden.

3.3.1  Etablierung eines DNA Bindungsassays für das HCMV IE2-Protein

Trotz zahlreicher Untersuchungen sind viele Einzelheiten der IE2-DNA Interaktion unklar. So ist das DNA-bindende Motiv im IE2 Protein noch nicht identifiziert und es kann bisher keiner Gruppe bekannten DNA-bindender Proteine zugeordnet werden. Man weiß, dass IE2 über die kleine Furche mit der DNA interagiert (Lang und Stamminger, 1994). Verschiedene bisher identifizierte IE2-Bindungsstellen weisen nur geringe Sequenzhomologien auf, so dass zu vermuten ist, dass das IE2 Protein vor allem strukturelle Merkmale der DNA erkennt (Lang und Stamminger, 1994). Der Nachweis der DNA-Bindung unter physiologisch relevanten Bedingungen gelang bisher jedoch nicht. In einer neueren Studie konnte eine DNA-Bindung gezeigt werden, nachdem das IE2 Protein aus Extrakten transient transfizierter Zellen über eine Heparin-Sepharose-Säule aufgereinigt worden war (Huang und Chen, 2002), was einen Hinweis darauf gibt, dass auch die Aufreinigungsmethode einen wesentlichen Einfluss auf die Bindungsfähigkeit des Proteins hat und die vermutlich schwache IE2-DNA-Interaktion relativ leicht gestört werden kann.

↓66

Ausgehend von bereits publizierten Studien zu DNA Bindungsassys mit dem IE2 Protein wurden daher zunächst HeLa-Zellen mit dem IE2-Expressionsvektor transfiziert und unter möglichst schonenden Bedingungen Zellextrakte hergestellt. Hierfür wurden die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion durch Abschaben in PBS geerntet und in einem Puffer mit geringem Salzgehalt aufgenommen (TGA-Puffer: 10 mM Tris pH 8.0, 10 % Glycerin, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT). Der Zellaufschluss erfolgte dann mit Ultraschall, unter Ausschluss von Detergentien und Proteinaseinhibitoren. Diese Aufschlussbedingungen haben sich in der Vergangenheit als besonders günstig für die Untersuchung der DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren erwiesen (Truss, 1992). Generell können die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Protein und DNA durch die Erhöhung der Salzkonzentration abgeschwächt und die Affinität somit herabgesetzt werden. In der Regel werden Zellextrakte daher in der Gegenwart von 50-100 mM NaCl oder KCl hergestellt, um die Proteine während der Präparation von der DNA zu lösen (Latchman, 1993). Da jedoch zu erwarten war, dass die IE2-DNA-Bindung eine eher geringe Affinität aufweist, wurde auf die Zugabe von Salzen im Probenpuffer verzichtet. Bei einer Präparation der Extrakte in einem Puffer mit geringem Salzgehalt bleibt zudem die Möglichkeit bestehen, in den Bindungsansätzen verschiedene Salze und Salzkonzentrationen auszutesten.

In einem ersten Bindungsassay wurden ausgehend von bereits bekannten Informationen verschiedene Reaktionsbedingungen für den Bindungsansatz getestet. Wie bereits beschrieben wurde, ist die Bindung des IE2-Proteins sensitiv gegenüber bestimmten nicht-spezifischen Kompetitor-DNAs, die in Gel-Retardierungsexperimenten eingesetzt werden, um die Bindung unspezifischer DNA-bindender Proteine zu minimieren. Die Bindung des IE2-Proteins wurde bisher nur in der Gegenwart von poly(dA-dT)·(dA-dT) Kompetitor DNA beobachtet (Ahn et al., 1998;Chiou et al., 1993;Waheed et al., 1998). Aus diesem Grund wurden alle Reaktionen in der Gegenwart von poly(dA-dT)·(dA-dT) durchgeführt. Die Zugabe unspezifischen Proteins wie BSA zum Bindungsansatz kann in Gelretardierungsexperimenten die spezifische DNA-Protein Interaktion erhöhen. Dies beruht vermutlich darauf, dass es die Adsorption der Proteine an die Oberfläche der Reaktionsgefäße sowie der Gelplatten verhindert. Darüber hinaus beeinflusst es möglicherweise die Konformation der Protein, indem es die Anordnung der umgebenden Wassermoleküle verändert (Zhang et al., 1992). Auch für das TBP, welches ebenfalls über Interaktionen mit der kleinen Furche an die DNA bindet, konnte so die DNA-Bindung verbessert werden (Jupp et al., 1993;Liebermann, 1991). Aus diesem Grund wurde alle Bindungsansätze in der Gegenwart von BSA durchgeführt.

Einem Teil der Reaktionen wurde Alkalische Phosphatase zugesetzt, da in der Literatur ein Zusammenhang zwischen der DNA-Bindungsfähigkeit und dem Phosphorylierungsgrad des IE2-Proteins beschrieben worden ist (Waheed et al., 1998). Zweiwertige Kationen, wie Magnesium können ebenfalls die Bindung stabilisieren, da sie die negativen Ladungen des Phosphatrückgrats der DNA neutralisieren können und die DNA alternative, für die Proteinbindung möglicherweise günstigere Konformationen eingehen kann (Robidoux et al., 1992). Daher wurden einige Ansätze in der Gegenwart von MgCl2 durchgeführt. Für den Bindungsassay wurden zunächst ca. 50 µg Protein verwendet und diese 10 min bei Raumtemperatur im Bindungsansatz inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe der radioaktiv markierten Zielsonde und eine weitere 10-minütige Inkubation. Schließlich wurde ein Aliquot der Reaktion auf einem 4%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und das Ergebnis autoradiographisch ausgewertet. Als Zielsonde wurde die MIE-Promotorsequenz von -40 bis +7 verwendet, die die wt crs enthält. Bei der mutierten Sonde trägt die crs eine Mutation, so dass eine Bindung des IE2-Proteins nicht mehr möglich ist. Abbildung 10 zeigt das Ergebnis eines Bindungsansatzes mit Extrakten aus HeLa-Zellen, die transient entweder mit dem Kontrollplasmid pSG5 oder mit dem wt IE2-Expressionsplasmid bzw. einer IE2-Mutante (1-497) transfiziert wurden.

