2.  THEORETISCHER TEIL

In diesem Abschnitt soll zunächst auf Alkoholismusmarker eingegangen werden, die bereits in der Diagnostik zur Anwendung kommen. In den folgenden Kapiteln wird ein kurzer Überblick über mögliche Marker im Haar unter besonderer Berücksichtigung von Ethylglucuronid und Fettsäureethylestern gegeben.

Die Hauptwege des Alkoholabbaus, die Dehydrierung bzw. Oxidation zu Acetaldehyd mit Hilfe der Alkoholdehydrogenase (ADH), des mikrosomalen Ethanol oxidierenden Systems (MEOS) oder der Katalase, die weitere Umwandlung mit Hilfe der Aldehyddehydrogenase (ALDH) zum Acetat und dessen Abbau im Rahmen des Citratzyklus sind seit vielen Jahren gut bekannt und in jeder Hinsicht gründlich untersucht [10]. Daneben gibt es aber einige nichtoxidative Seitenwege des Alkoholstoffwechsels, die zwar für den Gesamtumsatz unwesentlich sind, die jedoch aus diagnostischer und teilweise auch toxikologischer Sicht von erheblichem Interesse sein können. Neben diesen Alkoholmetaboliten kommen als potentielle Alkoholmarker aber auch alle messbaren physiologischen Parameter in Betracht, die im Zusammenhang mit exzessivem Alkoholkonsum typische Veränderungen zeigen.

Labormarker für missbräuchlichen Alkoholkonsum können in folgende Kategorien eingeteilt werden [1,11,12]:

State-Marker: Zustandsmarker; biochemische Indikatoren, die bei exzessivem Alkoholkonsum charakteristische Werte annehmen

z. B. CDT, GGT und andere Leberenzymaktivitäten, MCV, Ethanol (BAK)

Trait-Marker: Vererbbare Indikatoren für die Disposition zur Alkoholabhängigkeit

z. B. Aktivitäten von Adenylatcyclase oder Monoaminoxidase in Blutplättchen

Kurzzeitmarker: Bereits wenige Tage nach Abstinenzbeginn negativ

z. B. Ethanol (BAK), Methanol, Acetat; Ethylglucuronid, Fettsäur e ethylester, Verhältnis 5-OH-Tryptophol (5-HTOL) / 5-OH-Indolyles sigsäure (5-HIAA) im Blut

Langzeitmarker: Mehrere Wochen oder Monate nach Abstinenzbeginn noch positiv

z. B. CDT, GGT und andere Leberenzymaktivitäten, MCV

Direkte Marker: Enthalten die Kohlenstoffatome des Ethanols

z. B. Ethanol, Ethylglucuronid, Fettsäureethylester, Phosphatid y l ethanol, Acetaldehyd-Hämoglobin-Addukte

Indirekte Marker: Basieren auf pathologischen Veränderungen des Metabolismus und der Biochemie bei exzessivem Alkoholkonsum

z. B. CDT, GGT, MCV, Verhältnis 5-HTOL/5-HIAA

Welcher Marker aus welcher Kategorie in der Praxis gewählt wird, hängt naturgemäß von der zugrunde liegenden Fragestellung ab. Für forensische Fragestellungen gilt das Interesse meist nur den State-Markern. Soll z. B. eine Beeinflussung durch Alkohol im Straßenverkehr oder zum Zeitpunkt einer Straftat nachgewiesen werden, so wird in der Regel die Bestimmung der Blutalkoholkonzentration (BAK) herangezogen. Langzeitmarker sind dagegen von Interesse, wenn beispielsweise zur Klärung der Fahreignung auf chronisch exzessiven Alkoholkonsum geprüft werden soll. Generell sind direkte Marker den indirekten vorzuziehen, da sie nicht denselben Einschränkungen bezüglich mangelnder Spezifität durch falsch positive Befunde unterliegen.

Bei den Untersuchungen muss stets die Verhältnismäßigkeit bezüglich entstehender Untersuchungskosten gewahrt bleiben, ohne dass die Aussagesicherheit zu gering werden darf.

Hier soll nur auf die wichtigsten klinisch-chemischen Parameter, die momentan bei der Diagnose des chronischen Alkoholmissbrauchs Verwendung finden, eingegangen werden. Es handelt sich hierbei um indirekte Langzeitmarker.

Das Transferrin ist ein Glykoprotein des Plasmas (M ≈ 80.000), das in der Leber synthetisiert wird und für Bindung und Transport von Eisen durch die Zellmembran verantwortlich ist. An bis zu acht Stellen im Molekül kann das Transferrin Sialinsäurereste tragen, deren Anlagerung durch die Glykosyltransferase katalysiert wird. Bei übermäßigem Alkoholgenuss kann es zu einer Hemmung dieses Enzyms und/oder einer Verringerung der Anzahl an Bindungsstellen kommen, in deren Folge der Sialinsäuregehalt des Transferrins reduziert wird. Dabei wird als „kohlenhydratverarmtes“ Transferrin (CDT) derjenige

Anteil der Isoformen, die weniger als drei Sialinsäurereste tragen, betrachtet. Die Konzentrationsangabe erfolgt in U/l, gleichbedeutend mit der Konzentration an Asialo-, Monosialo- und Disialotransferrin in mg/l, in % CDT bezogen auf das Gesamttransferrin oder seltener in % Disialotransferrin bezogen auf Tetrasialotransferrin. Bei Heranziehen eines Schwellenwerts von 18-20 U/l für Männer und 26-28 U/l für Frauen wird bei einer Spezifität von 90-100 % eine Sensitivität von 80 % für Alkoholiker (im Risikobereich 60 %) erreicht. Die Halbwertszeit beträgt ca. 14 Tage [1,13].

Generell können erhöhte Leberenzymaktivitäten Ausdruck einer Leberzellschädigung sein. Wird die Membran der Leberzellen durch entzündliche Prozesse für größere Moleküle durchlässig, so führt das zu einem Anstieg aller Leberenzymaktivitäten im Blut. Dabei kann nicht ohne weiteres erkannt werden, welche Ursachen dieser Leberzellschädigung zugrunde liegen. Außer einer Schädigung des Gewebes durch chronischen Alkoholmissbrauch kommen hier auch Hepatitisinfektionen oder andere Lebererkrankungen infrage. Im Zusammenhang mit chronisch exzessivem Alkoholkonsum tritt jedoch häufig eine isolierte Erhöhung des GGT-Wertes auf, der als Folge einer Enzyminduktion in der Leber zu deuten ist und dann eine Spezifität von ungefähr 80 % bei einer Sensitivität von 30-90 % aufweist. Die Halbwertszeit beträgt bei gesunder Leber ca. 26 Tage [1].

Nach chronischem Alkoholmissbrauch ist mit einer Sensitivität von 25-95 % eine Erhöhung des MCV über 98 fl festzustellen [1]. Diese Makrozytose wird durch eine alkoholtoxische Knochenmarkschädigung, möglicherweise in Verbindung mit einem durch übermäßigen Alkoholkonsum bedingten Folsäuremangel, hervorgerufen. Aufgrund der Halbwertszeit der Erythrozyten von ca. 100 Tagen dauert es mehrere Monate, bis sich die Werte nach Abstinenzbeginn wieder normalisiert haben. Die Spezifität dieses Markers ist verglichen mit GGT und CDT deutlich geringer, da auch eine Vielzahl anderer Erkrankungen oder z. B. übermäßiges Rauchen zu einer Erhöhung des MCV führen können.

Aus den bisherigen umfangreichen Erfahrungen mit der Haaranalyse lassen sich folgende allgemeine Anforderungen an einen durch Haaranalyse erfassbaren Alkoholismusmarker stellen:

Es muss sich entweder um hinreichend stabile, die Ethylgruppe des Ethanols tragende Metaboliten von Stoffen handeln, die im gesunden menschlichen Stoffwechsel in analytisch messbaren Konzentrationen ständig präsent sind (direkte Ethanol-Marker), oder um eindeutige Produkte des durch starken Alkoholkonsum pathologisch veränderten Stoffwechsels (indirekte Marker). Bei gelegentlichem Alkoholkonsum sollte im Vergleich zum Alkoholabusus bei den direkten Ethanolmarkern der Einbau der ethanolischen Ethylgruppe in die endogene Ausgangssubstanz nur in relativ geringem Umfang oder gar nicht stattfinden. Die indirekten Marker sollten eine hohe Spezifität aufweisen, d. h. die pathologischen Veränderungen des Stoffwechsels sollten nach Möglichkeit nicht auch von anderen Krankheiten hervorgerufen werden können.

Ein geeigneter Marker muss in ausreichender Konzentration durch den Blutkreislauf zur kapillar durchbluteten Haarpapille transportiert werden und sich dort in die wachsende Haarstruktur einlagern. Dabei zeigte sich in bisher durchgeführten Arbeiten, dass auf diesem Wege neben organischen Basen wie den meisten illegalen Drogen auch lipophile, membrangängige Substanzen kleiner Molekülgröße effektiv eingebaut werden können [14,15]. Auch die Einlagerung von Substanzen, die in Schweiß oder Sebum vorhanden sind und nach Abschluss des Haarbildungsprozesses in die Haarmatrix eindiffundieren und dort gespeichert werden, ist möglich.

