4 Diskussion

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Das IE2 Protein repräsentiert den wichtigsten Regulationsfaktor im Rahmen des lytischen Infektionszyklus. Es ist ein essentieller Transaktivator der frühen und späten Genexpression und in der Lage, seine eigene Expression durch direkte Bindung an den MIE Promotor zu regulieren. Darüber hinaus besitzt das IE2 bemerkenswerte zellzyklusregulatorische Eigenschaften, da es sowohl pro- als auch antiproliferative Aktivitäten in sich vereint.

Aufgrund seiner besonderen Bedeutung für das Virus stand und steht das IE2-Protein im Mittelpunkt zahlreicher Untersuchungen. Dennoch ist die Bedeutung einzelner Funktionen bis heute nicht vollständig geklärt. So ist z.B. die physiologische Relevanz der IE2-vermittelten Autorepression oder des Zellzyklusarrest noch immer unklar.

Viren, in denen das IE2-Protein deletiert oder durch Mutation inaktiviert ist, sind nicht replikationsfähig. Auch stehen stabil exprimierende Zelllinien nicht zur Verfügung, um etwaige Defekte in trans zu komplementieren. Da gerade der C-Terminus des Proteins für die Funktionalität, und auch für die Transaktivierung, eine große Rolle spielt und hier die regulatorischen Domänen zahlreicher Aktivitäten überlappen, erschwert dies zusätzlich die Analyse einzelner Funktionen. Zwar gibt es bereits einige Untersuchungen rekombinanter Zytomegalieviren, deren IE2 mutiert ist, doch hat sich gezeigt, dass die beobachteten Effekte nur bedingt dem Verlust spezifischer Funktionen zugeordnet werden kann (Heider et al., 2002;Marchini et al., 2001;Sanchez et al., 2002;White et al., 2004). Aus diesem Grunde ist eine möglichst präzise Kenntnis der regulatorischen Domänen des IE2 Proteins von essentieller Bedeutung, um in Zukunft Fragestellungen zur physiologischen Relevanz einzelner Funktionen direkter bearbeiten zu können.

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In der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Struktur-Funktionsanalyse des HCMV IE2 Proteins durchgeführt. Ziel der Analyse war es, die unterschiedlichen funktionellen Domänen des IE2 Proteins genauer zu definieren und zu untersuchen, inwieweit diese Domänen überlappen oder strukturell unabhängig sind. Längerfristig soll so der Weg geebnet werden, um diskriminierende Mutationen im viralen Kontext untersuchen zu können. Hierfür wurden verschiedene IE2-Mutanten generiert und auf ihre Funktionsfähigkeit bezüglich Induktion eines Zellzyklusarrests, Transaktivierung, Autoregulation und DNA-Bindung hin untersucht.

4.1  Die IE2-DNA-Bindung

Wie in der Einleitung erläutert, war in der Vergangenheit von Schwierigkeiten berichtet worden, die direkte Bindung des IE2-Proteins an die DNA nachzuweisen (Chiou et al., 1993;Lang und Stamminger, 1994), weshalb der Großteil der Studien bisher mit bakteriell exprimierten rekombinanten Proteinen durchgeführt wurde (Ahn et al., 1998;Chiou et al., 1993;Jupp et al., 1993;Lang und Stamminger, 1993;Lang und Stamminger, 1994;Macias et al., 1996;Macias und Stinski, 1993;Waheed et al., 1998)

Als mögliche Ursache für die beobachteten Schwierigkeiten wurden die eher ungewöhnlichen Bindungseigenschaften des IE2 Proteins diskutiert. IE2 bindet an die DNA über Interaktionen mit der kleinen Furche (Lang und Stamminger, 1994) und ist sensitiv gegenüber bestimmten Kompetitor-DNAs, wie poly(dI-dC)·(dI-dC) (Chiou et al., 1993). Ein Vergleich der bisher identifizierten IE2-Bindungsstellen innerhalb des MIE sowie eines HCMV early Promotors ergibt zudem nur eine geringe Ähnlichkeit der jeweiligen Bindungssequenzen. IE2 scheint demnach mit einem breiten Spektrum sehr unterschiedlicher Zielsequenzen zu interagieren und vornehmlich strukturelle Eigenschaften der DNA zu erkennen (Arlt et al., 1994). Darüber hinaus wurde auch eine Abhängigkeit der Bindungsfähigkeit vom Modifikationsgrad des Proteins diskutiert, da eine DNA-Bindung des IE2 aus Extrakten von stabil exprimierenden Zellen gezeigt werden konnte, wenn die Extrakte mit Phosphatase behandelt wurden (Ahn et al., 1998).

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In einer neueren Studie konnte jedoch eine DNA-Bindung nachgewiesen werden, wenn das IE2-Protein aus Extrakten transient transfizierter Zellen über eine Heparin-Sepharose-Säule aufgereinigt wurde. Zwar war auch hier nur eine schwache Bindung zu beobachten, doch konnte diese durch Zugabe eines IE2-spezifischen Antikörpers zusätzlich stabilisiert werden (Huang und Chen, 2002). So könnte dies darauf hindeuten, dass die Bindungsfähigkeit des Proteins auch durch die Art der Aufreinigung wesentlich beeinflusst wird und die vermutlich schwache IE2-DNA-Interaktion leicht zerstört werden kann.