↓67

Abb. 10: Etablierung eines DNA-Bindungsassays für das IE2-Protein.

IE2-DNA-Bindungsassay unter Verwendung von HeLa-Zellextrakten. HeLa-Zellen wurden entweder mit dem leeren pSG5-3HA-Expressionsvektor (K) oder mit dem pSG5-3HA-IE2-Expressionsvektor (wt) bzw. einer IE2-Mutante (m) transfiziert und 24 h nach Transfektion geerntet. Die Zellen wurden in TGA-Puffer aufgenommen und Zellextrakte durch Ultraschallaufschluss hergestellt. Für den Bindungsansatz wurden je 5 µl (~50 µg Protein) Proteinextrakt in TE-Puffer mit 3 µg/µl BSA, 5% Glycerin und 100 ng/µl poly(dA-dT)·(dA-dT) zunächst für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1,5 µl (~ 50 fmol, ~ 20.000 cpm) der markierten Sonde hinzugegeben. Nach weiteren 10 min Inkubation wurde ein Aliquot der Reaktion auf einem 4%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Autoradiography ausgewertet. Wo angegeben war den Reaktionsansätzen Alkalische Phosphatase bzw. MgCl2 zugegeben worden. ( S – Shift; fS – freie Sonde)

Es fällt zunächst auf, dass die Zugabe von Alkalischer Phosphatase keinen Einflus auf die Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins zu haben scheint, da keine Unterschiede zwischen den behandelten (Spur 1-12) und den nicht-behandelten (Spuren 13-23) Ansätzen zu sehen sind. Lediglich dort, wo MgCl2 in dem Reaktionsansatz enthalten war, ist eine schwache Bande zu beobachten (Spur 8 und 20). Hier scheint es zu einer Bindung des Proteins an die markierte DNA gekommen zu sein. Da die Bande weder bei den Kontrollextrakten noch bei denen, die eine C-terminale IE2-Mutante enthalten, auftritt, ist dies ein erster Hinweis darauf, dass der beobachtete Komplex tatsächlich auf die Anwesenheit des IE2 Proteins zurückzuführen ist. Zudem ist die Bande nur dort zu beobachten, wo der Bindungsansatz die wt crs-Sonde enthält, nicht aber bei der mutierten crs-Sonde.

Da die beobachtete Bande sehr schwach war, wurden im folgenden die Reaktionsbedingungen optimiert. Eine Möglichkeit, die Bindungsfähigkeit zu verbessern, ist eine Erhöhung der Menge an unspezifischer Kompetitor-DNA, da hierdurch die spezifische Bindung verstärkt werden kann. Aus diesem Grund wurde die Menge des eingesetzten poly(dA-dT)·(dA-dT) erhöht. Außerdem können durch die Zugabe von Salzen die Reaktionsbedingungen an physiologische Salzkonzentrationen angepasst werden, was bei einigen Transkriptionsfaktoren, wie z.B. Sp1 und NF1-L, die Bindung verstärken kann (Robidoux et al., 1992). Da die Salzkonzentration bisher sehr niedrig war, wurden den Ansätzen NaCl zugesetzt. Wie Abbildung 8 jedoch zeigt, haben höhere poly(dA-dT)·(dA-dT)-Konzentrationen einen hemmenden Einfluss auf die DNA-Bindung des IE2-Proteins, da die Bande verschwindet. Auch die Gegenwart von NaCl verbessert die Bindung nicht. Hier kommt es im Gegenteil zum verstärkten Auftreten unspezifischer Banden, da offensichtlich die Bindungsbedingungen für unspezifisch bindende Proteine verbessert wurden. Um nachzuweisen, dass der beobachtete Komplex tatsächlich das IE2-Protein enthält, wurden den Reaktionsansätzen Antikörper zugefügt. Bei einer Bindung eines Antikörpers an das an die DNA gebundene Protein kommt es zu einer weiteren Retardierung des Protein-DNA-Komplexes im Gel, man beobachtet eienn Supershift. Andererseits kann durch einen spezifischen Antikörper die DNA-Bindung auch inhibiert werden, nämlich dann, wenn der Antikörper eine Region im Protein erkennt, die für die DNA-Bindung benötigt wird.

↓68

Abb. 11: IE2 aus Extrakten transfizierter Zellen bindet an eine crs enthaltende Zielsequenz.