Im Rahmen einer Haaranalyse müssen diese Substanzen durch Anwendung eines geeigneten Extraktionsverfahrens unzersetzt aus dem Haar extrahiert werden und mittels analytischer Messmethoden qualitativ und quantitativ eindeutig bestimmt werden können.

Unter Berücksichtigung dieser Voraussetzungen kommen grundsätzlich sowohl freies als auch durch alkalische Hydrolyse freigesetztes Ethanol [9], Phosphatidylethanol [16-20], Cocaethylen [21-24], durch Acetaldehyd modifizierte Haarproteine [25-30], Tetrahydroisochinoline und β-Carboline [31] oder auch indirekte Alkoholmarker wie das Verhältnis 5-HTOL/5-HIAA [32-35], Dolichol [36-38] oder die Kupferionen-Konzentration [39], insbesondere aber Ethylglucuronid und Fettsäureethylester infrage. Ein ausführlicher Überblick über diese potentiellen Alkoholmarker im Haar wird von Pragst et al. gegeben [9], der aktuelle Stand der Forschung wird in einem Buchbeitrag ausführlich beschrieben [40]. Im Folgenden soll daher nur auf Ethylglucuronid und Fettsäureethylester als Alkoholmarker eingegangen werden, die das größte Potential im Hinblick auf einen erfolgreichen Einsatz als Alkoholmarker im Haar besitzen.

Diesem Nebenmetaboliten des Ethanols wird zurzeit neben den Fettsäureethylestern die größte Bedeutung als Alkoholmarker im Haar zugemessen. Einige Daten und die Struktur des Moleküls sind in Abb. 1 dargestellt.

Die Bildung dieses extrem hydrophilen und schwerflüchtigen Phase II-Metaboliten des Ethanols durch Reaktion von Ethanol mit aktivierter Glucuronsäure macht ca. 0,5 % der gesamten Ethanolelimination aus. EtG wurde 1952 von Kamil et al. als Triacetylmethylester aus Kaninchenharn isoliert [41], 1967 bzw. 1973 wurde es in menschlichem Urin nachgewiesen [42,43]. Von Schmitt et al. wurde 1995 erstmals eine GC-MS-Methode zur quantitativen Bestimmung im Blut und Urin vorgestellt [44]. Auch eine LC-MS-Methode wurde beschrieben [45], zudem wurde ein Immunoassay, der auf EtG anspricht, entwickelt [46]. In der Literatur wurden EtG-Werte zwischen 0,1 und 20 µg/ml im Serum [47] und 1 bis 1240 µg/ml im Urin gemessen [44,48,49]. Die terminale Halbwertszeit der Elimination wurde zu 2-3 h bestimmt [47], eine spätere Arbeit ergab eine exponentielle Eliminationskonstante von 3,0 ± 1,45 h^-1 [50].

	Abb. 1: Struktur und pharmakokinetische Eigenschaften von Ethylglucuronid.

EtG ist als Kurzzeit-Marker im Blut oder Urin für Alkoholkonsum aus zwei Gründen von Bedeutung: Erstens kann mit seiner Hilfe der Verdacht einer Kontamination von Blutproben mit Ethanol bei oder nach der Entnahme überprüft werden [51]. Liegt eine Kontamination vor, so ist kein EtG nachweisbar. Zweitens kann das Zeitfenster zum Nachweis einer alkoholischen Beeinflussung auf bis zu 80 Stunden verlängert werden. Unter Verwendung eines kinetischen Modells und Durchführung entsprechender Berechnungen kann aus gemessenen EtG-Konzentrationen eine Überprüfung von Trinkangaben stattfinden [50].

Im Jahre 1993 wurde der Nachweis von EtG im Haar erstmals beschrieben [52]. Untersuchungen zur Bestimmung von EtG und erste Vergleiche der Ergebnisse mit dem Trinkverhalten der Probanden wurden zwischen 1995 und 2004 von verschiedenen Autoren durchgeführt [5-8,53-56].

In den ersten Arbeiten [5,52,53] wurden EtG-Haarkonzentrationen angegeben, die sich nachträglich als zu hoch erwiesen. Nachdem inzwischen methodische Verbesserungen eingeführt wurden, besteht aber ein relativ klarer Eindruck über die Haarkonzentrationen von EtG und ihren Zusammenhang mit dem Trinkverhalten. Am Beispiel der von Janda et al. untersuchten 97 Proben (Abb. 2) soll das kurz verdeutlicht werden [8].

	Abb. 2: EtG-Konzentrationen im Haar nach Janda et al., aus [40].

Alle Proben von Abstinenzlern (A) und Normaltrinkern (N) bis ca. 30 g Ethanol/Tag lieferten bei einer Nachweisgrenze um 0,03 ng/mg negative Ergebnisse. Der einzige Normaltrinker, bei dem EtG im Haar nachgewiesen werden konnte, machte möglicherweise zu niedrige Trinkangaben. Für die Gruppe der Patienten in der Entzugsbehandlung fällt die Analyse zu etwa der Hälfte negativ aus, bei der Hälfte mit positivem EtG-Nachweis bleiben die Werte unter 1 ng/mg. Bei den Todesfällen mit bekanntem Alkoholabusus wurden die höchsten Konzentrationen gefunden, allerdings fiel die Messung in 5 von 27 untersuchten Fällen negativ aus. Daraus folgt, dass ein positiver Nachweis von EtG im Haar mit relativ hoher Sicherheit einen chronisch exzessiven Alkoholkonsum beweist, während ein negatives Ergebnis diesen nicht sicher ausschließt.

Der Einlagerungsmechanismus von EtG ins Haar wurde bisher nicht näher untersucht. Da EtG eine hydrophile Carbonsäure ist, die bei physiologischem pH in dissoziierter Form vorliegt, kann man davon ausgehen, dass die Tendenz zur Einlagerung in den Basalzellen der Haarwurzel eher gering ist. Als alternativer Einlagerungsweg kommt die Diffusion des EtG aus dem Schweiß in das Haar in Betracht. Als Folge wäre eine zeitaufgelöste Interpretation der Analysenergebnisse bei segmentweiser Untersuchung einer Haarprobe nicht möglich. Ein Vorteil von EtG, das fast ausschließlich in der Leber gebildet wird, liegt in der fehlenden Möglichkeit eines durch äußere Kontamination bedingten falsch positiven Ergebnisses.

Insgesamt ist die Haaranalyse auf EtG als sinnvolle Hilfe bei der retrospektiven Aufklärung des Alkoholkonsums einzuschätzen, die bei einer weiteren Senkung der Nachweisgrenze durch methodische Verbesserungen noch an Wert gewinnen kann.

Auf diese direkten Alkoholmarker, die im Jahre 2000 erstmals im Haar nachgewiesen wurden [9], soll hier ausführlich eingegangen werden.

Die enzymatische Bildung von FSEE nach Alkoholkonsum wurde von Lange et al. 1981 erstmals beschrieben [57] und später von verschiedenen Forschungsgruppen an Zellhomogenisaten, im Tierversuch oder auch am Menschen ausführlich untersucht. Der jeweilige Stand der Erkenntnisse zu den FSEE wurde seit ihrem erstmaligen Nachweis in zahlreichen Reviews und Mitteilungen zusammengefasst [58-68].

Tabelle 1: Literaturangaben über Bildung, Elimination und Konzentrationen von Fettsäureethylestern in menschlichen Körperflüssigkeiten und Geweben sowie pathogene Wirkungen von Fettsäureethylestern. Zitate siehe auch im Text.

* Analysiert wurden in den meisten Fällen: Ethyllaurat, Ethylmyristat, Ethylpalmitat, Ethylpalmitoleat, Ethylstearat, Ethyloleat, Ethyllinoleat und Ethylarachidonat.

Sie entstehen in Anwesenheit von Ethanol aus freien Fettsäuren, Triglyceriden, Lipoproteinen oder Phospholipiden sowohl unter der Wirkung spezifischer zytosolischer oder mikrosomaler FSEE-Synthasen als auch vermittels unspezifischer Enzyme wie der Carboxylesterase, der Lipoproteinlipase, der Carboxylesterlipase oder der Cholesterolesterase im Blut und in nahezu allen menschlichen Geweben. Die Bildungswege und der Zerfall sind in Abb. 3 dargestellt. In Tabelle 1 sind einige Eigenschaften dieser Verbindungen zusammengefasst. Im Folgenden soll ein kurzer Literaturüberblick über die wesentlichen Erkenntnisse zu dieser Substanzgruppe gegeben werden.

	Abb. 3: Bildungs- und Zerfallswege von Fettsäureethylestern. FS = Fettsäure, FS-CoA = Coenzym A-aktivierte Fettsäure, FSEE = Fettsäureethylester.

Physikalische und chemische Eigenschaften der FSEE

Es handelt sich bei den in dieser Arbeit untersuchten Fettsäureethylestern bei Raumtemperatur mit Ausnahme des unter Normalbedingungen als weißer, wachsartiger Festkörper vorliegenden Ethylstearats um farblose Flüssigkeiten mit leicht süßlichem, wachsartigem Geruch. Die Siedepunkte dieser Substanzen liegen bei reduziertem Druck zwischen 179°C (Ethylmyristat bei 12 Torr) und 214°C (Ethylstearat bei 15 Torr). Die Schmelzpunkte liegen zwischen -32°C (Ethyloleat) und 34°C (Ethylstearat). Die Dichte liegt im Bereich zwischen 0,86 und 0,87 g/cm³ [79].