Ausgehend von den publizierten Studien wurde in dieser Arbeit ein DNA-Bindungsassay etabliert, der es ermöglicht, die Bindung des IE2 Proteins an die DNA relativ einfach nachzuweisen, unabhängig davon, ob das Protein von transient transfizierten oder virus-infizierten Zellen stammte. Das hier entwickelte experimentelle Protokoll unterschiedet sich in wesentlichen Punkten von früheren Assays.

Der Zellaufschluss erfolgte mittels Ultraschall in einem Puffer mit geringem Salzgehalt, da sich gezeigt hat, dass dies für die Untersuchung der DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren am günstigsten ist (Truss, 1992). Generell können durch Erhöhung der Salzkonzentration die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Protein und DNA abgeschwächt und die Affinität somit herabgesetzt werden. In der Regel werden Zellextrakte daher in der Gegenwart von 50-100 mM NaCl oder KCl hergestellt, um die Proteine während der Präparation von der DNA zu lösen. (Latchman). Da jedoch zu erwarten war, dass die IE2-DNA-Bindung eine eher geringe Affinität aufweist, wurde auf die Zugabe von Salzen im Probenpuffer verzichtet. Bei einer Präparation der Extrakte in einem Puffer mit geringem Salzgehalt bleibt zudem die Möglichkeit bestehen, in den Bindungsansätzen verschiedene Salze und Salzkonzentrationen auszutesten.

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Durch die Zugabe nicht-spezifischer Proteine wie z.B. BSA kann die spezifische DNA-Interation stabilisieren werden. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass das BSA die Adsorption der Proteine an die Oberflächen der Reaktionsgefäße und Gelplatten verhindert. Darüber hinaus beeinflusst es möglicherweise die Konformation der Proteine indem es die Anordnung der umgebenden Wassermoleküle verändert (Zhang et al., 1992). Auch im Falle des TBP, welches ebenfalls über Interaktionen mit der kleinen Furche an die DNA bindet, konnte so die DNA-Bindung verbessert werden (Jupp et al., 1993;Liebermann, 1991). Aus diesem Grunde wurden alle Bindungsansätze in der Gegenwart von 3 µg/µl BSA durchgeführt.

Im Gegensatz zu anderen Studien, war die in der vorliegenden Arbeit verwendete Targetduplex mit 60 Basenpaaren deutlich länger als üblich (Ahn et al., 1998;Chiou et al., 1993;Huang und Chen, 2002;Tsai et al., 1997;Waheed et al., 1998). Es ist möglich, dass eine längere Zielsequenz eher in der Lage ist, die Bindung des Proteins an die DNA zu stabilisieren, oder die DNA eine für die Bindung notwendige Struktur einnehmen kann. Dies ist vor allem vor dem Hintergrund von Relevanz, dass das IE2-Protein Dimere bilden kann und vermutlich als Multimer an die crs bindet (Ahn et al., 1998;Lang und Stamminger, 1994;Waheed et al., 1998).

Ein Einfluss des Phosphorylierungsgrades des IE2 auf die DNA Bindungsfähigkeit konnte nicht beobachtet werden. Weder hatte die Zugabe von Alkalischer Phosphatase im Bindungsansatz einen Einfluss auf die Bindungsfähigkeit des Proteins (Abb. 10) noch zeigte eine Mutante, bei der putative Phosphorylierungsstellen des IE2 mutiert sind, ein verändertes Bindungsverhalten (Abb. 20C). Eine durch die Phosphorylierung möglicherweise induzierte Konformationsänderung scheint daher die DNA-Bindungs-fähigkeit nicht zu beeinträchtigen.

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Eine DNA-Bindung des IE2 Protein ist nur in Gegenwart von Magnesiumionenim Bindungsansatz beobachtet worden. Zweiwertige Kationen können die Protein-DNA-Bindung stabilisieren (Robidoux et al., 1992), da sie die negativen Ladungen des Phosphatrückgrats der DNA neutralisieren können und die DNA so alternative, für die Proteinbindung günstigere Konformationen eingehen kann.

Die Anwesenheit von Natriumchlorid im Bindungsansatz wirkte sich eher negativ aus, da es zum Auftreten unspezifischer Banden kam, während die spezifische Bande schwächer wurde. Offensichtlich kam es hier zu einer Schwächung der spezifischen Protein-DNA-Interaktion, während die Bindungsbedingungen für nichtspezifischen Proteine verbessert wurden.

Unter diesen optimierten Bindungsbedingungen konnte eine DNA-Bindung nicht nur mit Extrakten aus transfizierten Zellen, sondern erstmals auch mit Extrakten HCMV-infizierter Zellen nachgewiesen werden. Bei Verwendung von Zellextrakten aus transienten Transfektionen war bei den HeLa-Zellextrakten eine stärkere Komplexbildung zu beobachten als bei U373-Zellextrakten, was jedoch vermutlich auf die geringere Transfektionseffizienz in U373-Zellen zurückzuführen ist, die zu einer ca. 5-fach geringeren Expression des IE2-Proteins führte. Die DNA-Bindung des IE2-Proteins war sowohl in den nicht-permissiven wie auch in den HCMV-permissiven Zellen eindeutig nachzuweisen.