IE2-DNA-Bindungsassay unter Verwendung von HeLa-Zellextrakten. HeLa-Zellen wurden wie unter Abb. 10 angegeben transfiziert und Zellextrakte hergestellt. Der Bindungsansatz enthielt, neben den angegebenen Mengen von poly(dA-dT)·(dA-dT), 3 µg/µl BSA, 5% Glycerin und 1mM MgCl2. Wo angegeben wurden dem Bindungsansatz 1 µl eines Antikörpers hinzugegeben. In den Ansätzen der Spuren 9 bis 12 wurde der Bindungsansatz in Gegenwart von 100 mM NaCl durchgeführt. (S-Shift, fS- freie Sonde; * - Supershift nach Antikörperinkubation)

Für die Supershift-Experimente wurden verschiedene Antikörper eingesetzt. Sowohl der αHA-Antikörper, der gegen das N-terminale Hämagglutinin-Epitop gerichtet ist, als auch ein IE2-Antiserum, das den C-Terminus des Proteins erkennt, verhindern offensichtlich die DNA-Bindung, die Bande verschwindet (Abb.11 Spur 14 + 16). Wird dem Bindungsansatz ein gegen den N-Terminus des Proteins gerichteter Antikörper zugegeben (Spur 15), so beobachtet man einen Supershift, was zeigt, dass der Komplex tatsächlich IE2-Protein enthält. Bei Zugabe eines unspezifischen Maus-Antikörpers (Spur 16) bleibt die Bande unverändert.

↓69

Wenn, wie im vorliegenden Fall, Gesamtzellextrakte für DNA-Bindungsassays verwendet werden, spielt der Einsatz von Kompetitor-DNA eine wichtige Rolle, da hierdurch unspezifische DNA-bindende Proteine abgesättigt werden können. Wie die vorangegangenen Ergebnisse gezeigt haben, wird die Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins durch die Menge des eingesetzten poly(dA-dT)·(dA-dT) stark beeinflusst. Aus diesem Grunde wurde im folgenden eine Titrationsreihe durchgeführt, um die optimale Konzentration dieses Kompetitors im Bindungsansatz zu bestimmen. Wie Abbildung 12 zeigt, ist die beobachtete Komplexbildung um so stärker, je geringer die eingesetzte poly(dA-dT)·(dA-dT) - Menge ist.

Abb. 12: Einfluss der Menge an poly (dA-dT)·(dA-dT)-Kompetitor-DNA auf die Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins.

IE2-DNA-Bindungsassay unter Verwendung von HeLa-Zellextrakten. HeLa-Zellen wurden wie unter Abb. 10 transfiziert und Zellextrakte hergestellt. Die Reaktion wurde wie unter Abb. 11 angegeben durchgeführt, wobei in den Ansätzen der Spuren 1-4 jeweils 100 ng/µl poly(dA-dT)·(dA-dT) Kompetitor enthalten waren. Die Ansätze der Spuren 5-11 wurden in der Gegenwart der angegebenen Mengen Kompetitor DNA mit der wt crs Zielsonde durchgeführt.

Neben synthetischer poly(dA-dT)·(dA-dT)-DNA wird auch poly(dI-dC)·(dI-dC)-DNA sowie heterologe DNA, wie Heringssperm DNA, zur Kompetition eingesetzt. Wie Abbildung 13 jedoch zeigt, wird durch die Anwesenheit schon geringer Mengen an poly(dI-dC)·(dI-dC) (Spuren 5-8) die Bindung des IE2 Proteins an die DNA komplett inhibiert. Dies deckt sich mit den in der Literatur beschriebenen Ergebnissen (Waheed et al., 1998) und verdeutlicht die höhere Affinität des IE2-Proteins zu den flankierenden CG-Dinukleotiden in der crs im Vergleich zu den internen A/T-Nukleotiden. Bei Verwendung von Heringsperm-DNA ist eine Bindung noch möglich, wenngleich sie schwächer ist, als in der Gegenwart von poly(dA-dT)·(dA-dT) ((Chiou et al., 1993) und eigene Beobachtungen).

↓70

Abb. 13: Einfluss verschiedener Kompetitor DNAs auf die Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins.

IE2-DNA-Bindungsassay unter Verwendung von HeLa-Zellextrakten. HeLa-Zellen wurden wie unter Abb. 10 beschrieben transfiziert und Zellextrakte hergestellt. Der Bindungsansatz enthielt 3 µg/µl BSA, 5% Glycerin und 1mM MgCl2 sowie die angegebenen Mengen an Kompetitor-DNA.

Abschließend wurde auch die Menge des in dem Bindungsansatzes eingesetzten Zell-Extraktes optimiert. Wie Abbildung 14 zeigt, reichen bereits geringe Mengen des Extraktes (und damit des IE2-Proteins) aus, um die DNA-Bindung nachzuweisen. Sind die Mengen des eingesetzten Proteins deutlich höher (Spuren 8-10), so nimmt die spezifische Bande ab, während ein Großteil der Reaktion nicht mehr in das Gel einläuft.

Abb. 14: Titation der Menge des eingesetzten Zellextraktes.

IE2-DNA-Bindungsassay unter Verwendung von HeLa-Zellextrakten. HeLa-Zellen wurden wie unter Abb. 10 beschrieben transfiziert und Zellextrakte hergestellt. Der Bindungsansatz enthielt 3 µg/µl BSA, 5% Glycerin, 1mM MgCl2, und 12,5 ng/µl poly(dA-dT)·(dA-dT) sowie die angegebenen Mengen an Zellextrakten.