FSEE sind sehr lipophile Verbindungen, deren Reaktivität in erster Linie von der Esterfunktion im Molekül geprägt ist. Neben der Hydrolyse können hier vor allem Umesterungsreaktionen stattfinden. In gelöstem Zustand stehen die FSEE im Gleichgewicht mit der entsprechenden Fettsäure und Ethanol, wobei die Gleichgewichtseinstellung im Körper enzymatisch katalysiert abläuft (s. unten). Sind weitere Verbindungen mit Alkoholfunktion vorhanden, überlagern die Gleichgewichte der entsprechenden Umesterungsreaktionen.

Enzymatische Bildung, interzellulärer Transport, Verteilung und Spaltung von FSEE

Lange nahm zunächst an, dass die Veresterung von Ethanol durch eine Cholesterolesterase bewirkt wird [80]. Die von Coenzym A unabhängige Synthese von FSEE aus Ethanol und Fettsäuren in Kaninchenmyocard-Homogenisaten wurde 1984 von Mogelson, Lange et al. festgestellt [81]. Sie konnten die entsprechende FSEE-Synthase isolieren und bis zur Homogenität reinigen [82]. In späteren Untersuchungen wurde die Molmasse des Enzyms mit 55 kDa bestimmt und festgestellt, dass das gereinigte, homogene Enzym am stärksten den Umsatz von ungesättigten C₁₈-Fettsäuren katalysiert [83]. Aus der gleichen Gruppe wurde 1987 der Nachweis der Veresterung von Oleat mit Ethanol in Leukozyten [84] und in 10 verschiedenen Positionen des menschlichen Gehirns [85] erbracht, wobei die graue Hirnmasse höhere Enzymaktivität zeigte als die weiße.

Ein Satellitenenzym mit FSEE-Synthaseaktivität wurde ebenfalls von diesem Arbeitskreis als eine Glutathion-S-Transferase identifiziert [86]. Die Bildung von FSEE in Leber und Hirn von Mäusen, die 6 Tage Alkoholdämpfe eingeatmet hatten, wurde von Hungund et al. 1988 nachgewiesen [87]. Diese Autoren zeigten mit Hilfe von Fluoreszenzanisotropie, dass durch diese Verbindungen eine Störung der Membranordnung hervorgerufen wird. Spätere Versuche von Isenberg et al. an Neuroblastom- und Glioma-Zelllinien ergaben, dass die FSEE-Synthaseaktivität im Hirn bevorzugt in Zellen mit neuronalen Eigenschaften lokalisiert ist [88].

Die Bildung von Ethylpalmitat, Ethyloleat und Ethylstearat nach Alkoholgabe im Lungengewebe von Ratten wurde 1991 von Manautou und Carlson gemessen und ist niedriger als in der Leber und im Pankreas [89]. Durch Bora et al. wurde 1992 neben den bekannten FSEE-Synthasen I und III eine FSEE-Synthase II mit einer Molmasse von 65 kDa aus menschlichem Myocard isoliert und gereinigt, die im Gegensatz zu den beiden anderen keine Glutathion-Synthaseaktivität besitzt [90]. Diese ist besonders aktiv für Palmitat, Stearat, Oleat und Linolat. Versuche mit diesem Enzym und verschiedenen Alkoholen ergaben in der Reihenfolge von Methanol bis n-Butanol Michaelis-Menten Konstanten K_M von 1,16, 1,04, 0,58 und 0,33 M und V_max-Werte von 180, 100, 280 und 410 nmol/mg/h. Drei Synthasen für die Bildung von FSEE wurden durch Bora und Lange in der grauen Hirnsubstanz nachgewiesen und bis zur Homogenität gereinigt [91]. Durch cDNA-Klonen wurde festgestellt, dass zwei dieser Enzyme GSH-S-Transferasen sind. Dies wurde als Ausgangspunkt für genetische Studien über alkoholbedingte ZNS-Schädigungen betrachtet. Der Zusammenhang zwischen FSEE-III-Synthase- und GSH-Transferaseaktivität konnte jedoch durch Board et al. nicht bestätigt werden [92]. Ein homogenes Enzym mit FSEE-Synthaseaktivität und Carboxylesteraseaktivität sowie einer Molmasse von 62 kDa wurde ebenfalls von Bora et al. aus menschlichem Myocard isoliert und bis zur Homogenität gereinigt [93].

Tsujita und Okuda gewannen eine Lipoproteinlipase mit FSEE-Synthaseaktivität und einer Molmasse von 57 kDa aus Rattenplasma [94]. Dieses bildet mit den Fettsäureresten eine Zwischenstufe, von welcher der Acylrest auf Ethanol übertragen wird. Die gleichen Autoren isolierten 1994 eine Carboxylesterlipase der Molmasse 74 kDa aus Schweinepankreas [95]. Die Acyl-Transferaseaktivität über die Zwischenstufe des acylierten Enzyms gegenüber Ethanol war etwa 35-30-mal höher als gegenüber Wasser. Treloar et al. berichteten über eine membrangebundene Acyl-CoA:Ethanol-Acyl-Transferaseaktivität in menschlichen Lebermikrosomen [96].

Hepatische mikrosomale FSEE-Synthasen wurden durch Kaphalia und Ansari mittels isoelektrischer Fokussierung und anschließender Gelfiltrations-Hochleistungs-Flüssigchromatographie isoliert und charakterisiert [97,98]. Dabei handelt es sich um verschiedene Isoenzyme der hepatischen mikrosomalen Carboxylesterase mit Molmassen um 60 kDa. Aufgrund unterschiedlicher Hemmung mit Tri-o-tolylphosphat konnten die Autoren in einer späteren Arbeit zeigen, dass in Leber, Plasma und Pankreas von Ratten unterschiedliche Enzyme wirksam sind [99].

Dan und Laposata fanden sowohl in einem Todesfall als auch bei der Inkubation von Hep-G2-Zellen mit Ethanol, dass Ethylpalmitat und Ethyloleat die bevorzugt gebildeten FSEE sind [71]. Es konnte keine bevorzugte Aufnahme- oder Enzymaffinität bei verschiedenen Fettsäuren festgestellt werden, jedoch war die Bildung von Ethylpalmitat eigenartigerweise unabhängig von der extrazellulären Palmitatkonzentration. Weitere Messungen zum Gesamtumsatz an Hep-G2-Zellen und zur unterschiedlichen Reaktivität der Fettsäuren wurden mit ¹⁴C-markierten Fettsäuren durchgeführt [100]. Dabei zeigte sich, dass frisch inkorporierte Säuren schneller reagieren als bereits länger in der Zelle vorhandene. In einer anderen Studie mit Hep-G2-Zellkulturen wurde gezeigt, dass sowohl mikrosomale als auch zytosolische FSEE-Synthasen wirksam sind, dass sowohl freie Fettsäuren als auch etwas bevorzugt Acyl-CoA umgesetzt werden und dass als intrazelluläre Substrate vor allem Glycerollipide und andere Ester fungieren [101]. Als Carrier für die Ausschleusung aus der Zelle dienen Lipoproteine und Albumin.

Bei Applikation in den Magen-Darmtrakt von Ratten wurde festgestellt, dass FSEE im Magen bereits teilweise und in der Höhe des Zwölffingerdarms sehr schnell hydrolysiert werden [102]. Dies erklärt die scheinbare Ungiftigkeit bei Verwendung in der Lebensmittelindustrie.

Die FSEE-Synthase setzt freie Fettsäuren um, während für die Umwandlung von Acyl-Coenzym A eine Coenzym-A-Ethanol-O-Acyl-Transferase (AEAT) zuständig ist. Diczfalusy et al. charakterisierten mittels Hemmversuchen die Enzymaktivitäten der AEAT und der FSEE-Synthase an isolierten Lebermikrosomen von Ratten [103]. Sie fanden, dass unter normalen Bedingungen der AEAT-Mechanismus dominant sein sollte. Diczfalusy et al. führten in einer weiteren Arbeit vergleichende Untersuchungen an Homogenisaten von menschlicher Magen- und Darmmucosa, Pankreas, Leber, Herz, Lunge, Fettgewebe, Gallenblasenmucosa und Serum durch [104]. Danach besitzen Leber, Zwölffingerdarmmucosa und Pankreas die höchsten FSEE-Synthaseaktivitäten. Die Esterspaltung verläuft hingegen am stärksten in der Leber und im Pankreas, während sie im Fettgewebe und im Herzen kaum nachweisbar ist. Die Autoren schlussfolgern daher, dass die FSEE überwiegend in der Darmmucosa als Hauptort der Resorption von Fettsäuren und Alkohol erzeugt werden. Sie gelangen von dort über den Blutweg zu den Organen und werden durch Lipoproteinrezeptor-vermittelte Aufnahmemechanismen in die Zellen eingelagert. Die geringe Hydrolyseaktivität im Herzmuskel und im Fett begründet die Akkumulation in diesen Geweben.

Eine Abnahme der FSEE-Synthaseaktivität und der damit gekoppelten GSH-Transferaseaktivität nach Gabe von L-Carnitin wurde in Versuchen mit Ratten von Calabrese und Rizza festgestellt, die diese Aminosäure daher für ein wirksames Mittel im Alkoholismus-Management ansehen [105]. Heith et al. fanden, dass die FSEE-Synthasen auch die Umesterung von Cocain zu Cocaethylen katalysieren [106].

