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1.  Einleitung und Fragestellung

1.1. Perfusionsmodell

1997 wurden in Deutschland 10.704 Schweine im Rahmen von Tierversuchen getötet. Insgesamt wurden in diesem Jahr in Deutschland 1.495.741 Tiere zu Versuchszwecken verwendet [1]. Die ethische Rechtfertigung von physiologischen Experimenten an Tieren (Vivisektion) ist in unserer Gesellschaft höchst umstritten. In den Medien finden immer wieder heftige Diskussionen über ihren Nutzen statt [2]. Unumstrittenermaßen ist eine zahlenmäßige Einschränkung von Vivisektionen, ohne gleichzeitig auch Einschränkungen bei den Forschungsergebnissen in Kauf nehmen zu müssen, ein erstrebenswertes Ziel, wie es bereits im Jahre 1959 Russel und Burch in ihrem Prinzip der „drei r“ postulierten. Hiermit gemeint sind die drei Wörter „replace“, „reduce“ und „refine“ [3].

Tierversuche durch Alternativmethoden zu ersetzen und die Zahl der Tiere und der Versuche zu reduzieren sind aus diesem Grund Ziele der Forschungsförderung. Die Entwicklung solcher Ersatz- und Ergänzungsmethoden ist in Europa sogar per Richtlinie vorgeschrieben [4]. Der Tierschutz wurde am 17. Mai 2002 im Deutschen Bundestag mehrheitlich durch die Ergänzung des Artikels 20a des Grundgesetzes (Schutz der natürlichen Lebensgrundlagen) um den Ausdruck „und die Tiere“ in die Verfassung aufgenommen.

Der Haushalt des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) war im Jahr 1999 um rund 904 Mio. Mark von 14,097 Mrd. Mark auf 15,001 Mrd. Mark gestiegen, was die zunehmende Bedeutung dieses Ressorts unterstreicht und die ethische Rechtfertigung bestimmter Forschungsmethoden weiter in den Vordergrund treten läßt [1].

Im Rahmen eines vom BMBF geförderten Projektes der Humboldt-Universität Berlin wurde in unserer Forschungsgruppe eine Methode zur normothermen ex-vivo Vollblutperfusion der Niere als Organ von Schlachthoftieren etabliert. Die Frage war, ob die Methode ein valides Tierversuchsersatz- oder -ergänzungsmodell darstellt und Tierversuche einzusparen hilft.

In dieser Arbeit wird zur Modellvalidierung anhand der konservierten und anschließend isoliert reperfundierten Schweineniere der hämodynamische Funktionszustand während der frühen Phase der Reperfusion charakterisiert.


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Es wurden zu diesem Zweck mit interner und externer Kontrolle Perfusionsexperimente mit den vasoaktiven Substanzen Noradrenalin (NA) und Nitroprussid-Natrium (NN) durchgeführt. Dazu diente ein Versuchsaufbau zur normothermen Hämoperfusion mit autologem Blut.

Es existieren bereits verschiedene Ansätze solcher Perfusionsmodelle. Grundsätzliche Unterschiede in den verschiedenen Arbeitsgruppen bestehen zum ersten in der Art des Tiermodells.

Ratten und Mäuse zum Beispiel sind als Versuchstiere in der heutigen medizinischen Forschung häufig. Bei einer isolierten Organperfusion mit Vollblut als Perfusionsmedium jedoch besteht bei Organen von kleinen Nagetieren ein Problem darin, das Perfusionssystem mit Blut zu füllen, da z.B. die Ratte aufgrund ihrer Größe nur über ein begrenztes Blutvolumen verfügt. Zudem ist jede Art von Manipulation am Organ wie zum Beispiel die Kanülierung durch die geringe Größe der Gefäße erschwert. Das Schwein bietet sich als Organlieferant wegen seiner Eigenschaften bezüglich Anatomie und Genetik an, die den menschlichen in bestimmten Bereichen zudem recht nahe kommen.

Zum zweiten steht die Wahl des Perfusionsmodelles zur Diskussion. In einer Übersichtsarbeit von Schurek [5] mit dem Thema Perfusion der Rattenniere werden 3 Perfusionsarten beschrieben:

Die single-pass Perfusion hat die charakteristische Eigenschaft, den Katabolismus als mögliche Fehlerquelle bei Fragestellungen, die sich mit Metabolismus beschäftigen, auszuschließen. Die Rezirkulationsmethode kann bei biochemischen Fragestellungen angewandt werden, sofern die Akkumulation von bestimmten Metaboliten im Verlauf der Perfusion erwünscht ist. In der Rezirkulationsmethode mit Dialyse, die auch hier angewandt wird, werden die Vorteile beider Perfusionstechniken miteinander verbunden. Außerdem kann hier die Homöostase in bezug auf z.B. Temperatur und Solute, falls gewünscht, auch über einen längeren Zeitraum, leicht gewährleistet werden.