↓71

Ausgehend von den dargestellten Voruntersuchungen wurden folgende Reaktionsbedingungen für die nachfolgenden DNA-Bindungsassays verwendet: Zwanzig Mikrogramm Protein wurden in TE-Puffer mit 3µg/µl BSA, 5% Glycerin, 1 mM MgCl2 sowie 12,5 ng/µl poly(dA-dT)·(dA-dT) und 5 ng/µl sonizierter, denaturierter Heringssperm-DNA für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte wie oben beschrieben die Zugabe der radioaktiv markierten Zielsonde sowie eine weitere Inkubation für 10 min. Danach wurde ein Aliquot der Reaktion gelelektrophoretisch aufgetrennt und der Bindungsassay autoradiographisch ausgewertet. Abbildung 15A zeigt einen DNA Bindungsassay unter optimierten Bedingungen bei Verwendung von HeLa-Zellextrakten. Man beobachtet einen starke Bande dort, wo Extrakte von IE2-transfizierten Zellen in die Reaktion eingesetzt wurde, nicht aber bei den Kontrollextrakten (SG5). Keine Bindung ist zu beobachten, wenn die crs in der Zielsonde mutiert ist.

Abb. 15: Bindung des IE2-Proteins an die crs

IE2-DNA-Bindungsassay unter optimierten Bedingungen. (A) HeLa-Zellen wurden entweder mit dem leeren pSG5-3HA-Expressionsvektor oder mit dem pSG5-3HA-IE2-Expressionsvektor transfiziert und 24 h nach Transfektion geerntet. Die Zellen wurden in TGA-Puffer aufgenommen und Zellextrakte durch Sonizieren hergestellt. Für den Bindungsassay wurden 20 µg Protein in TE-Puffer mit 3 µg/µl BSA, 5% Glycerin, 1mM MgCl2, 12,5 ng/µl poly(dA-dT)·(dA-dT) und 5 ng/µl sonizierte, denaturierte Heringssperm-DNA zunächst für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1,5 µl (~ 50 fmol, ~ 20.000 cpm) der markierten Sonde hinzugegeben. Nach weiteren 10 min Inkubation wurde ein Aliquot des Reaktionsansatzes auf einem 4%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Autoradiography ausgewertet. (B+C) Nachweis des IE2-Proteins im DNA-Protein Komplexes durch Antikörper-Supershift-Experimente. Der Bindungsassay wurde wie unter (A) angegeben durchgeführt und jeweils 1 µl (~ 0,5 µg) der angegebenen Antikörper bzw. des Antiserums dem Bindungsansatz zur ersten Inkubation hinzugegeben. (S-Shift; fS- freie Sonde; * - durch Antikörperinkubation induzierter Supershift)

Um spezifisch die Anwesenheit des IE2-Proteins in dem auftretenden Komplex nachzuweisen, wurden Supershift-Experimente durchgeführt (Abb. 15 B+C). Durch Zugabe eines IE-spezifischen Antikörpers, der den N-Terminus des Proteins erkennt, wird der gesamte Komplex im Gel retardiert. Ebenso ist unter den nunmehr optimierten Reaktionsbedingungen auch bei Verwendung des αHA-Antikörpers ein Supershift zu beobachten. Bei Zugabe von unspezifischen Antikörpern bleibt die DNA-Bindung unverändert (Abb. 15 B, Spur 5 + 6). Ebenso kann auch der IE-Antikörper alleine nicht mit der radioaktiv markierten Zielsequenz interagieren. (Abb. 15 B, Spur 7). Die Zugabe des IE2-spezifischen Antiserums hingegen führt zu einer Inhibition der DNA-Bindung (Abb. 15C, Spur 3). Da dieses Antiserum gegen den C-Terminus des Proteins gerichtet ist, wird durch die Bindung des Antikörpers möglicherweise ein Teil der DNA-Bindungsdomäne blockiert.

↓72

Die Spezifität der Protein-DNA Interaktion lässt sich in Gelretardierungsexperimenten durch Kompetitionsexperimente mit nicht-radioaktiv-markierter spezifischer DNA demonstrieren. Hierfür wird dem Bindungsansatz gleichzeitig mit der Zugabe der radioaktiv markierten Zielsequenz ein Überschuss an nicht-markierter spezifischer DNA hinzugegeben. Das Ergebnis eines solchen Kompetitionsexperiments zeigt Abbildung 16 A. Den Bindungsansätzen wurde jeweils die crs enthaltende Targetduplex bzw. die mutierte Duplex in den angegebenen Mengen zugegeben. Wie zu sehen ist, kommt es bei der wt crs-Targetduplex schon bei einem 10-fachen Überschuss zu einer deutlichen Reduktion der DNA-Bindung an die markierte Targetduplex. Im Gegensatz dazu wird bei Verwendung der mutierten crs-Duplex selbst bei einem 100-fachen Überschuss die spezifische Bindung des IE2-Proteins an die radioaktive Sonde kaum beeinflusst. Abbildung 16 B zeigt die quantitative Auswertung dieser Kompetition. Hier wird deutlich, dass die nicht markierte wt-Targetduplex schon bei einem 5-fachen Überschuss die Bindung an die radioaktiv markierten Sonde kompetiert, was die Spezifität der IE2-DNA Interaktion demonstriert. Bei einem 10-fachen Überschuss der wt-crs-Duplex liegt die Kompetition bereits bei 80%, während ein 100-facher Überschuss der Zielsequenz mit mutierter crs nur einen geringen Effekt hat.