Hamamoto et al. stellten bei der Untersuchung an Wistar-Ratten eine FSEE-Synthaseaktivität in fallender Reihenfolge in Pankreas, Leber, Testes und Herz fest, während Hirn und Skelettmuskulatur keine Aktivität zeigten [107]. Es wurde gefunden, dass die Amylaseaktivität im Pankreas in einer umgekehrten Korrelation zu dem FSEE-Gehalt steht, woraus auf die schädigende Wirkung der FSEE auf das Pankreas geschlossen wurde. Manautou et al. ermittelten an Lungenhomogenisat eine erhebliche FSEE-Bildung, während dort der Ethanol-Metabolismus über ADH sehr gering ist [108]. Tsujita und Okuda erhielten 1992 eineFSEE-Synthase in elektrophoretisch reiner Form aus Fettgewebe von Ratten [109]. Hemmversuche mit monoklonalen Antikörpern zeigten die Anwesenheit dieses Enzyms in Leber, Lunge und Hoden, jedoch nicht in der Niere. Unterschiede in der Zusammensetzung der in der Leber und im Pankreas gebildeten FSEE wurden bei Ratten durch Untersuchung der Sekrete von Laposata et al. festgestellt [110].

Leichte Lipoproteine (LDL) fungieren nach Bird et al. als physiologisches Vehikel für den Transport von FSEE in lebenden Zellen [111]. Bei den Versuchen wurden radioaktiv markierte FSEE verwendet. Die stärkere Bindung an Lipoproteine im Vergleich zu Serumalbumin wurde auch in einer NMR-Studie [112] und bei variablen Zusätzen von FSEE [75] bestätigt. Chang und Borensztajn halten hingegen Albumin für den wesentlichen physiologischen Carrier der FSEE und beschreiben eine einfache praktische Methode für das Auflösen von FSEE in wässrigem Medium durch Bindung an Albumin [113]. Die so gebundenen FSEE wurden leicht durch Alveolar-Makrophagen von Ratten aufgenommen und stellen allgemein einen experimentellen Zugang zur Erforschung der FSEE-Wirkung in Zellen dar. Neuere Untersuchungen von Best et al. ergaben, dass zwischen 5 und 20 % der FSEE des Vollblutes in den Erythrozyten vorliegen, wobei die Zusammensetzung sich von der im Plasma unterscheidet [114]. Die Autoren werten dies als Hinweis auf einen unabhängigen Stoffwechsel von FSEE in Erythrozyten und Plasma. Es wird von einer Inkorporation in Phosphlipid-Doppelschichten ausgegangen, die für die alkoholbedingten Veränderungen in Erythrozyten mitverantwortlich gemacht wird.

Saghir et al. inkubierten an Phospholipide (LDL) gebundene FSEE mit menschlichem Vollblut, Plasma, Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten [115]. Dabei stellten sie fest, dass die Hydrolyse der Ester vor allem in den Blutzellen und nur unwesentlich im Plasma abläuft.

Aleryani et al. schlussfolgerten aus einer Proportionalität von Aspartat-Aminotransferase und FSEE-Synthase im Blut, dass FSEE-Synthasen analog anderen Enzymen bei alkoholbedingter Zellschädigung aus Leber und Pankreas ins Blut gelangen [116]. Gorski et al. überprüften die verschiedenen Blutbestandteile auf ihre Fähigkeit, FSEE zu synthetisieren [117]. Sie stellten eine FSEE-Synthaseaktivität in Vollblut und vor allem in Leukozyten fest. Dabei besaß die Lymphozyten-Monozytenfraktion eine ca. dreifach höhere Aktivität im Vergleich zur Granulozyten-Fraktion. Alkoholiker besaßen dabei nur etwa die Hälfte der Leukozyten-FSEE-Synthaseaktivität im Vergleich zu den Normaltrinkern. Es blieb ungeklärt, ob dies eine Folge des Alkoholmissbrauchs oder genetisch bedingt ist.

Pathologische Wirkungen von FSEE

Die Anwesenheit von FSEE in den verschiedenen Organen wurde in vielen der bereits zitierten Arbeiten mit den für Alkoholmissbrauch bekannten Organschädigungen in Zusammenhang gebracht [118]. Darüber hinausgehende Beweise sind jedoch relativ selten. Lange und Sobel stellten bereits 1983 bei der Inkubation isolierter Myocard-Mitochondrien mit FSEE fest, dass diese eine Hemmung der oxidativen Phosphorylierung und damit die Ineffizienz der Energieproduktion des Herzmuskels bewirken und werteten dies als Ursache für die alkoholbedingte Herzmuskelschädigung [119]. Ein Zusammenhang zwischen der Akkumulation von FSEE in bestimmten Organen, die keinen oxidativen Alkoholmetabolismus aufweisen, und den alkoholbedingten Organschädigungen wurde 1985 von E. A. Laposata und Lange beschrieben [118].

Werner et al. stellten bei Inkubierung von Zellhomogenisaten der Leber und des Pankreas mit Ethanol fest, dass durch Inhibierung des oxidativen Alkoholabbaus der Umsatz zu FSEE auf das doppelte bis dreifache ansteigt [120]. 48-stündige Infusion von FSEE in Ratten führte zu Ödemen des Pankreas, pankreatischer Trypsinogenaktivierung und Vakuolisierung der Acinuszellen [121]. In anderen Versuchen mit Ratten wurde durch die gleichen Autoren gezeigt, dass nach Inhibierung der Oxidationswege des Alkohols mit 4-Methylpyrazol (ADH-Inhibitor), 3-Amino-1,2,4-triazol (Katalase-Inhibitor) und Diallylsulfid (MEOS-Inhibitor) die Pankreasschädigungen signifikant mit der FSEE-Konzentration zunehmen [122]. Pfutzer et al. stellten hingegen in Versuchen mit Wistar-Ratten fest, dass chronischer Ethanol-Konsum die Exprimierung der FSEE-bezogenen Gene in der Leber und im Pankreas induziert, jedoch nicht im Herzmuskel und im Hirn [123]. Diese Enzymaufregulierung wird als ein zentraler Mechanismus für die alkoholbedingte Pankreatitis angesehen.

Haber et al. inkubierten 1993 Lysosomen der Pankreaszellen von Ratten mit Ethyloleat und stellten durch Messung der Aktivitäten von N-Acetylglucosaminidase und Cathepsin B eine Zunahme der Lysosomenfragiltät fest [124]. Diese wurde als Bestätigung der vermittelnden Rolle der FSEE bei den alkoholbedingten Pankreasschäden gewertet. Ein Zusammenhang zwischen FSEE-Konzentrationen und alkoholbedingter Pankreasschädigung geht auch aus Untersuchungen von Kaphalia und Ansari hervor [125].

Toxische Wirkungen von FSEE auf Hep-G2-Zellen wurden von M. Laposata et al. festgestellt [63]. In einer anderen Arbeit wurden eine Abnahme der menschlichen Leberzellproliferation und der Proteinsynthese in Anwesenheit von FSEE nachgewiesen [126]. Hasaba und Laposata zeigten bei Versuchen mit Hep-G2-Zellen, dass die in diesen Zellen synthetisierten FSEE durch Lipoproteine und Albumin ausgeschleust werden, wobei das Lipoprotein gleichzeitig eine Erhöhung der Bildungsrate bewirkt [127].

Gubitosi-Klug und Gross stellten experimentell eine Beschleunigung der Kinetik von bestimmten spannungsabhängigen K⁺-Kanälen im menschlichen Gehirn durch FSEE fest und sahen dies als Ursache für die pathophysiologischen Folgen des Alkohols an [128]. Ein ursächlicher Zusammenhang zwischen fetalem Alkoholsyndrom und FSEE wurde weiterhin von Bearer et al. aus dem Nachweis in der Plazenta von Menschen und Mäusen geschlussfolgert [129].

Analytischer Nachweis und Bestimmung von FSEE

Kinnunen und Lange verwendeten eine quantitative Methode zur Analyse von FSEE aus Gewebsproben, in der Aceton als Extraktionsmittel benutzt wurde [130]. Die Trennung der Lipide durch Dünnschichtchromatographie wurde an Kieselgelplatten vorgenommen, und die individuellen Fettsäureethylester wurden danach mittels GC-MS identifiziert. Eine Zweistufenmethode zur Reinigung von FSEE bestehend aus einer Festphasenextraktion an Aminopropyl-Kieselgelsäulen, gemeinsamer Elution von FSEE und Cholesterylestern mit Hexan und anschließender Abtrennung durch HPLC an einer ODS-Säule mit Isopropanol/Wasser als mobiler Phase wurde von Bernhard et al. entwickelt [131]. Am Beispiel von Ethyloleat ergab sich eine Ausbeute von 70 ± 3 %. Diese Methode wurde von Dan et al. auf die GC-MS übertragen [100] und von Zybko et al. für Blutproben weiter verbessert [132,133]. Mittels GC-MS wurden die Ethylester der Fettsäuren 14:0, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3n-3, 20:3n-6, 20:4, 20:3n-6, 20:5n-3 und 22:6n-3 gemessen.