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Im Rahmen der Virusinfektion konnte eine Komplexbildung an der crs-Zielsequenz nach 48 h beobachtet werden. Aufgrund der bisherigen Informationen über das Vermögen anderer IE2-Isoformen wie z.B. dem IE2p40 (Jenkins et al., 1994), den MIE Promotor zu reprimieren, ist zu vermuten, dass während der HCMV-Infektion auch andere Komplexe als reine IE2-Monomere an die DNA binden. Dafür spricht auch, dass die mit HCMV-Extrakten im Bandshift beobachtete Bande weniger distinkt war als bei Extrakten aus transienten Transfektionen. In der Immunoblotanalyse der Virusextrakte konnte zwischen 33 und 48 Stunden nach der Infektion ein deutlicher Anstieg in der Menge des late IE2p40-Proteins beobachtet werden. Auch bei der 55kDa-IE2-Variante ist ein Anstieg zu verzeichnen, während die IE2-Menge nur gering zu nimmt. Da für die 55kDa-Variante bereits beschrieben ist, dass sie nicht in der Lage ist, den MIE Promotor zu reprimieren (Baracchini et al., 1992;Hermiston et al., 1990), ist nicht zu vermuten, dass sie an die DNA bindet. Wahrscheinlicher ist, dass das IE2p40-Protein, als Monomer oder im Komplex mit dem IE2-Protein, an der DNA-Bindung beteiligt ist. Allerdings müsste dies noch genauer untersucht werden. Zudem kann nicht ausgeschlossen werden, dass während der HCMV Infektion weitere virale Proteine die Protein-DNA-Interaktion stabilisieren können. Durch Zugabe eines IE-spezifischen Antikörpers konnte, wie auch schon bei den Extrakten transfizierter Zellen, die Bildung eines Supershifts induziert werden. Ein Antiserum, das gegen den C-Terminus des IE2-Proteins gerichtet ist, führte im Gegensatz dazu zu einer Inhibition der DNA-Bindung.

Die biologische Relevanz der Autorepression ist noch nicht genau geklärt. Zwar konnte gezeigt werden, dass HCMV-Mutanten, in denen die crs mutiert ist, zu einen vorzeitigen Zelltod durch Apoptose führen, doch ist die genaue Ursache dieser Beobachtung noch unklar (Greaves, 2003). Mit dem nunmehr etablierten Bindungsassay wird es jedoch in Zukunft möglich sein, Fragestellungen zur IE2-crs-Interaktion während der Virusinfektion direkter zu bearbeiten.

4.2 IE2-Struktur-Funktionsanalyse

4.2.1  Der C-Terminus

In der vorliegenden Mutationsanalyse hat sich gezeigt, dass der C-Terminus des IE2-Proteins von besonderer Bedeutung für seine Funktionalität ist. In einem Bereich von Aminosäure 470 bis 544 überlappen die funktionellen Domänen der untersuchten Aktivitäten und führen schon kleine Mutationen zu erheblichen Funktionsverlusten. Dieser Bereich des Proteins scheint demnach eine Art funktionelle Kerndomäne („Core“) darzustellen. Die Struktur des Core ist vermutlich komplex und für die Funktionalität von großer Bedeutung, da schon kleinere AS-Austausche zu einer Beeinträchtigung der Funktionsfähigkeit führen. Die Ausdehnung dieser Domäne hat sich jedoch als deutlich geringer erwiesen als bisher vermutet.

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Die äußersten C-terminalen Aminosäuren sind für die Zellzyklusarrestfunktion nicht erforderlich. Da die Mutante 1-544 noch in der Lage ist, einen Zellzyklusarrest zu induzieren, aber nicht mehr transaktiviert, autoreprimiert und DNA bindet, definiert dies die C-terminale Grenze des Core (Abb. 23). Darüber hinaus zeigt diese Mutante, dass die Induktion des Zellzyklusarrests unabhängig von der Transaktivierungsfähigkeit des Proteins ist (bereits beschrieben in (Wiebusch und Hagemeier, 1999) sowie von einer Bindung an crs-ähnliche Sequenzen. Das Core erstreckt sich vermutlich noch bis zur Aminosäure 552, da beschrieben wurde, dass eine Mutante, bei der die letzten 28 Aminosäuren deletiert wurden (1-552) noch autoreguliert und DNA bindet, jedoch nicht mehr transaktivieren kann (Macias et al., 1996). Dies bedeutet, dass die äußersten C-terminalen Aminosäuren nur für die Transaktivierung benötigt werden und deckt sich damit, dass sie als Teil einer unabhängigen und übertragbaren Transaktivierungsdomäne identifiziert worden sind (Pizzorno et al., 1991). Somit scheinen sie eine funktionelle Domäne darzustellen, die von der Kerndomäne unabhängig ist.