Abb. 16: Nachweis der Spezifität der IE2-DNA-Interaktion über Kompetition mit nicht-markierter DNA

(A) Nachweis der Spezifität der IE2-DNA-Interaktion mittels Kompetition mit nicht-markierter spezifischer DNA. Der Bindungsassay wurde wie unter (Abb.15A) angegeben durchgeführt. Gleichzeitig mit Zugabe der radioaktiv markierten Sonde wurde entweder die nicht-markierte wt crs oder die mutierte crs Zielduplex in dem jeweils angegebenen Überschuss zu dem Bindungsansatz gegeben. (D) Quantitative Auswertung des Kompetitionsexperiments. Das Gel des unter (A) dargestellten Bindungsassays wurde mittels PhosphoImager und der Aida Image Analyzer Software ausgewertet und die Intensität der Banden quantifiziert.

↓73

Da es das Ziel war, einen DNA-Bindungsassay zu etablieren, der den Nachweis der IE2-DNA-Bindung auch unter physiologisch relevanten Bedingungen erlaubt, wurde im folgenden die DNA-Bindung in den HCMV-permissiven U373-Zellen untersucht. Wie zuvor die HeLa-Zellen wurden diese mit einem IE2-Expressionsplasmid transfiziert, 46 h später geerntet und der Bindungsassay wie bereits erläutert durchführt. Abbildung 17 A zeigt das Ergebnis eines solchen Assays. Auch hier ist deutlich eine Komplexbildung zu beobachten, und zwar spezifisch nur dort, wo IE2 in den Extrakten enthalten und die crs in der Targetduplex intakt war (Spur 2 im Vergleich zu Spur 4). Das spezifisch IE2 in dem Komplex enthalten ist, zeigt Spur 3, da wiederum durch die Zugabe eines IE-spezifischen Antikörpers ein Supershift induziert wird. Im Vergleich zu den Bindungsassays mit HeLa-Zellextrakten ist die beobachtete Bande jedoch deutlich schwächer und der Hintergrund insgesamt stärker. Dies ist vermutlich auf die deutlich geringere Transfektionseffizienz in U373-Zellen im Vergleich zu HeLa-Zellen zurückzuführen. Abbildung 13 B zeigt eine Immunoblot-Analyse der Extrakte von transfizierten HeLa- und U373-Zellen. Wie man sieht, führt die geringere Transfektionseffizienz zu deutlich geringeren Expressionsleveln des transfizierten Proteins.

Abb. 17: Spezifische DNA-Bindung des IE2-Protein aus Extrakten transfizierter U373-Zellen.

(A) U373-Zellen entweder mit dem leeren pSG5-3HA-Expressionsvektor oder mit dem pSG5-3HA-IE2-Expressionsvektor transfiziert und 46 h nach Transfektion wie unter Abb. 10 angegeben geerntet und der Bindungsassay durchgeführt. Wo angegeben wurde 1 µl (~ 0,5 µg) eines IE-spezifischen Antikörpers dem Bindungsansatz hinzugegeben. (B) Immunoblotanalyse der Extrakte transfizierter HeLa- und U373-Zellen. Jeweils zwanzig Mikrogramm des Zelleextrakts wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt und die Menge des IE2-Proteins parallel durch Immunoblot-Analyse mittels HA-Antikörper nachgewiesen.

Erlaubt der entwickelte Bindungsassay den Nachweis der DNA-Bindung unter physiologisch relevanten Bedingungen, so sollte diese auch im Rahmen einer Virusinfektion zu beobachten sein. Bisher ist aufgrund der bereits erwähnten Schwierigkeiten die Darstellung der IE2-DNA-Interaktion während der viralen Infektion nicht möglich gewesen. Daher ist bisher auch unklar, wann eine solche DNA-Bindung auftritt.

↓74

Um zu untersuchen, ob und zu welchen Zeitpunkten während der Virusinfektion eine Bindung des IE2 an die DNA mithilfe des entwickelten Assays nachzuweisen ist, wurden U373-Zellen mit HCMV infiziert, zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und mit den Extrakten DNA-Bindungsassays durchgeführt. Abbildung 18 A zeigt das Ergebnis eines solchen Gelretardierungsexperiments. Während zu frühen Zeitpunkten noch keine DNA-Bindung nachzuweisen ist (Abb. 18 A, Spuren 2-4), tritt 48 h nach der Infektion eine Komplexbildung auf, die im weiteren Verlauf immer stärker wird. Dies bedeutet, dass auch während der Virusinfektion produzierte IE2 in der Lage ist, in vitro an die DNA zu binden. Dass diese DNA-Bindung abhängig von einer intakten crs ist, zeigt der rechte Teil der Abb. 18A. Bei einer mutierten crs ist keine spezifische Bindung nachzuweisen. Während der Virusinfektion treten neben der 86 kDa-Form des IE2-Proteins weitere Isoformen auf, die teils durch alteratives Spleißen und teils durch Transkription von einem internen Promotor generiert werden. Daher ist es möglich, dass die beobachteten DNA-Protein-Komplexe auch Isoformen enthalten. Die nach Inkubation mit Extrakten infizierter Zellen versus transfizierter Zellen auftretende Bande ist weniger distinkt und insgesamt etwas breiter als die bei einer transienten Expression des IE2 in den Zellen. Dies könnte ein Hinweis auf eine andere Komplexzusammensetzung sein. Abbildung 18 B zeigt einen Immunoblot der Virusextrakte mit einem gegen das IE2-Protein gerichteten Antiserum. Wie zu erkennen ist, sind erst nach 48 h größere Mengen des IE2p40-Proteins nachzuweisen, von dem bereits gezeigt wurde, dass es den MIE Promotor reprimieren kann (Jenkins et al., 1994). Allerdings ist zu diesem Zeitpunkt auch bei der IE55-Variante und bei dem IE2-Protein eine Steigerung zu beobachten, so dass noch keine Aussage darüber möglich ist, welche IE-Varianten möglicherweise in dem Komplex enthalten sind.