Als wesentliche präanalytische Bedingungen bei der Bestimmung von FSEE wurden von Soderberg et al. das Geschlecht der Probanden, die Serum- oder Plasma-Triglycerid-Konzentration, Dauer und Temperatur der Probenlagerung, Art der konsumierten alkoholischen Getränke sowie Geschwindigkeit des Konsums überprüft [73]. Danach haben Männer bei auf das Gewicht bezogener gleicher Alkoholdosis etwa doppelt so hohe FSEE-Konzentrationen. Lagerung bei 4°C führte zu keiner Änderung der Konzentrationen, bei Raumtemperatur wurde aber eine deutliche Zunahme gefunden. Der Effekt der verschiedenen zur Blutprobennahme verwendeten Antikoagulantien auf die Ergebnisse der FSEE-Analyse wurde von Salem et al. untersucht [132]. Danach wurden aus Röhrchen mit Heparin und Natriumcitrat etwa gleiche Ergebnisse gefunden wie ohne Zusatz, EDTA führte hingegen zu einer drastischen Abnahme der Werte. Bei den noch alkoholhaltigen Vollblutproben wurde bei 25 und 37°C eine stetige Zunahme der FSEE gemessen, wobei wahrscheinlich ein Gleichgewicht erreicht wird. Die Autoren empfehlen die Abtrennung von Serum oder Plasma innerhalb 4 h und die weitere Lagerung bei -4 bis -80°C sowie die Vermeidung von EDTA-Röhrchen.

Quantitative Angaben zu den Konzentrationen liegen nur in wenigen Arbeiten vor. DePergola et al. ermittelten eine Summenkonzentration von ca. 300 nmol/g der Ethylester von Linolensäure, Oleinsäure, Stearinsäure und Palmitinsäure im Fettgewebe von Ratten, die über 10 bzw. 17 Wochen zwischen 9 und 16 g Ethanol/kg KG/Tag erhalten hatten [133]. Versuche mit ¹⁴C-markiertem Alkohol ergaben eine Halbwertszeit der Ester von weniger als 24 h. Durch Lipase wurden sie langsamer gespalten als Triglyceride. Doyle et al. bestimmten FSEE im Serum von 37 Notfallpatienten und fünf Probanden nach definierter Ethanoldosis [69]. Sie fanden eine Korrelation zwischen den Konzentrationen von Ethanol und FSEE. Im FSEE-Pool war der Anteil gesättigter Fettsäuren höher als im Pool der freien Fettsäuren. Im Serum sind die FSEE an Lipoproteine und Albumin gebunden. FSEE- Konzentrationen bis 42 µmol/l wurden von M. Laposata et al. im Serum gemessen [74]. Der Nachweis im Fettgewebe gelang sowohl nach Applikation von Alkohol als auch von FSEE-Kapseln.

In einer weiteren Arbeit [134] wurde versucht, FSEE in Haarextrakten mittels Flüssiginjektion eines Flüssig/Flüssig-Extraktes bzw. eines zuvor einer Festphasenextraktion unterworfenen Extraktes mit GC-MS nachzuweisen. Dieses Vorgehen führte jedoch aufgrund der extrem hohen Matrixbelastung der so erhaltenen Extrakte nicht zu den erforderlichen Nachweisgrenzen im Bereich von wenigen pg pro mg Haar.

Bisherige Nutzung von FSEE als Alkoholmarker

Die Bedeutung der FSEE als Alkoholmarker wurde in der Literatur, vor allem in den Arbeiten von Laposata und Mitarbeitern, immer wieder betont, systematische Studien sind jedoch selten und Anwendungen in der Praxis beschränken sich auf die Bestimmung in Meconium. Der geringe Zuspruch für diesen direkten Alkoholmarker ist sicher auch durch die bislang sehr aufwändige Analytik begründet.

Bjorntorp et al. bestimmten 1990 die FSEE-Konzentrationen und die FSEE-Synthaseaktivitäten in menschlichem Fettgewebe für Abstinenzler, Normaltrinker, Alkoholiker in Entzugsbehandlung und Alkoholtodesfälle [135]. Die Abstinenzlerproben wiesen keine FSEE-Synthaseaktivität auf, und es wurde ein Anstieg mit dem Grad des Alkoholkonsums festgestellt, was auf eine Ezyminduktion zurückgeführt wurde, die nach Abstinenzbeginn mit einer Halbwertszeit von mehreren Wochen abklingt. Die FSEE-Synthaseaktivität von Fettgewebe wurde daher als potentieller Alkoholmarker vorgeschlagen. Yamazaki et al. bestimmten 1997 die Konzentrationen der Methyl- und Ethylester im Herzmuskel und im Hirngewebe von 47 Todesfällen [76]. Die FSEE-Konzentrationen lagen zwischen 0 und 1778 nmol/g im Herzmuskel bzw. 0 und 767 nmol/g im Hirngewebe.

Eine klinische Studie zur Prüfung, ob FSEE im Blut als Kurzzeit-Marker für Alkoholaufnahme geeignet sind, wurde von Doyle et al. mit 48 Blutproben von 7 Probanden durchgeführt [72]. Der FSEE-Abfall folgte zunächst der Alkohol-Zeit-Kurve, verlief aber in der sekundären Phase viel langsamer, sodass sich für mindestens 24 Stunden nach der Einnahme ein positiver Befund ergab. Die Spitzenwerte lagen zwischen 2.000 und 3.000 nmol/l.

Ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Nachweis von Ethyllinolat im Meconium und den Trinkangaben der Mütter für die Zeit vor und während der Schwangerschaft wurde von Bearer et al. beschrieben [136]. Klein et al. bestimmten im Meconium eines Neugeborenen, dessen Mutter über die gesamte Schwangerschaft Bier getrunken hatte, eine FSEE-Konzentrationssumme von 13,1 µg/g, während bei den Neugeborenen abstinenter Mütter im Mittel 0,41 µg/g gemessen wurden [77,137]. Weiterhin wiesen diese Autoren nach, dass Ethyllinolat auch in isoliertem Meconium nach Versetzen mit Ethanol gebildet werden kann. Die Analyse von FSEE in Meconium als Marker für intrauterine Alkoholbelastung des Fötus wurde auch von Moore et al. in zwei Publikationen beschrieben [78,138]. In einer Studie mit zwei Gruppen von Neugeborenen auf Hawaii (n = 463, 73 positiv) und in Utah (n = 289, 35 positiv) werden Konzentrationen oberhalb 10 µg/g als signifikant für eine Alkoholbelastung während der Schwangerschaft angesehen [78].

Da sich die FSEE in menschlichem Gewebe in einem ständigen enzymatisch katalysierten Gleichgewicht mit Alkohol und Fettsäuren oder Lipiden befinden, sind sie als Langzeitmarker nur verwendbar, wenn sie diesen Gleichgewichten durch Speicherung entzogen werden. Hierfür sind die Haare besonders geeignet.

Das Haar ist aus morphologischer Sicht ein äußeres Hautanhangsgebilde. Es ist im Mittel ca. 70 µm dick [139] und besteht aus der Haarwurzel (Haarfollikel) und dem Haarschaft („reifes“ Haar). Die Haarwurzel ist in der Lederhaut verankert und reicht bis in die Unterhaut hinein. Sie ist von zahlreichen Kapillarblutgefäßen und Nerven umgeben. Zu jedem Haar gehört eine Talgdrüse, von der ein Kanal zum oberen Teil der Haarwurzel hin verläuft. Der Haarbalgmuskel sorgt dafür, dass jedes Haar aufgerichtet werden kann. Die ekkrinen Schweißdrüsen befinden sich zwar in der Nähe der Haarwurzel, sind aber von ihr getrennt. Eine schematische Darstellung eines Haars in seiner natürlichen Umgebung ist in Abb. 4 dargestellt.

Die Haarwurzel besteht aus mehreren konzentrischen Schichten, die in einem histologischen Schnitt sichtbar gemacht werden können (vgl. Abb. 5 rechts). Am unteren Ende weitet sie sich zum Bulbus, in dem die Haarpapille sitzt, die ein Netzwerk aus Kapillarblutgefäßen und Fibroblasten enthält und für die Versorgung des wachsenden Haares mit metabolischem Material sorgt. Die unmittelbar an die Papille grenzende, ihr kappenförmig aufsitzende Zellschicht nennt man Basalmembran. In dieser Zellschicht befinden sich die Matrixzellen der drei Schichten des späteren Haarschaftes (Medulla, Cortex und Cuticula) sowie der inneren und der äußeren Wurzelscheide (s. Abb. 5 links). Diese wiederum bestehen aus weiteren Schichten, die dem austretenden Haar seine Form geben und besondere Funktionen beim Transport von Aminosäuren übernehmen.

In Abb. 6 sind die im wachsenden Haar ablaufenden Prozesse schematisch dargestellt. Die schnelle Zellteilung im unteren Teil des Haarfollikels führt zu einer Wanderung der Zellen in Richtung Hautoberfläche. In der nächsten Zone wird das Gen zur Keratinisierung exprimiert, wobei die weitere Entwicklung der Zellen für Cortex- und Cuticulazellen in unterschiedlicher Weise verläuft. Die Cortexzellen ändern ihre Form von der anfänglich sphärischen in eine spindelartige Form. In den Zellen werden Proteinfilamente aufgebaut, welche die Zelle ausfüllen und schließlich verschmelzen. In der Aushärtungszone werden Disulfidbrücken geknüpft und es finden Resorption und Dehydratation statt, bis schließlich alle zytoplasmatischen Organellen verschwunden sind. Die Überreste der Zellen werden durch membranartige Strukturen (Zellmembrankomplex) miteinander verbunden. Die Cuticulazellen stammen von Matrixzellen aus dem äußeren Bereich der Haarpapille und

	Abb. 4: Schematischer Darstellung der Haarwurzel und der Hautschichten, entnommen aus [140].