Die Ausdehnung des Core in N-terminale Richtung wurde durch die internen Deletionsmutanten genauer definiert. Hierbei ergab sich, dass die N-terminale Grenze dieser Domäne vermutlich zwischen Aminosäure 450 und 470 liegt. Eine Mutante, die noch innerhalb der Kerndomäne liegt (del470) verhält sich wie die C-terminalen Aminosäure-Austauschmutanten und ist in ihrer Funktionsfähigkeit stark eingeschränkt. Die Mutante del430 hingegen zeigt in allen Assays nahezu Wildtyp-Aktivität, was bedeutet, dass die Aminosäuren 430-349 für die Funktionalität des Proteins nicht benötigt werden und somit außerhalb der Kerndomäne liegen.

Das Core wird demnach aus rund hundert Aminosäuren gebildet und scheint somit deutlich kleiner zu sein, als frühere Untersuchungen vermuten ließen (Chiou et al., 1993;Hermiston et al., 1990;Malone et al., 1990;Pizzorno et al., 1991;Stenberg et al., 1990).

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Keine der Mutanten innerhalb des Core war in der Lage zu transaktivieren oder DNA zu binden und alle wiesen nur noch residuale Aktivität in Bezug auf den Zellzyklusarrest auf. Trotz der fehlenden DNA-Bindung wurde jedoch auch bei diesen Mutanten eine leichte Reduktion der Promotoraktivität des MIE Promotors beobachtet. Dies ist teilweise auch in der Literatur zu finden. Bei einigen, als bindungsinaktiv eingestuften Mutanten, ist im Vergleich zu kontroll-transfizierten Zellen ebenfalls eine geringe Reduktion der Promotoraktivität beobachtet worden (Lashmit et al., 1998;Pizzorno et al., 1991). Wie diese Effekte zustande kommen, ist noch unklar. Da das IE2-Protein bekanntermaßen mit einer Vielzahl an Faktoren interagieren kann, kommt es möglicherweise durch die Anwesenheit auch eines bindungs-inaktiven IE2-Proteins zur Kompetition um zelluläre Faktoren, die in den kontroll-transfizierten Zellen nicht auftritt. Zudem kann nicht ausgeschlossen werden, dass IE2 auch dann einen reprimierenden Effekt auf den Promotor ausüben kann, wenn es nicht direkt an die crs bindet, sondern lediglich mit anderen Faktoren am Promotor interagiert.

4.2.2 N-terminale Sequenzen

Die N-terminalen Sequenzen des IE2-Proteins wurden mittels interner Deletionen untersucht. Dieser Teil des Proteins scheint eine grundsätzlich andere Qualität zu besitzen als das C-terminale Core. Mutationen in dieser Region, also zwischen Aminosäure 230 und 450, hatten entweder gar keine oder nur selektiv Auswirkungen auf die Funktionsfähigkeit des IE2 Proteins. Dadurch war es möglich, einzelne Sequenzen zu identifizieren, die für bestimmte Funktionen erforderlich sind, für andere jedoch nicht. So führte die interne Deletion der Aminosäuren 260-279 zu einer Beeinträchtigung der Zellzyklusarrestaktivität und Transaktivierung, während die Autorepression unbeeinflusst war. Wurden die Aminosäuren 330-359 deletiert, so führte dies zu eingeschränkter Transaktivierung und DNA-Bindungsfähigkeit, doch blieben die Zellzyklusarrestfunktion sowie die Autorepression intakt. Sowohl die Mutante del260 als auch del330 zeigten bezüglich Transakivierung eine residuale Aktivität von 30% bzw. 50% im Vergleich zum Wildtypprotein. Sie unterscheiden sich somit deutlich von Mutationen, die innerhalb des Core liegen, da diese zu einem vollständigen Funktionsverlust führten. Dies demonstriert die unterschiedlichen Qualitäten dieser beiden Bereiche im IE2-Protein. Während beim Core eine intakte Gesamtstruktur absolut essentiell ist, sind es im N-terminalen Teil des Proteins lediglich einzelne Bereiche, die in die Vermittlung einzelner Funktionen involviert sind und die sich somit auch als separate „Domänen“ untersuchen lassen.

Dadurch lassen sich hier auch Sequenzen identifizieren, die für die untersuchten Aktivitäten nicht benötigt werden. Dort, wo es zur Beeinträchtigung der Funktionsfähigkeit kam, war die Transaktivierung, der Zellzyklusarrest oder die DNA-Bindung betroffen. Im Gegensatz zum Core scheinen über die N-terminalen Sequenzen einzelne Aktivitäten spezifisch reguliert zu werden. Dieser Bereich stellt daher eine essentielle, spezifische Modulatordomäne (SEM) dar.