Abb. 18: Nachweis der IE2-DNA-Interaktion während der viralen Infektion.

U373 Zellen wurden mit HCMV AD169 mit einer PfU (Plaque forming unit) von 5 infiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion geerntet. Zellextrakte wurden wie unter Material und Methoden und Abb.10 beschrieben hergestellt und 20 µg Proteinextrakt in den Bindungsassay (Durchführung siehe Abb. 15) eingesetzt. (A) DNA-Bindung des IE2-Proteins im Verlauf der Infektion. (B) Immunoblot-Analyse der Viruszellextrakte. Jeweils 10 µg der Proteinextrakte wurden auf einem 8%igem Polyacrylamidgel aufgetrennt und der Immunoblot wie unter Abb. 5 durchgeführt. Der Nachweis erfolgte mithilfe eines IE2-spezifischen Antiserums. (C) Nachweis des IE2-Proteins im DNA-Protein-Komplex durch Antikörper-Supershift-Experimente. Der Bindungsassay wurde wie beschrieben durchgeführt und dem Bindungsansatz vor Zugabe der radioaktiv markierten Zielsequenz 1 µl (~ 0,5 µg) des jeweils angegebenen Antikörpers bzw. Antiserums zugesetzt.

Um die Spezifität des DNA-Protein-Komplexes nachzuweisen, wurden wiederum Supershift-Experimente durchgeführt. Abbildung 18C zeigt, dass sich sowohl zu 48h als auch 72h nach der Infektion der Komplex durch Zugabe eines IE-spezifischen Antikörpers zu einer weiteren Retardierung der Bande kommt. Dieser Antikörper erkennt den N-Terminus des IE2-Proteins und damit z.B. die Spleißvariante IE55, nicht jedoch das late IE2p40-Protein. Von dem IE55-Protein ist bereits gezeigt worden, dass es nicht an die DNA binden kann (Hermiston et al., 1990) Die Zugabe des IE2-spezifischen Antiserums, das auch das IE2p40-Protein erkennt, führt, wie schon zuvor beobachtet (siehe Abb. 15C ) zu einem Verlust der DNA-Bindung.

↓75

Die Ergebnisse zeigen, dass der entwickelte Bindungsassay es erlaubt, die DNA-Bindung des IE2 Proteins zuverlässig nachzuweisen, unabhängig davon, ob das Protein während einer transienten Transfektion oder während der Virusinfektion gebildet wurde. Darüber hinaus ist es nun möglich die verschiedenen IE2-Mutanten innerhalb des gleichen experimentellen Systems auf ihre Autorepression und ihre direkte DNA-Bindung hin zu untersuchen.

Da aufgrund der besseren Transfektionseffizienz die IE2-DNA-Bindung am besten in HeLa-Zellextrakten zu beobachten war, wurden auch die folgenden Versuche in HeLa-Zellen durchgeführt. Frühere Studien haben bereits gezeigt, das die Autorepression des MIE Promotors durch IE2 auch in anderen, nicht-permissiven Zelllinien wie Vero-oder HeLa-Zellen gezeigt werden kann (Pizzorno und Hayward, 1990;Tsai et al., 1997). Dass dies auch auf das von uns verwendete HeLa System zutrifft, zeigt Abb.19. Wie zuvor in den U373-Zellen wurden hier in HeLa-Zellen Kotransfektionsexperimente mit dem MIE Promotor durchgeführt. In Anwesenheit des IE2-Proteins wird der Promotor ebenso reprimiert wie durch die Mutante del430, während die Mutante del470 inaktiv ist.

Abb. 19: IE2-vermittelte Repression des MIE Promotors in HeLa-Zellen.

HeLa Zellen wurden mit den angegebenen Expressionsplasmiden sowie mit dem MIE Promotor-Reporterkonstrukt transfiziert und 24 h nach der Transfektion geerntet. Die CAT-Aktivität in den Extrakten wurde mittels CAT-ELISA ermittelt und die relative Aktivität des Promotors im Vergleich zu kontroll-transfizierten Zellen bestimmt.

3.3.2 Die DNA-Bindung C-terminaler IE2-Mutanten

↓76

Nach bisherigen Studien erstreckt sich die DNA-Binungsdomäne des IE2-Proteins von Aminosäure 346 bis 579 (Chiou et al., 1993;Waheed et al., 1998), wobei für die Autorepression darüber hinaus auch die Aminosäuren 290 bis 346 benötigt werden (Hermiston et al., 1990;Pizzorno et al., 1991;Stenberg et al., 1990). Um die bisher erhaltenen Daten zur Autoregulation mit der DNA-Bindung zu korrelieren, sollte daher untersucht werden, wie sich die IE2-Mutanten in dem DNA-Bindungsassay verhalten. Zunächst wurden die C-terminalen Mutanten auf ihre DNA-Bindungsfähigkeit getestet. Das Ergebnis sind in Abbildung 20 A und B dargestellt. Keine der C-terminalen Deletionsmutanten (Abb. 20 A) und auch keine der AS-Austauschmutanten (Abb.15 B) ist zur DNA-Bindung fähig. Im Gegensatz dazu kommt es sowohl mit dem wt Protein als auch in Anwesenheit einer N-teminalen Deletionsmutante (195-580) zu einer Komplexbildung mit der DNA. Da sowohl die Mutante 1-544 als auch die Mutante 195-580 einen Zellzyklusarrest induzieren können, aber die erstgenannte nicht mehr in der Lage ist, DNA zu binden, zeigt dieses Ergebnis auch, dass die Fähigkeit, einen Zellzyklusarrest zu induzieren unabhängig von der DNA Bindungsfähigkeit ist.

