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2.  Methoden

2.1. Organ- und Perfusatgewinnung

Zwischen 80 und 120 kg (101 ± 16 kg; MW ± SD) schwere Schweine der Deutschen Landrasse (n=21) wurden entsprechend dem am Schlachthof der Eberswalder Fleischwaren in Britz (Brandenburg) üblichen Prozedere geschlachtet: Nach Elektroschockbetäubung wurden die Tiere an den Hinterläufen aufgehängt (geschäkelt) und per Gurgelschnitt entblutet.

Das Blut als Hauptbestandteil des späteren Perfusionsmediums wurde dabei in einer Metallschüssel aufgefangen, dann mit wäßriger Natriumcitratlösung (3,2 %, 15 ml/l Blut) und mit Heparin (10.000 IE/l Blut, Liquemin, Roche Pharma) versetzt und später atraumatisch in je einen Liter Blut fassende Transportgefäße umgefüllt. Später wurde es in klinikübliche Blutkonservenbeutel zu 500 ml umgefüllt.

Den Schweinen wurde im weiteren Verlauf der Schlachtung für eine Dauer von 1-2 Minuten in einer Brühvorrichtung aus schlachttechnischen Gründen oberflächlich heißes Wasser appliziert. Es erfolgte nun, den Schlachtkörper wiederum aufgeschäkelt, der Bauchschnitt, und die intraperitonealen Organe wurden entfernt, so daß das Peritoneum zur Nierenentnahme freilag. Nach dem Durchtrennen der beiden Ureteren mit einer Schere wurde das die Nieren bedeckende Peritoneum geschlitzt. Aorta abdominalis und Vena cava inferior wurden in Nierenhöhe jeweils kaudal des Abganges der Nierengefäße durchtrennt und komplett von den angrenzenden Strukturen bis über die Arteria und Vena renalis hinaus nach kranial abpräpariert. (Abb. 3)

Ein weiterer Schnitt durch Aorta und Vena cava erfolgte nunmehr kranial der Abgänge der Nierengefäße. Beide durch das kurze Aorten- und Hohlvenenstück noch miteinander verbundenen Nieren wurden entnommen, linke und rechte Niere am Aortenstück voneinander getrennt und einzeln gewogen (Nativgewicht).

Danach erfolgte die arterielle Kanülierung der Nieren: Eine flexible Kunststoffkanüle wurde mit OP-üblichem Seidenfaden in die Arteria renalis eingebunden, woraufhin 20 ml der gekühlten, mit Heparin versetzten Konservierungslösung zur Vorspülung manuell behutsam in die kanülierte Arteria renalis injiziert wurden. Dann wurden den beiden Nieren aus einer Höhe von 150 cm jeweils 500 ml der auf ca. +4°C gekühlten und mit 5 mg Verapamilhydrochlorid versetzten Konservierungslösung nach von Baeyer [16] (Tab. 4, Anhang) infundiert. Die Organe befanden sich während dieses [Seite 14↓]Vorganges in einem bei +4°C gelagerten Kunststoffbeutel, so daß sie anschließend im eigenen venösen Eluat schwammen. Die Vene wurde durch Einbinden mit einem großlumigen Trachealtubus kanüliert, der Ureter mit einer großlumigen Absaugkanüle (Abb. 4).

Abb. 3: Organgewinnung: Schonende Präparation des doppelten Nierenpaketes.


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Abb. 4: Zur Perfusion komplett kanülierte Niere

2.2. Versuchsablauf

3 Liter Dialysatflüssigkeit [16] (siehe Tab. 4, Anhang) wurden in den Dialysatbehälter gefüllt und mit Sauerstoff und Kohlendioxid begast.

Das Schlauchsystem wurde mit 500 ml heparinisierter isotonischer Kochsalzlösung gefüllt. Das Dialysat konnte sich inzwischen bei jeweils aktivierter Pumpenmechanik und Wärmevorrichtung auf die spätere Betriebstemperatur einpegeln. Es wurde ein Dialysatfluß von ca. 2 l/min gewählt. Dieser wurde bis zum Ende der Perfusion nicht mehr verändert.