Eine direkte Begasung des Perfusionsmediums stellt den Experimentierenden vor die Schwierigkeit der genauen Titrierung der Perfusionsparameter. In der Rezirkulation mit Dialyse jedoch sind kurzfristige Schwankungen relativ unwahrscheinlich, da gegebenenfalls Änderungen bereits mit Hilfe der „Relaisstation“ Dialysat vorbeugend gepuffert werden. Es besteht aber auch noch die Möglichkeit, direkt die Zusammensetzung und Eigenschaften des Perfusionsmediums zu ändern.


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Im vorliegenden Modell ist außerdem durch eine manuell und getrennt regelbare Pumpenleistung das an eine langsame Widerstandssenkung angepaßte druckkontrollierte Anfahren der Perfusion möglich, was gerade in ihrer ersten Phase protektiv auf alle beteiligten Nierenanteile wirkt [6]. Ein zu hoher Druck würde das Endothel schädigen [7]. Ein zu niedriger Druck hätte eine Hypoxie zur Folge.

Ein weiterer zu erörternder Punkt ist die Wahl des geeigneten Perfusionsmediums, hier reicht das Spektrum von gekühlter isotonischer Kochsalzlösung über Ringerlösung [8, 9] bis zum normothermen Vollblut [10, 11, 12, 13].

Insgesamt bieten Modelle mit Blut den Vorteil der relativen Nähe zu normalen im Körper ablaufenden Vorgängen, ein Nachteil ist die auch in Verbindung mit extrakorporalen Schlauchsystemen wie z.B. im Rahmen von Operationen mit der Herzlungenmaschine auftretende Komplementaktivierung durch die fremden Oberflächen, die letztendlich zu endothelialen Läsionen führt [14].

Versuchsanordnungen mit zellfreien Lösungen haben den Vorteil, daß unbegrenzt Perfusionsmedium zur Verfügung steht. Nachteile sind allerdings, daß sich das jeweilige Modell weiter von in-vivo-Bedingungen entfernt und daß aufgrund des Fehlens korpuskulärer Sauerstoffträger die Sauerstoffkapazität des Mediums schneller erschöpft ist [15]. Blutverdünnung [16, 17] oder verschiedene medikamentöse Zusätze zum Perfusionsmedium, wie zum Beispiel Verapamil, werden in der Praxis als Modifikationen angewandt. Verapamil kommt auch in unserem Modell zum Einsatz [10].

Im Normalfall folgt auf den Kalziumeinstrom in glatte Muskelzellen eine Bindung von Kalmodulin an Kalzium, woraufhin die Myosin-Leichte-Ketten-Kinase (MLCK) aktiviert werden kann, die wiederum durch Phosphorylierung der leichten Ketten die Myosin-ATPase aktiviert. Myosinphosphatase (MLCP) dephosphoryliert die leichten Ketten wieder [18]. Verapamil blockiert die spannungsabhängigen Kalziumkanäle der glatten Gefäßmuskulatur und somit den zur Konstriktion der Widerstandsgefäße notwendigen Kalziumeinstrom in die Zellen. Die vorteilhafte Wirkung von Verapamil unter Ischämie ist bei Shapiro und Malis [19, 20] beschrieben. Ihr liegt eine Verminderung des tubulären Sauerstoffverbrauchs durch eingeschränkte Natriumresorptionsaktivität zugrunde, außerdem die vasodilatative Eigenschaft des Verapamil und drittens ein direkter Effekt auf Nierenzellen, der nicht durch Vasodilatation vermittelt wird.


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So wurde bei Brezis [8] Verapamil mit Erfolg dazu verwendet, den kalziumabhängigen Reperfusionsschaden vor allem an den medullären dicken aufsteigenden Schenkeln der Henle-Schleife zu vermindern.

In der Literatur finden sich auch noch weitere Perfusionsmodelle [21, 22], in denen die konzentrationsabhängige widerstandssenkende Eigenschaft des Verapamil beschrieben wird und eine die Apoptosemechanismen einschränkende Wirkung von Kalziumkanalblockern postuliert wird [23, 24]. Standardmaßnahme ist eine Antikoagulation mit Heparin, sowohl in der Konservierung [25] als auch in der eigentlichen Perfusion [10, 11, 26, 27].

1.2. Pharmakologische Experimente

Die Wahl der Substanzen zur Modellvalidierung fiel aufgrund der folgenden Überlegungen auf Noradrenalin (NA) und Nitroprussid-Natrium (NN):

Vor dem Hintergrund der hämodynamischen Charakterisierung unseres Modelles erschien es besonders interessant, gerade hämodynamisch wirksame Pharmaka zu untersuchen. Dazu ist auch die isolierte Betrachtung des Organs durch die isolierte Perfusion wichtig. Dabei sind alle Nebeneffekte des Restorganismus systematisch ausgeschaltet.

Die beiden verwendeten Pharmaka gehören zu einer Gruppe von Medikamenten, die häufig in der Intensivmedizin Anwendung finden. Sie sind als Substanzen mit unter Umständen positivem Einfluß auf die Gesamtkreislaufsituation allgemein anerkannt. Dieser Sachverhalt ist auch in umfassendem Maße erforscht.