Abb. 20: C-terminale Mutationen zerstören die DNA-Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins.

HeLa-Zellen wurden mit den angegebenen Expressionsplasmiden transfiziert und 24 h nach der Transfektion geerntet. Zellextrakte wurden wie unter Abb. 15 beschrieben hergestellt und jeweils 20 µg Proteinextrakt für den Bindungsassay eingesetzt. Anschließend wurde ein Aliquot der Reaktion auf einem 4%igen Polyacrylamidgel gelelektrophoretisch aufgetrennt und mittels Autoradiographie auf Kodak X-Omat Filmen ausgewertet. (A) DNA-Bindung N- und C-terminaler Deletionsmutanten. (B) DNA-Bindung C-terminaler AS-Austauschmutanten. (C) DNA-Bindung einer IE2-Phosphorylierungsmutante.

Abbildung 20 C zeigt eine weitere Mutante mit einer Triple-Punktmutation im N-terminalen Bereich des Proteins, bei der potentielle Phosphorylierungsstellen (T27, S144, T233/S234) durch Alanine substituiert wurden. Von dieser Mutante ist gezeigt worden, dass sie transkriptionell aktiv ist und ihre Mutation im viralen Kontext keine Auswirkungen hat (Heider et al., 2002). Allerdings hat die Mutation dieser drei Phosphorylierungsstellen Auswirkungen auf die Phosphorylierung anderer Bereiche des Proteins (Harel und Alwine, 1998). Wie in Abbildung 20 C zu sehen ist, hat dies jedoch keinen Einfluss auf die DNA-Bindung, was nochmals demonstriert, dass die Bindungsfähigkeit des IE2-Proteins vermutlich nicht über seine Phosphorylierung reguliert wird.

↓77

Alle Mutanten wurden auch in einem Bindungsassay mit der crs-mutierten Targetduplex auf unspezifische DNA-Bindung getestet. Da bei keiner der Mutanten eine unspezifischen Bindung auftrat, wurde auf die Darstellung dieser Bindungsassays an dieser Stelle verzichtet.

3.3.3 Die DNA-Bindung interner Deletionsmutanten

Im folgenden wurden nun all jene internen Deletionsmutanten auf ihre Bindungfähigkeit hin untersucht, die innerhalb der bisher definierten Autoregulationsdomäne zwischen Aminosäure 290 und 580 liegen. Abbildung 21 zeigt das Ergebnis für die Deletionsmutanten del290 bis del470. Während del470 nicht mehr an die DNA bindet, kommt es bei del290, del380 und del430 zur Komplexbildung an der DNA. Diese Ergebnisse korrelieren mit denen aus den Autorepressions-experimenten. Eine Ausnahme ist die Mutante del330, da sie im Vergleich zu den anderen keine Bindungsaktivität zeigt, obwohl sie in den Autorepressionsexperimenten aktiv war (Abb. 21 A). Allerdings ist bei dieser Mutante wiederholt beobachtet worden, dass bei längeren Expositionen eine schwache Bande etwas oberhalb der üblichen IE2-DNA-Bande auftritt (siehe Abb. 21 B, Spur 4, und Abb. 21 C, Spur 4). Eine derartige Bande ist weder bei Kontrollextrakten noch bei einer der anderen IE2-Mutanten beobachtet worden. Dies lässt vermuten, dass bei dieser Mutante eine geringe Fähigkeit zur Interaktion mit der DNA vorhanden ist.

Abb. 21: DNA-Bindung der internen Deletionsmutanten.

(A) HeLa-Zellen wurden mit den angegebenen Expressionsplasmiden transfiziert und 24 h nach der Transfektion geerntet. Zellextrakte wurden wie beschrieben hergestellt und jeweils 20 µg Proteinextrakt für den Bindungsassay eingesetzt. Anschließend wurde ein Aliquot der Reaktion auf einem 4%igen Polyacrylamidgel gelelektrophoretisch aufgetrennt und mittels Autoradiographie auf Kodak X-Omat Filmen ausgewertet. (B) Autoradiographie des gleichen Bindungsassays nach längerer Exposition. (C) Exemplarische Darstellung eines weiteren DNA-Bindungsassays mit den internen Deletionsmutanten zur Demonstration der residualen Bindung der Mutante del330. Durchführung wie unter (A).

↓78

Die Ergebnisse zeigen, dass die bezüglich Autoregulation erhaltenen Daten mit denen der DNA-Bindung korrelieren. Zudem scheint auch die DNA-Bindung hauptsächlich über die komplexe C-terminale Proteindomäne vermittelt zu werden, während eine Mutation N-terminal von AS 470 nicht zwangsläufig zu einem Funktionsverlust führt.