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Um das Perfusat zu erwärmen, auf einen Hämatokrit von ca. 0,3 l/l einzustellen und andere Parameter (pH, pO2, pCO2­) auf normale Werte zu kalibrieren, wurde der Perfusatkreislauf luftblasenfrei mit Perfusat gefüllt. Der Hämatokrit wurde in regelmäßigen Abständen durch Zentrifugation von Blutproben ermittelt.

Anschließend wurde die komplett kanülierte Niere angeschlossen (Abb. 4):

Die Pumpen wurden kurzzeitig abgestellt und zwei Schlauchklemmen so gesetzt, daß der bisher kurzgeschlossene Kreislauf zwischen Luftfalle und Perfusatreservoir (siehe schematische Abb. 5) geöffnet und die Niere mit der kanülierten Arteria renalis in Blutflußrichtung hinter der arteriellen Abnahme- und Meßstelle angeschlossen werden konnte. Zu diesem Zeitpunkt war noch kein Anschluß der kanülierten Nierenvene vorgenommen worden.

Die Niere wurde jetzt wieder erwärmt. Dazu wurde sie mit derselben Konservierungslösung wie schon bei der Organgewinnung 5 Minuten lang bei 38°C unter der jeweiligen Flußrate gespült, die einen online gemessenen arteriellen Perfusionsdruck von 80 mmHg zur Folge hatte.

Zusätzlich wurde das Organ in ein mit 38°C temperiertes Bad aus isotonischer Kochsalzlösung verlegt. Der Urin, soweit schon produziert, wurde gesammelt. Ab sofort wurde seine Menge mit dazugehöriger Sammelzeit dokumentiert.

Nun begann die eigentliche Perfusion bei einem arteriellen Blutfluß von zunächst 20 ml/min. Dieser Wert konnte über die Förderleistung der den arteriellen Schenkel der Perfusionsapparatur versorgenden Rollerpumpe reguliert werden. Die ersten 50 ml der venös austretenden Flüssigkeit wurden bei noch nicht geschlossenem Kreislauf verworfen, bevor dann der venös in die Niere eingebundene Katheter an den dem Reservoir zuführenden Schenkel der Apparatur angeschlossen wurde (Abb. 5).

Der Perfusionsdruck wurde mit Hilfe der Regulation des Flusses über die Rollerpumpenförderleistung während der gesamten Perfusion auf einem Niveau von 80 mmHg konstant gehalten [18]. Eine Viertelstunde nach Perfusionsbeginn erfolgte die erste Entnahme von arteriellem und venösem Blut und Urin und deren Analyse.

Von da an folgten weitere Messungen in viertelstündlichen Abständen. Die drei ersten Meßpunkte nach 45-minütiger Perfusion wurden als Phase der in hämodynamischer Hinsicht unveränderten Perfusionsbedingungen behandelt und definiert [16].


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Abb. 5: Perfusionsapparatur für die normotherme isolierte Vollblutperfusion zuvor kältekonservierter Schweinenieren

Im weiteren Verlauf folgte je nach Gruppe die kontinuierliche Infusion des jeweiligen Pharmakons oder weitere Perfusion ohne Interaktion:

21 Nieren wurden nach der Anwärmphase für 45 Minuten mit unveränderten Perfusionsbedingungen in gleicher Weise perfundiert (s.o.). Anhand der daran anschließenden Vorgehensweise wurden die Nieren in drei Gruppen eingeteilt:

Gruppe 1: „Referenz“ ohne pharmakologische Intervention: unverändertes Perfusionsschema nach 45 Minuten idem zur Phase der hämodynamisch nicht veränderten Perfusionsparameter.

Für die Berechnung der folgenden Dosierungen wurde ein Schweinedurchschnittsgewicht von 100 kg veranschlagt.