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Die Mutante del330 liegt außerhalb des Core und zeigt einen partiellen Funktionsverlust. Sie ist in der Lage, einen Zellzyklusarrest zu induzieren und den MIE Promotor zu reprimieren, doch kann sie nur noch eingeschränkt transaktivieren. Im DNA Bindungsassay wies diese Mutante nur eine minimale Bindungsfähigkeit auf. Allerdings konnte bei ihr im EMSA wiederholt eine schwache Bande beobachtet werden, die auf eine Komplexbindung zurückgeführt werden könnte. Diese diffuse Bande war von deutlich geringerer Intensität als die Banden, die beim Wildtyp und DNA-bindenden Mutanten beobachtet wurde. Allerdings war das schwache Signal nur bei der Mutante del330, nie aber bei nicht-bindenden Mutanten oder bei Kontrollextrakten zu beobachten. Die Frage ist nun, wie sich die Fähigkeit der Mutante del330, den MIE Promotor zu reprimieren, vor dem Hintergrund der so deutlich eingeschränkten DNA-Bindungsfähigkeit erklären lässt. Hierfür gibt es zwei mögliche Erklärungen. Zum einen könnte die Interaktion des IE2 Proteins mit der crs in vivo durch Interaktion mit anderen zellulären Faktoren stabilisiert werden. Dies könnte eine eingeschränkte Bindungfähigkeit ausgleichen und zu einer erfolgreichen Repression des Promotors führen. Unter den in vitro Bindungsbedingungen jedoch fehlt dann die Stabilisierung und reicht die residuale Bindungsfähigkeit nicht aus, um zu einer Komplexbildung zu führen.

Andererseits kann nicht ausgeschlossen werden, dass in vivodie DNA-Bindungsdomäne für die Autorepression gar nicht zwingend erforderlich ist, solange die crs in cis eine strukturelle Komponente beisteuert, die es ermöglicht, dass das IE2-Protein über Protein-Protein-Interaktionen an den Promotor rekrutiert wird. Die erstere Möglichkeit scheint jedoch wahrscheinlicher, zum einen aufgrund der beobachteten residualen Bindungsfähigkeit der Mutante del330, zum anderen, weil in den übrigen Fällen die Fähigkeit zur DNA-Bindung mit der zur Autorepression korrelierte, die direkte DNA-Bindung also durchaus für die Autorepression erforderlich zu sein scheint.

Daher ist anzunehmen, dass die Aminosäuren 330-349 eine strukturelle Einheit darstellen, die vor allem für die Darstellung der DNA-Bindung in vitro eine limitierende Funktion besitzt. Dies ist insofern interessant als die Mutation del330-349 außerhalb der in früheren Untersuchungen identifizierten DNA-Bindungsdomäne liegt, die in Experimenten mit GST-Fusionsproteinen zwischen Aminosäure 346 und 579 lokalisiert wurde (Chiou et al., 1993). In einer anderen Studie, die die DNA-Bindung mittels eines yeast-one-hybrid-Assays untersuchte (Ahn et al., 1998), ist allerdings ebenfalls beobachtet worden, dass eine interne Deletion, die außerhalb der Bindungsdomäne liegt, nicht mehr an die DNA binden konnte. Bei der dort beschriebenen Mutation handelte es sich um die Deletion der Aminosäuren 313 bis 358, sie liegt also in der gleichen Region wie die der hier verwendeten Mutante del330. In der Studie von Ahn et al. ist zudem beobachtet worden, dass eine interne Deletion der Sequenzen zwischen 313 und 358 zu einer höheren Dimerisierungsaktivität des Proteins führt, weshalb vermutet wurde, dass dieser Bereich eine Art Repressordomäne für die Dimerisierung darstellen könnte. Daher ist es möglich, dass Deletionen im Bereich zwischen Aminosäure 313 bis 346, also auch im Bereich unserer Mutante del330, die Bildung größerer monomerer Komplexe fördern und dies die in vitro DNA Bindung behindert.

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Die Deletion del260-289 ist die zweite Mutation außerhalb der Kerndomäne, die zu einem Funktionsverlust führte. Die Mutante del260 kann nur noch schwach transaktivieren und einen Zellzyklusarrest induzieren. Ihre Fähigkeit, den MIE Promotor zu reprimieren ist hingegen nicht beeinträchtigt.

Die Mutation der del260 liegt in einem Bereich des Proteins, der stark phosphoryliert wird (Harel und Alwine, 1998). An dieser Stelle unterscheiden sich auch die beiden IE2-Varianten. Während das IE2 aus dem AD169 Stamm an dieser Stelle 8 aufeinanderfolgende Serinreste enthält, sind es bei dem Town IE2 nur 7. Das zusätzliche Serin ist mit einer stärkeren Transaktivierungsfähigkeit in Verbindung gebracht worden (Barrasa et al., 2003). Daher ist es nicht verwunderlich, dass eine nahezu komplette Deletion dieser Serine einen Einfluss auf die Transaktivierungsfähigkeit hat. Darüber hinaus ist dieses Ergebnise in Übereinstimmung mit früheren Studien, die bei einer internen Deletionsmutante (Δ136-290) ebenfalls eine Reduktion der Transaktivierung beobachtet haben (Hofmann et al., 2000;Sommer et al., 1994). Die Deletion der Aminosäuren 260–289 beeinflusst auch die Zellzyklusaktivität des Proteins. Dies ist etwas unerwartet, da eine Mutante mit einer größeren internen Deletion (Δ136-290) noch in der Lage ist, einen Zellzyklus zu induzieren (Wiebusch und Hagemeier, 1999). Möglicherweise hat die Deletion der Phosphorylierungsstellen einen Einfluss auf die Konformation des Proteins an dieser Stelle, der sich dominant-negativ auf die Zellzyklusarrestaktivität auswirkt, während die Deletion der gesamten Region (Δ136-290) keine Auswirkungen auf diese Funktion hat. Dass gerade die an der Phosphorylierung des Proteins beteiligten Aminosäuren einen Einfluss auf seine Konformation ausüben können, ist auch von auch Harel et al. beschrieben worden. Die Mutation zweier potentieller Phosphorylierungs-stellen an Position 233 und 234 hatte umfangreiche Auswirkungen auf die Phosphorylierung und Konformation des gesamten Proteins (Harel und Alwine, 1998). Dies könnte auch bei der Mutante del260 der Fall sein. Allerdings scheint das Core bei dieser Mutante noch intakt zu sein, da sie in Bezug auf die Autorepression noch Wildtypaktivität zeigt.