3.3.4 Die postulierte Zinkfingerdomäne

Die Mutante del430 liegt außerhalb der C-terminalen Proteindomäne und zeigt bezüglich aller Aktivitäten dem Wildtyp vergleichbare Level. Dies ist insofern bemerkenswert als diese Mutation im Bereich eines potentiellen DNA-Bindungsmotives im IE2-Protein liegt. Zwischen den Aminosäuren 428 und 452 befindet sich eine postulierte Zinkfingerdomäne. Hierbei handelt es sich um einen singulären Cystein-Histidin-Zinkfinger. Mithilfe von Mutationsanalysen ist gezeigt worden, dass eine Mutation entweder der Cysteine oder der Histidine zu einem Verlust der Autorepression und DNA-Bindungsaktivität führt (Bresnahan et al., 1998;Jupp et al., 1993;Macias und Stinski, 1993;Yeung et al., 1993). Die Mutante del430 jedoch ist nicht nur aktiv in Bezug auf Autorepression und Transaktivierung, sondern zeigt auch eine dem Wildtyp vergleichbare DNA-Bindungsaktivität (Abb. 16A, Spur 6 )

In Abbildung 22 A ist die Aminosäuresequenz des Wildtyp-Proteins in diesem Bereich sowie im Vergleich dazu die Mutante del430 und eine beschriebene Zinkfinger-Mutante dargestellt. In der Zinkfinger-Mutante IE2 HL sind die Histidine durch Leucine ersetzt worden (Yeung et al., 1993), während bei der del430 der mittlere Teil der Zinkfinger-Domäne entfernt wurde. Um die Effekte dieser beiden Mutationen zu vergleichen, wurden die Mutanten parallel in einem Bindungsassay getestet. Da die cDNA der Zinkfingermutante auf das IE2 des HCMV Town- Stamm zurückzuführen ist, wurde auch das parentale Town IE2 auf seine DNA-Bindungsfähigkeit in diesem Assay getestet. Abbildung 22 B zeigt das Ergebnis dieser Untersuchungen.

↓79

Abb. 22: Die putative Zinkfingerdomäne wird für die DNA-Bindung nicht benötigt.

(A) Aminosäuresequenz des IE2-Proteins im Bereich der putativen Zinkfingerdomäne (AS428-452). Dargestellt sind neben dem wt-Protein auch eine Zinkfingermutante (IE2 HL), in der die beiden Histidine durch Leucine ersetzt wurden, sowie die Mutante del430. Die zwanzig deletierten Aminosäuren sind grau unterlegt. (B) Bindungsassay mit Extrakten aus transfizierten HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden mit Expressionsplasmiden für das wt IE2 Protein aus AD169 (IE2 wt) sowie das Town IE2 (IE86) und die beiden Mutanten (IE86-HL und del 430) transfiziert. Vierundzwanzig Stunden nach Transfektion wurden die Zellen wie unter Abb. 15 angegeben geerntet und der Bindungsassay durchgeführt. (C) Immunoblotanalyse zum Nachweis der IE2 Proteine. Jeweils 10 µg der Zellextrakte wurden gelelektrophoretisch aufgetrent und das IE2 Protein durch Immunoblotanalyse mittels α-IE-Antikörper nachgewiesen.

Wie zu erwarten war, ist sowohl das IE2 aus aus dem AD169-Stamm als auch das IE2 aus dem Town-Stamm in der Lage, an die DNA zu binden. Auch bei der Mutante del430 kommt es zu einer Komplexbildung mit der DNA. Im Falle der Zinkfingermutante IE86HL jedoch ist keine DNA-Bindung zu beobachten. Damit zeigt diese Mutante hier das gleiche Verhalten wie in den publizierten Studien, in denen mit bakteriell exprimierten rekombinanten Proteinen gearbeitet wurde. Dies bedeutet, dass die in der DNA-Bindung beobachteten Unterschiede zwischen den beiden Mutanten weder auf die unterschiedlichen parentalen IE2-Formen noch auf unterschiedliche experimentelle Systeme zurückzuführen sind. Darüber hinaus demonstriert dieses Ergebnis die unterschiedliche Qualität der beiden Mutationen. So scheint die Punktmutation der Histidine weitreichendere Auswirkungen auf den C-Terminus des Proteins zu besitzen und darüber zu einem generellen Funktionsverlust zu führen. Im Gegensatz dazu bleibt eine nahezu komplette Deletion des Zinkfingers folgenlos, was zeigt, dass dieser weder für die DNA-Bindung, noch für die Autorepression, die Transaktivierung oder den Zellzyklusarrest notwendig zu sein scheint.

Alle vier Proteine zeigen vergleichbare Expressionslevel (Abb. 22C), wenngleich diese bei der Zinkfingermutante etwas niedriger sind, als beim entsprechenden Wildtyp (IE86). Vorangegangene Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass diese Mengen ausreichend sind, um eine DNA-Bindung beobachten zu können. Wie bereits in der Literatur beschrieben, zeigt das IE2 aus dem Town-Stamm ein anderes Laufverhalten im SDS-Polyacrylamidgel als das IE2 des AD169, obwohl das letztgenannte nur eine Aminosäure mehr besitzt (Cameron und Preston, 1981;Gibson, 1981). Die Ursache dieses veränderten Laufverhaltens ist unklar, jedoch scheinen posttranslationale Modifikationen nicht involviert zu sein, da dieser Effekt auch mit in vitro translatiertem IE2 beobachtet werden kann. Im vorliegenden Fall kommt hinzu, dass die in dieser Arbeit verwendeten IE2 Protein des AD169 Stammes (IE2 wt und del430) N-terminal ein HA-Epitop für den Nachweis in der Immunoblotanalyse besitzen, welches ebenfalls zu den beobachteten Unterschieden im Laufverhalten mit beiträgt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
12.10.2006