Gruppe 2: „Nitroprussid-Natrium“ mit Dauerinfusion von NN nach 45 Minuten über einen Zeitraum von 45 Minuten. Das Medikament wurde stets dunkel abgedeckt, um einen Photodegradationseffekt zu verhindern. Die Startdosierung betrug jeweils 1,6 µg/min/kg Körpergewicht (KG). Daraufhin wurde je nach Reaktion der Niere eine Art Funktionstitration durchgeführt: Bei fehlender Reaktion des Perfusionsdruckes auf die Dauerinfusion wurde die Dosis in einem Schritt auf das Doppelte erhöht.


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Gruppe 3: „Noradrenalin“ mit Dauerinfusion von NA nach 45 Minuten über einen Zeitraum von 45 Minuten. Die Startdosierung betrug 0,03 µg/min/kg KG und wurde wie beim NN bei fehlender Reaktion des Perfusionsdruckes auf die Dauerinfusion in einem Schritt auf das Doppelte erhöht.

Nach einer Perfusionszeit von jeweils insgesamt 145 Minuten wurde die Perfusion eingestellt und sofort die Probenentnahme für die pathologisch-histologische Untersuchung durchgeführt (s.u.).

2.3. Messungen

Alle 21 Nieren wurden nach der Anwärmphase für 45 Minuten mit unveränderten Perfusionsbedingungen in gleicher Weise perfundiert. Während dieses Zeitraumes wurden die hämodynamischen Funktionsparameter auf der Grundlage von viertelstündlichen Messungen bestimmt. Es wurden dazu der arterielle und venöse Perfusionsdruck registriert, die jeweils online mit Hilfe invasiver Meßtechnik registriert wurden, desweiteren die Förderleistung der Rollerpumpen stellvertretend für den renalen Blutfluß, der Hämoglobinwert (Hb) über ein BGA-Gerät und schließlich der Hämatokrit durch Blutzentrifugation in Zentrifugenglaskapillaren.

Die Perfusionsdrücke wurden linear skaliert gegen die jeweiligen Perfusionsflüsse in Diagrammen aufgetragen (vaskuläre Compliance). Jeweils in der Nichtinterventionsperiode und in der pharmakologischen Interventionsperiode wurde dazu der Perfusionsfluß in Schritten von 20 ml/min konsekutiv mit Adaptationspausen von jeweils 15 Sekunden erhöht. Die Veränderung des arteriellen Perfusionsdruckes wurde dabei registriert. Die Obergrenze für den Perfusionsfluß wurde so gewählt, daß der arterielle Druck einen Wert von 160 mmHg nie überschritt. Daraufhin wurde der Perfusionsfluß gleichermaßen in Schritten von 20 ml/min, ausgehend vom Grundperfusionsfluß von ca. 80 mmHg, reduziert und wieder der Perfusionsdruck registriert, hierbei wurde als Untergrenze für den Perfusionsdruck ein Wert von 40 mmHg festgelegt.

Zur Beschreibung der glomerulären und tubulären Nierenfunktion wurden in 15-minütigen Abständen die in Tabelle 1 aufgeführten Parameter gemessen bzw. aus den gemessenen Werten berechnet.

Im folgenden nicht beschriebene Laboruntersuchungen wurden von den Mitarbeitern des Zentrallabors der Charité, Campus Virchow-Klinikum durchgeführt.

Vor und nach der Perfusion wurden die Nieren netto, d.h. ohne Kanülierung gewogen.

Tab. 1: Gemessene und berechnete Parameter der Nierenfunktion. Alle Werte werden nachträglich umgerechnet auf 100g Nierengewicht (NG).

Die zu den Phasensammelpunkten (ein Phasensammelpunkt auf 3 Meßpunkte, d.h. per 45 Minuten) gewonnenen Sammelurine wurden einer klinisch-chemischen Untersuchung mit Bestimmung der Proteinkonzentration sowie einer SDS-Gelelektrophorese unterzogen.

2.4. Statistik

Zur Errechnung der statistischen Signifikanz für den Vergleich der Werte im dem Perfusionsphasen wurde der Wilcoxon-Test herangezogen. Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) wurden in den Abbildungen durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet.