	Abb. 5: Schichtartiger Aufbau der Haarwurzel; schematischer Aufbau (links) und histologischer Schnitt unter dem Elektronenmikroskop (rechts). M = Medulla, C = Cortex, Cu = Cuticula, IRS = innere Wurzelscheide, ORS = äußere Wurzelscheide. Entnommen aus [141].

	Abb. 6: Das wachsende Haar in der Anagenphase (aus [142], S. 81).

verändern ihre Form im weiteren Verlauf zu einer amorphes Protein enthaltenden Struktur mit schindelartigem Aufbau. Auf Höhe des Kanals der Talgdrüse wird die innere Wurzelscheide abgebaut und das Sebum umhüllt für zwei bis drei Tage das nunmehr fertige Haar vollständig, bis es an der Hautoberfläche austritt. Das dort erscheinende, voll ausgereifte Haar besteht im Querschnitt von außen nach innen aus Cuticula, Cortex und der Medulla. Weitere Bestandteile des Haars sind der aus Lipiden bestehende Zellmembrankomplex, der vor allem die Zwischenräume der Cortexzellen füllt, und die Melanineinlagerungen, die sich sowohl im Cortex als auch in der Medulla finden.

Cuticula

Diese 4-5 µm dicke und aus 5-10 Zelllagen bestehende Hülle schützt das Haar vor physikalischen und chemischen Beeinflussungen (UV-Strahlung, Feuchtigkeit etc.). Sie besteht aus der stark cysteinhaltigen (25-30 %), proteolysestabilen Exocuticula und der proteolyseempfindlichen Endocuticula [142,143] und besitzt einen schindelartigen Aufbau

Cortex

Der Cortexist aus einem Bündel spindelförmiger, parallel zur Haarachse angeordneter Zellen aufgebaut undenthält Makrofibrillen, die aus mehreren α-helikalen Intermediatfilamenten bestehen. Diese Keratinfasern enthalten große Mengen an Cystein, das über Disulfidbrücken zum Cystin vernetzt ist und den entscheidenden Grund für die mechanische und chemische Stabilität der Haarfaser darstellt. Die hydrophilen Aminosäuren Glutaminsäure (1,0 mmol/g Haar) und Asparaginsäure (0,45 mmol/g) [144] sind nach außen gekehrt und für die hohe Wasser-Aufnahmekapazität der Haare von bis zu 30 % ihres Eigengewichts und für die Kationenaustauscher-Eigenschaften verantwortlich.

Medulla

Die Medulla befindet sich in der Mitte des Haars und wird von den Cortexzellen umschlossen. Sie weist neben Lufteinschlüssen und Melanin einige ungeordnete Proteingranula auf, die über Isopeptidbindungen verknüpft und nicht in gewöhnlichen Proteinsolventien löslich sind [142].

Zellmembrankomplex

Der Zellmembrankomplex ist eine zwischen den Zellen des Keratingewebes existierende Phase laminarer Struktur und setzt sich aus Protein- und Lipidschichten zusammen, die ein Netzwerk um Cortex- und Cuticulazellen formen. Dabei weisen die Lipidschichten anders als bei Zellmembranen keine Phospholipidstruktur auf und beinhalten bis zu 50 % 18-Methyleicosansäure [145].

Melanineinlagerungen

Melanin ist für die Farbe des Haares verantwortlich und wird in den Melanosomen (Zellorganellen der Melanozyten) gebildet. Die Melanozyten sind im Bulbus vorwiegend in der Basalschicht des Cortex oberhalb der Papille lokalisiert. Die langen Dendriten dieser Zellen dringen in benachbarte Keratinozyten ein und entleeren dort Melanosome enthaltende Vesikel. Nach einer phagozytoseartigen Auflösung der Membranen von Vesikeln und Melanosomen bleiben die Pigmente in die Keratinozyten eingebettet zurück. Im ausgereiften Haar sind die Melaningranula sowohl im Cortex als auch in der Medulla zu finden. Zusammensetzung und Konzentration des Melanins im Haar bestimmen die Haarfarbe. Der Melaninanteil des Haars beträgt ca. 0,1-5 Gew.-% [144,146], wobei schwarzes Haar die höchsten Melaninmengen enthält, helleres Haar hingegen weniger und kleinere Melaninpigmente aufweist [147,148].

Das Kopfhaar durchläuft in seiner 2- bis 7-jährigen Entwicklung drei Wachstumsstadien: die durchschnittlich 2- bis 6-jährige Anagenphase, die 2- bis 3-wöchige Katagenphase und die bis zu 6-monatige Telogenphase [144,149,150]. Während der Anagenphase wächst das Haar mit individuell unterschiedlichen und von der Körperregion abhängigen Wachstumsraten. Für menschliches Kopfhaar wurden Raten von 0,2 bis 0,5 mm/Tag gemessen [151]. In der Katagenphase bildet sich die Haarwurzel innerhalb von 2-3 Wochen zurück, die Nährstoffversorgung und damit das Wachstum verlangsamt sich bis hin zum Stillstand. Es schließt sich die Telogenphase an, in der das Haar noch für bis zu 6 weitere Monate in der Kopfhaut verbleibt, bis ein neues Haar gebildet wird, welches das alte herausschiebt. Dieser Prozess ist in Abb. 7 dargestellt. Beim Menschen laufen diese Wachstumszyklen nicht synchronisiert ab, jedes Haar durchläuft einen individuellen Zyklus. Die Dauer der einzelnen Stadien wird von androgenen Hormonen kontrolliert und hängt vom Ort der Behaarung, dem Alter, dem Geschlecht sowie von genetischen Faktoren ab. Der Anteil der Haare in der anagenen Phase liegt bei menschlichem Kopfhaar zwischen 80 und 85 %, in der katagenen Phase befinden sich 1-3 % und in der telogenen 10-15 % der Haare. Während eines krankhaften oder altersbedingten Haarausfalls (Alopecie) kann der anagene Anteil auf unter 30 % sinken [152].

	Abb. 7: Der Haarwachstumszyklus bei menschlichem Kopfhaar, entnommen aus [153].

Sebum wird in den Talgdrüsen, die einen Bestandteil jeder Haarwurzel bilden, nach einem holokrinen Mechanismus gebildet [154,155]. Die an der Basalmembran durch Teilung entstehenden Sebumzellen durchlaufen dabei eine Reifungszone, in der sie Lipide akkumulieren und auf das 100-150fache ihres ursprünglichen Volumens anwachsen. Danach unterliegen sie der Nekrose und Lysis und setzen die Lipide in den Drüsenkanal frei, an dessen Ende sie den Haarschaft erreichen und diesen umhüllen. Der Transport am Haar entlang erfolgt durch Oberflächendiffusion und gegenseitige Berührung der Haare. Die Sebumschicht verhindert, dass das Haar spröde wird und bricht. Sie wird bei der Kopfwäsche regelmäßig entfernt und erneuert sich danach innerhalb von wenigen Tagen.

Sebum wird in etwa gleicher Menge auch in den Talgdrüsen der winzigen Vellushaare auf der „unbehaarten Haut“ produziert und bildet dort den überwiegenden Teil des Oberflächenfettes der Haut, das zusätzlich Lipide der abgeschilferten Hautzellen enthält. Dieses Oberflächenfett der Haut, das sich als dünner Film auch auf der Haaroberfläche findet, besteht im Durchschnitt etwa zu 30 % aus Triglyceriden, zu 27 % aus Wachsen, zu 24 % aus Fettsäuren, zu 12 % aus Squalen, zu 2 % aus Diglyceriden und zu 4 % aus Cholesterin und dessen Estern [156,157]. Die in den Triglyceriden und Wachsen enthaltenen Fettsäuren und Fettalkohole werden in den Zellen selbst synthetisiert und sind in ihrer Zusammensetzung spezifisch für Sebum. Der Fettsäureanteil enthält im Gegensatz zu den üblicherweise physiologisch vorkommenden Fettsäuren auch ungeradzahlige, verzweigte und an ungewöhnlicher Stelle ungesättigte Fettsäuren, setzt sich aber hauptsächlich aus gesättigten und monoungesättigten Fettsäuren mit einem kleinen, variablen Anteil an Monomethylverzweigungen zusammen. Die freien Fettsäuren sowie Mono- und Diglyceride werden durch Lipasen von Bakterien, die in den Haarfollikeln und auf der Hautoberfläche siedeln, aus den Sebumbestandteilen (Fette und Wachse) generiert. Die freien unverzweigten Fettsäuren besitzen hauptsächlich eine geradzahlige Kohlenstoffanzahl. In erster Linie treten dabei Myristinsäure (ca. 8 %), Palmitinsäure (ca. 18 %), Stearinsäure (ca. 5 %) und Ölsäure (ca. 18 %) auf [144], wobei relativ große interindividuelle Unterschiede in der Zusammensetzung gefunden werden.