4.2.3 Die postulierte Zinkfingerdomäne

Trotz zahlreicher Untersuchungen zur DNA-Bindung des IE2-Proteins, ist das eigentliche DNA-bindende Proteinmotiv noch unbekannt. IE2 weist keine Homologien zu anderen bekannten DNA-bindenden Proteinen auf und kann daher bisher keiner bestimmten Klasse zugeordnet werden. Jedoch wurde bisher der postulierten Zinkfingerdomäne im C-Terminus des Proteins eine besondere Bedeutung für die DNA Bindung und Autorepression zugeschrieben.

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Ein Ausgangspunkt hierfür war die Feststellung, dass die verschiedenen IE2-Isoformen nicht alle in der Lage sind, den MIE Promotor zu reprimieren. Das durch die Transkription von einem internen Promotor gebildete late IE2p40-Protein besteht aus den Aminosäuren 242 bis 579. Es kann den MIE Promotor reprimieren und somit vermutlich an die DNA binden (Jenkins et al., 1994). Im Gegensatz dazu ist das IE55 nicht mehr zur Autorepression in der Lage und vermittelt im Gegenteil eine Aktivierung des Promotors (Baracchini et al., 1992). Dem IE55 fehlen im Vergleich zum Wildtyp Protein die Aminosäuren 365-519, innerhalb derer sich der postulierte Zinkfinger sowie eine Leucin-reiche Region befinden. Dieser singuläre Cystein-Histidin-Zinkfinger ist bisher nur aufgrund seiner Primärsequenz mittels Mutationsanalysen untersucht worden, bei denen entweder die Cysteine des Zinkfingers durch Serine oder die Histidine durch Leucine ersetzt wurden (Jupp et al., 1993;Macias und Stinski, 1993;Yeung et al., 1993). Ein funktioneller Nachweis der Abhängigkeit der DNA-Bindung von anwesenden Zinkionen erfolgte bisher jedoch nicht.

Keine der genannten Zinkfingermutanten ist mehr in der Lage, den MIE Promotor zu reprimiern oder an die DNA zu binden (Bresnahan et al., 1998;Jupp et al., 1993;Macias und Stinski, 1993;Yeung et al., 1993). Allerdings gibt es unterschiedliche Ergebnisse bezüglich der Transaktivierungsfähigkeit dieser Mutanten. Während in einer Untersuchung keine der beiden Mutanten in der Lage war, den HIV LTR-Promotor zu aktivieren (Yeung et al., 1993) wurde in zwei anderen beschrieben, dass die Cysteinmutante den MIE Promotor aktiviert, statt ihn zu reprimieren und auch zu einer leichten Aktivierung des SV40 Promotors führte (Bresnahan et al., 1998;Jupp et al., 1993). In der hier verwendeten Mutante del430 ist der Zinkfinger nahezu komplett deletiert. Dennoch ist diese Mutante in der Lage, zu autoregulieren und DNA zu binden und transaktiviert sowohl den UL112/113 als auch den c-fos Promotor. Bei einer parallelen Untersuchung der del430 mit einer publizierten Zinkfingermutante verhielten sich beide Mutanten erwartungsgemäß, d.h. die Mutante del430 konnte an die DNA binden, die Zinkfingermutante jedoch nicht. Daraus lässt sich zweierlei schlussfolgern. Zum einen scheint der Zinkfinger per se als DNA-bindendes Motiv nicht notwendig zu sein. Zum anderen wird deutlich, dass die beiden untersuchten Mutationen, nämlich die Deletion der AS 430 bis 449 und die Punktmutation der beiden Histidine in ihrer Auswirkung nicht gleichwertig sind. Die Punktmutation des Zinkfingers scheint vielmehr einen dominant-negativen Effekt auf die Struktur des C-Terminus haben, der dann einen Funktionsverlust zur Folge hat. Jupp et al. berichteten, dass die Zinkfingermutante den MIE Promotor aktiviert, und folgerten dementsprechend, dass der C-Terminus noch intakt sein müsse. Da aber in einer Studie von Yeung et al. keine der beiden Zinkfingermutanten in der Lage war, den HIV LTR-Promotor zu aktivieren (Yeung et al., 1993), lässt sich nicht eindeutig sagen, ob der C-Terminus in diesen Mutanten noch intakt ist oder ob durch die Einfügung der Punktmutationen seine Struktur zerstört wurde. Eigene Beobachtungen haben gezeigt, dass die Zinkfingermutante auch den UL112/113-Promotor nicht mehr aktivieren kann. Die Ergebnisse der Mutante del430 sprechen daher dafür, dass der Zinkfinger als solcher kein essentielles DNA-Bindungsmotif darstellt, seine Zerstörung durch Punktmutationen aber einen dominant-negativen Effekt auf die Funktionsfähigkeit ausüben kann.