2.5. Labormethoden

Zur Messung des Hämatokrits wurde mit dem vorsichtig aufgeschüttelten Blut eine Glaskapillare gefüllt, diese mit einem Stopfen einseitig verschlossen und bis zur vollständigen Trennung der korpuskulären von den nichtkorpuskulären Blutbestandteilen zentrifugiert. Der Hämatokrit wurde als volumenmäßig anteiliges Verhältnis von korpuskulären zu nichtkorpuskulären Blutbestandteilen in [l/l] ausgedrückt und in regelmäßigen Abständen gemessen, um einen Hämatokrit von 0,3 l/l einzuhalten.

Zur Kreatininbestimmung wurde Plasma durch 10-minütige Zentrifugation bei 3000 U/min von jeweils 2 ml Vollblut und Abpipettieren des zellfreien Überstandes [Seite 20↓]gewonnen. Der Sammelurin wurde ebenfalls durch Zentrifugation vom Urinsediment getrennt. Die Meßmethode basiert auf der photometrischen Jaffé-Reaktion unter Anwendung kinetischer Meßtechnik. Die Bildung des roten Farbkomplexes aus äquimolar Kreatinin und Pikrinsäure wird durch den Extinktionsanstieg bei 520 nm verfolgt. Der zur Kreatininkonzentration proportionale Wert dE/dt wird bei 25,6 Sekunden nach Reaktionsbeginn ermittelt, da die Reaktionsgeschwindigkeit im Bereich von Konzentrationen von 0,2 mg/dl bis 25 mg/dl linear proportional zur Kreatininkonzentration ist. Die Präzision dieser Meßmethode liegt bei 3% oder 0,15 mg/dl, je nachdem welcher Wert höher ist. (Auszug aus der Bedienungsanleitung Beckmann Kreatinin-Analysator 2) War durch Messung abzusehen, daß die Probe eine höhere Konzentration als 25 mg/dl aufwies, wurde diese mit Aqua dest. entsprechend verdünnt gemessen und der Meßwert anschließend mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert.

Zur Durchführung der Urin-Geleektrophorese wurde das SDS-Phast-Gelelektrophorese-System von Pharmacia, Uppsala, Schweden mit homogenen Acrylamidgelen der Dichte 12,5% (Pharmacia) und zur Färbung Coomassie Blue R Staining (Pharmacia) verwendet. Die Gesamtproteinkonzentrationen der zu den Meßzeitpunkten gewonnenen und zwischendurch bei -80°C tiefgefrorenen Urine wurde vom Zentrallabor der Charité, Campus Virchow-Klinikum bestimmt. Die Urine wurden durch Verdünnung mit Aqua dest. bzw. durch Konzentrierung (Centricon) auf Konzentrationswerte von annäherungsweise 5000 mg/l gebracht, um in der Färbung eine gute Sichtbarkeit der einzelnen Proteinbanden zu gewährleisten.

Als Standardmarker der Proteingrößen wurden hochmolekulare (HMW) und niedrigmolekulare (LMW) Proteinstandardmarker der Firma Pierce verwendet.

Anschließend wurden die Gele nach Anleitung mit Comassie-Blue-Staining gefärbt und fixiert und photographiert.

2.6. Histologie

Zur histologischen Untersuchung der Nieren wurden im direkten Anschluß an die Wägung der Niere nach Ende der Perfusion und Dekanülierung von jeder Niere mehrere Gewebescheiben unter Miterfassung von Rinde, Mark und Nierenbecken über Nacht in 5% iger gepufferter wäßriger Formaldehydlösung über Nacht fixiert.

Nach Einbettung des formalinfixierten Gewebes in Paraffin wurden ca. 5µm dicke Schnitte angefertigt, die alle standardmäßig mit Hämalaun-Eosin (H-E) und mit Hilfe [Seite 21↓]der Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS) (Färbungen modifiziert nach Romeis [41]) gefärbt wurden.