Die Sebumproduktion wird durch Hormone kontrolliert und hängt von Alter und Geschlecht der Person, von der Tageszeit und zu gewissem Grade auch von der Jahreszeit ab. Die mittlere Zeitspanne zwischen Erzeugung des Sebums und der Ausscheidung beträgt etwa 8 Tage, wobei sich die Dauer des Zellzyklus mit zunehmendem Lebensalter verlängert [155,157].

Für eine zeitliche Bewertung von Befunden bei segmentweiser Untersuchung von Haarproben spielt neben der Wachstumsgeschwindigkeit die Frage nach dem Einlagerungsmechanismus eine entscheidende Rolle, da die Bewertung der Ergebnisse einer abschnittsweisen Haaranalyse hinsichtlich des zeitlichen Ablaufs einer Substanzaufnahme nur sinnvoll ist, wenn die Substanzeinlagerung über den Blutkreislauf in der Haarwurzel stattfindet und somit auf die im Entstehen begriffenen Haarstrukturen begrenzt ist.

1989 stellten Baumgartner et al. als erstes erklärendes Modell ein „Entrapment-Model“ vor [158], wonach über die Blutversorgung eine Einlagerung von Substanzen und deren Metaboliten in so genannte „inaccessible regions“ erfolgt. Würde dieses Modell zutreffen, so wären die eingelagerten Substanzen im Haar vor externen Einflüssen geschützt und eine Kontamination mit Analyten von außen würde nicht zu einer Einlagerung in das Haar führen, könnte also leicht durch eine sorgfältige Probenvorbereitung wie z. B. der Durchführung geeigneter Waschprozeduren beseitigt werden. Da viele Befunde mit diesem einfachen Modell nicht in Einklang zu bringen waren, postulierte Henderson 1993 ein Multikompartimenten-Modell [159], das von einem komplexeren Mechanismus ausgeht, an dem mehrere Kompartimente beteiligt sind. Die Kompartimente Blut, Schweiß, Talg, angrenzende Hautschichten sowie die externe Kontamination sollen im Folgenden kurz besprochen werden.

Einlagerung über die Blutversorgung

Der Einlagerungsweg über das Blutgefäßsystem spielt für viele Drogen und Pharmaka die größte Rolle. Handelt es sich um basische, nicht proteingebundene, undissoziierte und lipophile Stoffe, so können diese entlang von Konzentrations- und pH-Gradienten durch Zellmembranen in das Keratinozytengewebe, in Matrixzellen und Melanozyten der Haarwurzel des anagenen Haares gelangen. Weitere wichtige Faktoren, die den Transport der Substanzen durch Biomembranen beeinflussen, sind der Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient sowie die Größe und Geometrie des Moleküls. Eine besondere Bedeutung für die Einlagerung von Substanzen kommt dabei den Melanozyten zu. Sie weisen im Unterschied zum keratinisierten Haar, das einen intrazellulären pH-Wert von ca. 6 besitzt [144], pH-Werte zwischen 3 und 5 auf [160]. Auch das Zytoplasma der Matrixzellen besitzt einen niedrigeren pH-Wert als das Blutplasma. Dadurch kommt es entsprechend dem pH-Gradienten zu einer bevorzugten Aufnahme und Anreicherung von basischen Substanzen in Melanozyten und Matrixzellen [161], von wo sie dann in die Melaningranula, in die Haarproteine und Haarlipide eingelagert werden.

Einlagerung über Schweiß und Sebum

Gelöste Stoffe können auch über die Ausscheidungen von Schweiß- und Talgdrüsen in das Haar gelangen. Lipophile Moleküle diffundieren dabei entlang des Zellmembrankomplexes, während hydrophile Substanzen während des Quellvorgangs eingeschleust werden. Da die ekkrinen Schweißdrüsen und die Talgdrüsen in der Kopfhaut sehr eng beieinander liegen, kann sich aus Schweiß und Sebum eine Emulsion bilden, die das Haar benetzt. Daher lässt sich allein durch Haaranalyse nicht entscheiden, aus welchem Sekret die Einlagerung einer Substanz ins Haar erfolgte. Allerdings lässt sich voraussagen, dass lipophile Substanzen eher im Sebum, hydrophile dagegen zu einem höheren Anteil im Schweiß wiederzufinden sind.

Bei der Beurteilung von Ergebnissen der Haaranalyse muss berücksichtigt werden, dass geeignete Substanzen bei starker Schweiß-/Sebumsekretion zu einem positiven Nachweis auch an Stellen im Haar führen können, die lange vor der Einnahme gewachsen sind. Dies kann zu zeitlichen Fehlinterpretationen führen [151].

Einlagerung aus angrenzendem Hautgewebe

Vor allem stark lipophile Substanzen können aus dem Blut in tiefere Hautschichten gelangen, dort akkumulieren und zeitlich verzögert unter Verbreiterung der Zone mit positivem Substanznachweis in das Haar eingelagert werden. Auch eine Aufnahme von Substanzen aus externen Quellen in die Haut mit nachfolgender Einlagerung ins Haar ist denkbar [159,162].

Einlagerung aus externen Quellen

Auch eine Kontamination der Haare über den Rauch von Cannabis-, Nikotin- bzw. Crackrauchern [163,164], durch Stäube oder durch kontaminierte Haarkosmetika wurde beobachtet. So wies Mieczkowski Cocain im Waschwasser der Haare von mehreren nicht drogenabhängigen Drogenfahndern nach, die häufig mit Cocain in Berührung kamen [165]. Die Gefahr von falsch positiven Haaranalysen ist aber bei gründlicher Probenvorbehandlung (geeignete Waschschritte vor der Probenextraktion) und differenzierter Beurteilung positiver Haaranalysen als sehr gering einzustufen, da nach äußerer Kontamination in der Regel keine Metaboliten der entsprechenden Ausgangssubstanzen nachgewiesen werden können [158,165,166] und eine kritische Bewertung der quantitativen Ergebnisse unter Berücksichtigung der Konzentrationen in den bei den Waschvorgängen erhaltenen Lösungen erfolgen kann.

Einfluss von kosmetischen Behandlungen und Witterungsbedingungen

Bei gesundem unbehandeltem Haar stellt die Cuticula eine Barriere gegen den Verlust von Substanzen dar. Viele eingelagerte Substanzen sind bei normaler Haarwäsche noch Jahre nach dem Konsum nachweisbar. Allerdings können kosmetische Behandlungen der Haare mit Bleich- oder Färbemitteln und Dauerwellenbehandlung irreversible morphologische, physikalische und chemische Veränderungen des Haars hervorrufen, die zu einem verstärkten Ausdiffundieren oder einer verminderten Aufnahmekapazität führen. Auch Konzentrationsverluste infolge von Instabilität der eingelagerten Moleküle gegenüber in den Kosmetika enthaltenen Chemikalien (z. B. Wasserstoffperoxid oder Ammoniak) können auftreten. Über eine deutliche Konzentrationsabnahme an Morphin, Monoacetylmorphin und Cocain nach Bleichung und Dauerwellenbehandlung von Haaren Drogenabhängiger berichteten Pötsch et al. [167]. Yegles et al. stellten bei Benzodiazepinen einen Verlust von ca. 60 % der eingelagerten Wirkstoffmenge nach Bleichung fest [168]. Kidwell et al. beschrieben die Umwandlung von Cocain zu Benzoylecgonin nach Haarwäsche mit basischem Shampoo [169]. Röhrich et al. stellten eine deutliche Abnahme der Drogenkonzentrationen im Haar nach einmaliger Anwendung eines Szene-Shampoos zur Drogenentfernung fest, wobei alle Drogen dennoch deutlich nachweisbar blieben [170]. Werden Haare starker Sonneneinstrahlung, Regen und Wind ausgesetzt, führt dies zu physikochemischer Alterung. Die bei der UV-Bestrahlung entstehenden Radikale lösen Lipidoxidationen, Veränderungen von Peptiden und einen Abbau von Melanin aus [144]. Skopp et al. beobachteten in Haarproben von Drogenkonsumenten nach dreimonatiger Exposition im Freien eine signifikante Verringerung der Morphin-, Monoacetyl- und Benzoylecgonin-Konzentrationen [171]. Weiterhin stellten sie nach 10 Wochen Sonnenlichtexposition im Vergleich zu im Dunkeln gelagerten Haaren eine Abnahme der THC-Konzentrationen um 50-90 % und der Cannabinol- sowie Cannabidiolgehalte fest [172].

Die Headspace-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) ist eine in verschiedensten Bereichen der chemischen Analytik verwendete Methode der Probenvorbereitung, die sich sehr gut mit der Kapillargaschromatographie in Kombination mit massenspektrometrischer Detektion koppeln lässt. Im Folgenden soll näher auf die Grundlagen dieser Methode eingegangen werden.

Das Prinzip dieses lösungsmittelfreien Extraktionsverfahrens ist in Abb. 8 dargestellt und beruht auf der Verteilung der Analyten zwischen der Probe, die sich als flüssige oder feste Phase in einem verschlossenen Glasgefäß befindet, und dem Extraktionsmedium, das als Beschichtung auf eine Quarzglasfaser von ca. 0,3 mm Durchmesser und 15 mm Länge aufgebracht ist. Während des Extraktionsvorgangs befindet sich die beschichtete Faser im Dampfraum über der Probe. Zum Einstechen und Herausziehen in bzw. aus Probengefäßen oder der Injektionseinheit des Analysengerätes kann die Faser in eine Hohlnadel eingezogen werden, die sie vor Beschädigung und Kontamination schützt. Während der Extraktion bzw. der Desorption wird die Faser aus der Hohlnadel herausgeschoben.