Diese Annahme wird dadurch unterstützt, dass das Zinkfingermotiv zwischen verschiedenen CMV-Spezies nicht konserviert ist. Bei einem Sequenzvergleich an dieser Stelle fällt auf, dass bereits bei dem IE2 aus Simian CMV anstelle des ersten Cycteins ein Isoleucin vorhanden ist (Barrasa et al., 2003;Chiou et al., 1993). Trotzdem konnte gezeigt werden, dass sowohl der Simian MIE Promotor durch das IE2 des HCMV als auch der humane MIE Promotor durch das Simian IE2-Protein reprimiert werden kann und somit die cis- wie auch die trans- agierenden Elemente in beiden Spezies konserviert zu sein scheinen (Pizzorno und Hayward, 1990).

4.3 Aufbau und Lokalisation der regulatorischen Domänen des IE2-Proteins

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Die Ergebnisse unserer Analysen ergeben ein neues Bild vom funktionellen Aufbau des IE2-Proteins. Ein entsprechendes Schema des IE2 und seiner regulatorischen Domänen ist in Abbildung 23 dargestellt.

Abb. 23: Funktionelle Domänen im HCMV IE2-Protein.

Der C-Terminus des IE2-Proteins bildet eine komplexe Kerndomäne („Core“), die hauptsächlich an der Vermittlung der Zellzyklusarrest-Aktivität, der Transaktivierung sowie der Autoregulation und DNA-Bindung beteiligt ist. Die N-terminale Grenze dieser Domäne liegt zwischen AS 450 und 470, C-terminal reicht sie vermutlich bis zur Aminosäure 552 (siehe Erläuterungen im Text). Die äußersten C-terminalen Aminosäuren werden nur für die Transaktivierung benötigt. An das Core schließt sich eine spezifische, essentielle Modulatordomäne (SEM) an. Sie ist ebenfalls essentiell für die Funktionsfähigkeit des Proteins, aber deutlich weniger sensitiv gegenüber Mutationen. Innerhalb dieser Region können Sequenzen identifiziert werden, die an der Vermittlung einzelner Funktionen beteiligt sind. Die N-terminale Grenze der Modulatordomäne ist noch unklar. Die äußersten N-terminalen Sequenzen enthalten eine weitere unabhängige Aktivierungsdomäne (AS 25-85). Für den Zellzyklus, die Autoregulation und die DNA-Bindung werden die ersten 195 Aminosäuren (1-195) jedoch nicht benötigt. Der putative Zinkfinger (pZF) liegt außerhalb der Kerndomäne und stellt kein essentielles DNA-Bindungselement dar. (NLS- Nuclear Localization Signal, AD- Aktivierungsdomäne)

Innerhalb einer komplexen Kerndomäne, dem Core, im C-Terminus des Proteins (AS 450–544) überlappen die funktionellen Domänen für den Zellzyklusarrest, die Transaktivierung, die Autoregulation und DNA-Bindung. Mutationen innerhalb des Core haben globale Auswirkungen und führen zu dramatischen Funktionsverlusten. Dies lässt vermuten, dass die Struktur des Proteins an dieser Stelle komplex ist. Die Grenze des Core liegt N-terminal zwischen AS 450 und 470, auf C-terminaler Seite vermutlich bei AS 552 (Macias et al., 1996). Die äußersten C-terminalen Aminosäuren bilden eine unabhängige Aktivierungsdomäne, die ausschließlich für die Transaktivierung benötigt wird (Pizzorno et al., 1991). Die putative Zinkfingerdomäne liegt außerhalb der Kerndomäne und scheint für die Funktionsfähigkeit des Proteins nicht benötigt zu werden.

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In N-terminaler Richtung schließt sich an die Kerndomäne eine Art spezifische Modulatordomäne an. Auch diese Domäne ist, wie die Kerndomäne, essentiell für die Funktionalität des Proteins, denn keine der untersuchten Aktivitäten kann alleine durch die Kerndomäne vermittelt werden. Allerdings ist innerhalb der Modulatordomäne ein niedrigerer Grad der Überlappung funktioneller Domänen zu beobachten. Darüber hinaus enthält sie zahlreiche nicht-essentielle Abschnitte. So konnten durch Mutationen Bereiche identifiziert werden, die für nur bestimmte Funktionen benötigt werden. Darüber hinaus ist die Modulatordomäne insgesamt weniger sensitiv gegenüber Mutationen, was auf eine weniger komplexe Struktur hinweisen könnte. Keine der Mutationen innerhalb dieser Domäne führt zu einem vollständigen Funktionsverlust bezüglich der untersuchten Aktivitäten. Die Grenze der Modulatordomäne in N-terminaler Richtung ist noch unklar. Vermutlich liegt sie zwischen Aminosäure 195 und 290, da für die N-terminalen Aminosäuren bereits beschrieben ist, dass sie für die Autorepression und DNA-Bindung sowie für die Zellzyklusarrestinduktion nicht erforderlich sind (Chiou et al., 1993;Pizzorno und Hayward, 1990;Pizzorno et al., 1991;Wiebusch und Hagemeier, 1999). Lediglich die Transaktivierung ist auf den N-Terminus angewiesen, da sich auch hier eine unabhängige, azide Aktivierungsdomäne (AS25-85) befindet (Pizzorno et al., 1991).