Für die H-E-Übersichtsfärbung wurden die Schnitte in absteigender Xylolreihe (Merck) entparaffinisiert und in Aqua dest. gewaschen. Darauf folgte die ca. 5-minütige Kernfärbung in Mayerscher Hämalaunlösung (Merck).

Nach Spülen in Aqua dest. wurde 10 Minuten lang unter fließendem Wasser gebläut. Es folgte ca. 10-minütiges Färben in Eosin (Chroma), Spülen in Wasser (5-10 min) und Differenzieren in 80%igem Äthanol (Merck). Nach zwei Mal 2-minütigem Waschen in 96%igem Äthanol und 3- bis 5-minütigem Waschen in Xylol wurden die Schnitte eingedeckt. Die PAS-Färbung dient der Darstellung neutraler Mukopolysaccharide, Polysaccharide, Muko- und Glykoproteine, Glykolipide, ungesättigter Fette und Phospholipide. Eine exakte Unterscheidung dieser Substanzen wird dadurch möglich, daß Glykogen durch Diastase gelöst wird, saure Mukopolysaccharide eine metachromatische Farbreaktion mit Thiazinfarbstoffen geben und Lipide sich im Paraffinschnitt als extrahierte Stellen darstellen. Es wurde wie oben entparaffinisiert und in Aqua dest. gespült. Danach wurde 5 Minuten lang in 0,5%iger wäßriger Perjodsäurelösung (HJO5) eingestellt (Merck). Nach der Spülung in Aqua dest. wurde 15 Minuten lang in Schiffschem Reagenz (Merck) eingestellt. Nach 3 Mal 2-minütigem Spülen in Sulfitwasser, 10-minütigem Spülen in Leitungswasser wurde abschließend in 96%igem Äthanol gewaschen und eingedeckt.

Alle Präparate wurden vor der Begutachtung, die von zwei unabhängigen Untersuchern durchgeführt wurde, geblindet und nach erfolgter Auswertung wieder den ursprünglichen statistischen Gruppen zugeordnet. Die Mikroskopie erfolgte in vierzigfacher Vergrößerung. Dabei wurde zunächst die Nierenrinde aufgesucht und dann bei 50 orthogonal angeschnittenen Tubuli pro Präparat der Prozentsatz der vom Parameter betroffenen Epithelzellen abgeschätzt: Ein Prozentsatz von bis zu 33% ergab einen Punkt, ein Anteil merkmaltragender Zellen von zwischen 33% und 66% entsprach zwei Punkten und drei Punkte wurden bei zwischen 66% und 100% betroffener Zellen vergeben. Dann wurde pro Parameter und Präparat ein Durchschnittswert der 50 beurteilten Tubuli gebildet.

Die Beurteilung erfaßte die folgenden Parameter (Tab. 2):


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Tab. 2: IRI-Score, bewertete einfließende Parameter

Parameter

Score

Färbung

Bedeutung

Schwellung des proximalen Tubulusepithels

1 – 3 Punkte

H-E

Versagen der Natriumpumpe

Verlust des Bürstensaumes der proximalen Tubulusepithelzellen

1 – 3 Punkte

PAS

Frühes Zeichen der hypoxischen Schädigung

Dilatation des proximalen Tubulus

1 – 3 Punkte

H-E

Zeichen des akuten polyurischen Nierenversagens

Vakuolisierung der proximalen Tubulusepithelzellen

1 – 3 Punkte

PAS

Folge eines anaeroben Metabolismus

Nekrosen der proximalen Tubulusepithelzellen

1 – 3 Punkte

H-E

Zeichen des irreversiblen hypoxischen Schadens

Die Punkte flossen in Addition in einen Score ein, der auf einer Skala von 5-15 Punkten ein Ranking und eine quantitative Beurteilung des Ischämie-Reperfusionsschadens zuließ.

Zur Veranschaulichung wurde aus den drei Gruppen je eine Niere zufällig ausgewählt, ein Dünnschnitt mit H-E Färbung in 200-facher Vergrößerung photographiert und mit einem Graphikprogramm am Computer nachbearbeitet, um die dargestellten Veränderungen zu demonstrieren.


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22.09.2004