NN (Struktur siehe Abb. 1) ist ein potenter Vasodilatator, mit Indikationen bei Bluthochdruckkrisen, maligner und therapieresistenter Hypertonie, hypertonen Formen des Myokardinfarktes und zur intraoperativ kontrolliert herbeigeführten Hypotension [28].

Die Wirkung des Stoffes basiert auf der Freisetzung von Stickstoffmonoxidmolekülen (NO), die als Transmittersubstanz auf glatte Muskulatur relaxierend und somit auf die Gefäße dilatierend wirken. Robinson stellt in einer Untersuchung an Unterarmgefäßen fest, daß die Wirkung von NN auf Venolen ca. 10-fach höher ist als jene auf Arteriolen [29].

Zudem wird von einem stimulierenden Effekt von NO auf die Natriumkanäle der kortikalen Sammelrohre ausgegangen, der wiederum Folge einer erhöhten Leitfähigkeit der basolateralen Membran für Kaliumionen ist. [30]


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Die Versuche von Bastron [12] sind am ehesten mit unseren zu vergleichen. Der Hauptunterschied liegt aber darin, daß bei Bastron kein geschlossener Kreislauf vorliegt. In seiner Versuchsanordnung verbleibt die Niere im Hundesitus und das venöse Blut fließt in den Blutkreislauf eines zweiten Hundes zurück. Er vergleicht die Nierenfunktionsparameter der quasi isoliert und nicht isoliert perfundierten Niere miteinander. Er kommt zu dem Schluß, daß der selektive Effekt des NN auf die Niere im Vergleich zur systemischen Wirkung verschwindend gering ist.

Radermacher hat ebenfalls die Wirkung von NO beleuchtet, das aus NN freigesetzt wird und seine pharmakologische Wirkung ausmacht [22]. Bei Leighton wird der Effekt von NN auf die Niere bei systemischer Gabe beschrieben [31]. Hier wird durch seine Gabe eine systemische Hypotension erreicht. Der renale Blutfluß bleibt unterdessen konstant.


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Abb. 1: Chemische Struktur von Nitroprussid-Natrium

NA (Struktur siehe Abb. 2) ist ein stark vasokonstriktorisch wirksamer Neurotransmitter der Synapsen des zweiten sympathischen Neurons. Es wird therapeutisch bei verschiedenen Schockformen, Vergiftungen und Infektionen zur Aufrechterhaltung der Durchblutung lebenswichtiger Organe, nicht zuletzt auch der Nieren, angewandt. Als Wirkmechanismus liegt die Konstriktion der peripheren Widerstandsgefäße des Körpers und somit die Bereitstellung einer vergrößerten Blutmenge in den lebenswichtigen Organen zugrunde.

Unter bestimmten Fragestellungen wird NA auch in der experimentellen Forschung verwendet, um durch Mangeldurchblutung das akute Nierenversagen zu induzieren [32, 33] bzw. den renalen Blutfluß zu reduzieren [34, 35, 36].

In seiner Wirkung hat NA eine im Vergleich zu Adrenalin 20 bis 50-fach höhere Affinität zu Adrenorezeptoren, hierbei steht die α-, speziell die α1-mimetische Wirkung stark im Vordergrund. In vivo steigen nach NA-Gabe sowohl der systolische als auch der diastolische Blutdruck und der periphere Widerstand an [37, 38].

Von einigen Arbeitsgruppen sind bereits Versuche mit den beiden Substanzen an isolierten Nieren durchgeführt worden, so daß eine gewisse Vergleichbarkeit und die Möglichkeit einer Einordnung unserer Versuche besteht. Lieberthal zum Beispiel kommt zu dem Schluß, daß die durch Ischämie bedingte renale vaskuläre Widerstandserhöhung durch die postischämisch mangelnde Funktion von endothelium derived relaxing factor (EDRF) vermittelt wird. NN als endothelunabhängiger Vasodilatator kann aber dieser Widerstandserhöhung [Seite 12↓]entgegenwirken [39]. Den Aspekt, daß NN als NO-Donator einen dosisabhängigen senkenden Einfluß auf den Perfusionswiderstand hat, bringt Radermacher ins Spiel [22]. Linas geht davon aus, daß NN in der isolierten Nierenpräparation dem negativen Effekt von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der Pathogenese des Nierenversagens entgegenwirken kann [40].

Abb. 2: Chemische Struktur von Noradrenalin

1.3. Fragestellung

Anhand der Charakterisierung der Hämodynamik und Funktion der im Schlachthof gewonnenen, kältekonservierten und normotherm vollblutreperfundierten Schweineniere sollte festgestellt werden, inwieweit ihr Konservierungs- und Funktionszustand von normalen Bedingungen abweichen. Außerdem sollte das Modell in den Kontext anderer Modelle, die zum Teil auch pathologische Funktionszustände der Niere beschreiben, eingeordnet werden.

Unter diesen Voraussetzungen sollte beleuchtet werden, inwieweit pharmakologische Forschung am Modell aussagekräftig ist.


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22.09.2004