Die Beobachtung, dass die Kerndomäne nur ca. 100 Aminosäuren umfasst und die Modulatordomäne zahlreiche nicht-essentielle Abschnitte enthält, steht im Gegensatz zu publizierten Studien, die gezeigt haben, dass vor allem die Fähigkeit zur Autoregulation und DNA-Bindung schon durch kleine Mutationen in dem Bereich zwischen Aminosäure 290 und 470 verloren geht (Ahn et al., 1998;Waheed et al., 1998). In unserer Untersuchung jedoch waren alle internen Deletionsmutanten, bis auf die del470, noch in der Lage, den MIE Promotor zu reprimieren, was an zwei verschiedenen Promotorkonstrukten demonstriert wurde. Darüber hinaus konnten wir auch die direkte DNA-Bindung dieser Mutanten nachweisen.

Für die unterschiedlichen Ergebnisse können mehrere Faktoren verantwortlich sein. Ein wichtiger Aspekt ist der Einfluss des jeweils verwendeten experimentellen Systems. So wurden alle Experimente dieser Arbeit in HCMV-permissiven U373-Zellen oder HeLa-Zellen durchgeführt, während in den anderen Studien nicht-permissive Vero-Zellen zum Einsatz kamen, bei denen es sich um Affen-Nierenzellen handelt (Ahn et al., 1998;Waheed et al., 1998).

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Darüber hinaus benutzten Waheed et al. und Ahn et al. für die DNA Bindungsassays GST-Fusionsproteine, die lediglich den C-Terminus des IE2-Proteins enthielten, verwendet oder exprimierten das IE2 als Fusionsprotein in Hefen. Es ist nicht auszuschließen, dass sich die verschiedenen experimentellen Systeme hinsichtlich vorhandener Co-Faktoren und eventuell auch in Bezug auf posttranslationale Modifikationen unterscheiden und dies die Ergebnisse beeinflusst.

Ein weiterer Unterschied besteht in der Verwendung unterschiedlicher IE2-Varianten. In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem IE2 des HCMV AD169 Stammes gearbeitet, während in den anderen das IE2 des HCMV Town Stammes zum Einsatz kam. Die Aminosäuresequenzen dieser beiden IE2-Varianten unterscheiden sich an vier Positionen. Es gibt drei Aminosäure-Austausche (R68Q, K455E, und T541A) [die Aminosäureposition bezieht sich hier auf das IE2 des Town Stammes] und im Bereich zwischen Aminosäure 258 und 264 befinden sich bei dem IE2 des Town Stammes 7, beim IE2 aus AD169 8 aufeinanderfolgende Serine. Das IE2 des AD169 besitzt demnach eine zusätzliche Aminosäure. In einer aktuellen Studie, in der der Einfluss verschiedener Sequenzunterschiede auf die Funktionsfähigkeit untersucht wurde, konnte gezeigt werden, dass das IE2 aus dem AD169 Stamm insgesamt aktiver in Bezug auf die Transaktivierung ist (Barrasa et al., 2003). Es ist nicht auszuschließen, dass dies auch auf die Autorepression und den Zellzyklusarrest zutrifft.

Abschließend ist anzumerken, dass innerhalb der Modulatordomäne möglicherweise weitere Sequenzen identifiziert werden können, die für die Funktionalität des Proteins benötigt werden, die aber in der vorliegenden Arbeit nicht analysiert wurden. Wesentlich ist jedoch, dass mit der Modulator- und der Kerndomäne im IE2 Protein zwei Bereiche von unterschiedlicher Qualität identifiziert worden sind und nur innerhalb der Kerndomäne Mutationen zu einem vollständigen Funktionsverlust führten.

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Was bedeutet dies für die eingangs dargestellte Zielsetzung und Fragestellung? Für die Untersuchung einzelner Funktionen im viralen Kontext ist es notwendig, diese gezielt und möglichst vollständig ausschalten zu können. Da nur Mutationen innerhalb der Kerndomäne zu einem absoluten Funktionsverlust führten, qualifiziert vor allem sie sich für weitergehende Untersuchungen. Um zwischen den einzelnen IE2-Funktionen diskriminierende Mutanten zu entwickeln, ist es sinnvoll, diese rund hundert Aminosäuren umfassende Domäne mittels feinerer Mutationen systematisch zu analysieren. Aufgrund der naheliegenden Annahme, dass den verschiedenen Funktionen unterschiedliche Mechanismen und auch unterschiedliche Sequenzanforderungen zugrunde liegen, sollte eine solche Mutationsanalyse die dringend benötigten Mutationen identifizieren, mit denen dann die physiologische Relevanz einzelner IE2-Funktionen im viralen Hintergrund in vivo analysiert werden könnte.


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12.10.2006