5 Zusammenfassung

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Das Immediate Early Protein 2 (IE2) des humanen Zytomegalievirus (HCMV) ist ein essentieller Regulationsfaktor innerhalb des viralen Infektionszyklus. Es aktiviert verschiedene frühe Promotoren und reguliert seine eigene Expression über Bindung an den MIE Promotor. Darüber hinaus aktiviert es zellzyklusstimulatorische Signalwege, führt aber letztendlich zu einem Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang.

Aufgrund seiner zentralen Bedeutung für die virale Replikation und der zahlreichen Funktionen, die es erfüllt, ist eine genaue Kenntnis der regulatorischen Proteindomänen innerhalb des IE2 Proteins unabdingbar, um einzelne Funktionen gezielt manipulieren und ihre physiologische Bedeutung analysieren zu können.

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In der vorliegenden Doktorarbeit wurde deshalb eine Struktur-Funktionsanalyse des IE2 Proteins durchgeführt. Ziel der Analyse war es, eine strukturelle Systematik für die unterschiedlichen IE2-Funktionen zu erstellen. So sollten funktionelle Domänen des IE2 Proteins definiert und untersucht werden, inwieweit diese Domänen überlappen oder strukturell unabhängig sind. Da auch die DNA-Bindungsfähigkeit des Proteins in diese Studien einbezogen werden sollte, musste zunächst ein adäquater Bindungsassay etabliert werden.

Im Rahmen dieser Analysen wurde der Einfluss verschiedener Mutationen in IE2 auf den Zellzyklus transfizierter HCMV-permissiver U373-Zellen untersucht. Zusätzlich wurde die Transaktivierungsfähigkeit sowie ihre Autorepressorfunktion in Reportergenassays bestimmt. Zur Analyse der DNA-Bindungsfähigkeit des Proteins wurde eine DNA-Bindungsassay etabliert, der es erstmals ermöglicht, die Bindung des IE2 Protein mit Hilfe von Extrakten transfizierter und auch HCMV-infizierter Zellen direkt zu analysieren.

Die Untersuchungen haben ergeben, dass innerhalb einer Kerndomäne („Core“) im C-Terminus des Proteins (AS 450–544) die regulatorischen Domänen der oben aufgeführten Funktionen überlappen. Selbst kleinere Mutationen des Core führen zu einem drastischen Funktionsverlust aller untersuchten Aktivitäten. Da selbst unterschiedliche Mutationen den gleichen Effekt hatten, ist zu vermuten, dass das IE2 Protein innerhalb des Core eine komplexe Struktur besitzt, deren Integrität für die Funktionsfähigkeit von IE2 absolut notwendig ist. Die äußersten C-terminalen Aminosäuren hingegen scheinen nur für die Transaktivierung benötigt zu werden, was sich damit deckt, dass sie als Teil einer unabhängigen Transaktivierungsdomäne identifiziert worden sind. Die Fähigkeit von IE2 zur Induktion eines Zellzyklusarrests ist nicht nur unabhängig von der Transaktivierungsfähigkeit des Proteins sondern auch von seiner DNA-Bindungsfähigkeit.

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N-terminal der Kerndomäne kann eine Domäne mit ganz anderen Charakteristika deutlich abgegrenzt werden, die „Modulatordomäne“. Zwar ist sie ebenso notwendig für die Funktionsfähigkeit des Proteins wie das Core, d.h. weder das Core noch die Modulatordomäne können unabhängig voneinander funktionieren, doch scheinen in diesem Bereich die funktionellen Domänen nicht mehr vollständig zu überlappen. Vielmehr lassen sich einzelne Domänen identifizieren, die nur für bestimme Funktionen erforderlich sind. Die Modulatordomäne erstreckt sich von Aminosäure 290 bis 450, wobei die N-terminale Grenze der Domäne bisher nicht hinreichend evaluiert worden ist. Ein Großteil der Mutanten innerhalb der Modulatordomäne zeigte Wildtypaktivität. Nur zwei dieser Deletionsmutanten wiesen eine eingeschränkte Funktionsfähigkeit auf. Während del330 nur residual transaktivieren und in vitro DNA binden konnte, zeigte del260 Funktionsverluste bezüglich Zellzyklusarrestinduktion und Transaktivierung. Die Modulatordomäne ist insgesamt somit deutlich weniger sensibel gegenüber Mutationen, was darauf hindeuten könnte, dass hier auch die Struktur des Proteins weniger komplex ist. Auffallend war zudem, dass keine der analysierten Mutationen zum Verlust bestimmter Funktionen von IE2 geführt hat.

Eine weitere interne Deletionsmutante del430-459 zeigte, dass eine im bisherigen Verständnis zentrale Region mit einer putativen Zinkfingerdomäne für die DNA-Bindung per se nicht benötigt wird.

Es lässt sich schlussfolgern, dass IE2 ein komplexes Core von ca. 100 Aminosäuren besitzt, in dem alle Funktionen von einer komplexen, überlappenden Struktur abhängig sind. Jede Mutation führt hier zum kompletten Funktionsverlust von IE2. Im Gegensatz dazu hat die N-terminal angrenzende Domäne eher modulierenden Charakter und es konnte keine Mutation identifiziert werden, die eine Funktion von IE2 komplett ausschaltete. Für die weiterführende Analyse der unterschiedlichen Funktionen von IE2 ist deshalb eine hochauflösende systematische Mutationsanalyse des Core angezeigt. So sollte es gelingen, diskriminierende Mutanten von IE2 zu definieren, die dann im Viruskontext auf die physiologische Bedeutung definierter IE2-Funktionen getestet werden können.


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12.10.2006