	Abb. 8: Schematischer Ablauf der Headspace-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME).

Es sind Fasern mit unterschiedlichen polymeren Beschichtungsmaterialien kommerziell erhältlich. Man unterscheidet Fasern mit homogener Polymerschicht und solche mit heterogenem Aufbau der Beschichtung. Die Auswahl der Materialien und Dicke der Faserbeschichtung richtet sich nach den physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Substanzen. Für polare Substanzen sind Beschichtungen aus einem Polyacrylatpolymer (PA) oder Carbowax® geeignet. Eher unpolare Substanzen haben eine höhere Affinität zu Beschichtungen aus Polydimethylsiloxan (PDMS). Es sind auch Mischphasen aus Carbowax® bzw. PDMS mit Divinylbenzol- oder Carboxen-Partikeln im Handel, die sich für einige Anwendungen als besonders geeignet erwiesen haben. Die Schichtdicken der Faserbeschichtungen variieren je nach Anwendung zwischen 7 und 100 µm [173], wobei für kleine, flüchtige Analyten bevorzugt dickere Schichten Verwendung finden. Analyten hoher Molekülmasse erfordern dünnere Schichtdicken, um Probleme durch verzögerte Desorption aus der Beschichtung zu vermeiden. In Tabelle 2 sind die zur Zeit erhältlichen Fasertypen mit den jeweils empfohlenen Einsatz- und Temperaturbereichen aufgelistet. Eine durch Abschätzen der Polarität, Flüchtigkeit und Molekülmasse

Tabelle 2: Kommerziell erhältliche SPME-Fasern und deren Anwendungsbereiche.

des Analyten getroffene Vorauswahl sollte stets experimentell überprüft werden, da für viele Substanzen keine eindeutige Zuordnung getroffen werden kann und weitere experimentelle Parameter wie Extraktionstemperatur und Extraktionsdauer Einfluss auf die Extraktionsausbeuten und die Matrixbelastung des SPME-Extraktes haben können.

Findet die Desorption im Injektor eines Gaschromatographen statt, so wird die Faser durch das Inlet-Septum in den Injektoreinsatz aus Quarzglas (Liner) eingeführt, wo der Extrakt bei hoher Temperatur (üblicherweise > 200°C) desorbiert wird.

Die Methode der HS-SPME erfordert keine aufwändige Probenvorbereitung und ermöglicht eine schnelle und reproduzierbare Probenverarbeitung durch Automatisierung (in dieser Arbeit mit Hilfe des in Abb. 9 dargestellten Probengebers MPS2 der Fa. Gerstel). Besonders interessant ist diese Methode für Analyten, die einerseits für statische Headspace-Methoden nicht genügend flüchtig sind, bei denen aber andererseits bei einer Lösungsmittelextraktion aufgrund des Dampfdruckes mit Substanzverlusten zu rechnen ist.

	Abb. 9: Automatischer Probengeber MPS2 der Firma Gerstel. Der vertikale Arm des xyz-Roboters transportiert ein HS-Vial zunächst zur heizbaren Schüttelvorrichtung, in der die Extraktion stattfindet. Danach wird die SPME-Einheit über dem GC-Injektor positioniert, die SPME-Nadel in den Inlet eingestochen und die Faser zur Desorption aus der Führung geschoben.

Die Untersuchung sehr kleiner Probenmengen ist bei Verwendung von HS-SPME mit hoher Empfindlichkeit möglich, da die gesamte extrahierte Analytenmenge der Chromatographie zugeführt wird. Die Faser ist nach der Desorption sofort wieder gebrauchsfähig und hat eine Lebensdauer von bis zu 100 Einzelinjektionen. Da die Faser bei der HS-SPME nicht direkt in den Extrakt eintaucht, kann man die Probenvorbehandlung sehr variationsreich gestalten (z. B. den pH-Wert der Probe über große Bereiche variieren), ohne die Faser zu beschädigen.

Weitere Vorteile sind in der lösungsmittelfreien Arbeitsweise und der idealen Kombinierbarkeit mit GC-MS zu sehen. Nachteile des Verfahrens bestehen darin, dass Substanzen mit extrem niedrigem Dampfdruck und ionische Verbindungen nicht erfasst werden und dass keine vollständige Extraktion stattfindet.

Neben der Headspace-Variante kann die Extraktion mittels der beschichteten Faser auch direkt durch Eintauchen in die Probenlösung (Immersion) erfolgen. Dabei kommt es zu einer Gleichgewichtseinstellung der Konzentrationen in der Lösung und in der Faserbeschichtung. Für beide Varianten erhält man unter den bei der Herleitung der Gleichungen (1), (3) und (4) gemachten Annahmen dieselben Extraktionsausbeuten im Gleichgewichtszustand. Lediglich die Kinetik der Gleichgewichtseinstellung verändert sich. Die im Gleichgewicht von der Faser direkt aus der Lösung extrahierte Stoffmenge kann mit Hilfe von Gleichung (1) berechnet werden [173]. Bei der Herleitung von Gl. (1) wurden folgende Annahmen und Voraussetzungen gemacht:

Die Matrix ist eine homogene Phase.

Die thermische Ausdehnung der Polymere und die Änderung der Diffusionskoeffizienten durch Anwesenheit von Lösungsmittelresten im Polymer werden vernachlässigt.

Es findet weder eine Adsorption an den Gefäßwänden noch ein thermischer oder biologischer Abbau des Analyten statt.

Das Sorbens ist von konstanter Porosität.

Gültigkeit des idealen Gasgesetzes.

Es wird bis zur Einstellung des Gleichgewichts extrahiert.

mit n : Stoffmenge in der Faser

K_fp : Verteilungskoeffizient Faser/Probe

V_f : Volumen der Faser

V_p : Volumen der Probe

c₀ : Anfangskonzentration eines gegebenen Analyten in der Probe

Danach erhält man bei großem Verteilungskoeffizienten K_fp erwartungsgemäß eine hohe Extraktionsausbeute. Die Proportionalität zu c₀ bildet die Grundlage für die Quantifizierung (Linearität der Kalibrationskurve).

Gleichung (1) geht für große Probenvolumina (K_fp∙V_f << V_p) in Gl. (2) über, d. h. die extrahierte Stoffmenge ist direkt proportional der Probenkonzentration, dem Verteilungskoeffizienten K_fp und dem Volumen der Faser. Sie hängt nicht mehr vom Volumen der Probe ab:

Erfolgt die Extraktion über den Dampfraum, so lässt sich Gleichung (3) herleiten [173]:

mit n : von der Faser extrahierte Stoffmenge

K_fh : Verteilungskoeffizient Faser/Headspace

K_hp : Verteilungskoeffizient Headspace/Probe

V_h : Volumen des Headspace

V_f : Volumen der Faser

c₀ : Anfangskonzentration eines gegebenen Analyten in der Probe

V_p : Volumen der Probe

Setzt man in Gl. (3) für K_fh∙K_hp den Verteilungskoeffizienten K_fp ein, was zulässig ist, wenn man den Dampfdruck des Lösungsmittels (meist H₂O) vernachlässigt, so erhält man Gleichung (4):

Die drei Terme im Nenner von Gl. (4) sind jeweils ein Maß für die Analyten-Aufnahmekapazität der entsprechenden Phase. Ist das Headspace-Volumen klein gegen das Probenvolumen (V_h << V_p), so geht Gl. (4) in Gl. (1) über, da auch K_hp für weniger flüchtige Analyten relativ klein ist. Da also Gl. (1) näherungsweise für SPME-Untersuchungen sowohl mit als auch ohne Headspace gilt, kann man für beide Verfahren sehr ähnliche Extraktionsausbeuten erwarten.

Der für die extrahierte Stoffmenge entscheidende Verteilungskoeffizient ist demnach K_fp. Wenn K_fp > 1 ist, was bei Auswahl eines für den Analyten geeigneten Faserbeschichtungsmaterials der Fall sein sollte, so ist der Transport des Analyten in die Faser ein exothermer Prozess. Nach Gl. (5) wird K_fp dann mit steigender Temperatur kleiner, eine Temperaturerhöhung wirkt sich demnach ungünstig auf die Extraktionsausbeute aus.

mit K₀ : Verteilungskoeffizient bei Temperatur T₀

ΔH : molare Enthalpieänderung des Analyten bei Transport von der Probe in die Faser

Generell gilt, dass eine Temperaturerhöhung dazu führt, dass die Konzentration im Dampfraum steigt. Es hängt also im Einzelfall von der Temperaturabhängigkeit der Verteilungskoeffizienten K_hp und K_fh ab, bei welcher Temperatur die Extraktionsausbeute im Gleichgewicht ein Maximum durchläuft.

Die wichtigsten experimentellen Parameter, die bei der HS-SPME optimiert werden können, sind neben der auf S. 29 bereits genannten Faserauswahl die Extraktionstem per a tur und die Extraktionsdauer. Während über die Thermodynamik die Menge des im Gleichgewicht bei einer bestimmten Temperatur unter Verwendung einer bestimmten Faser extrahierten Analyten bestimmt werden kann, ist über kinetische Betrachtungen die Extraktionsausbeute bei einer Extraktionsdauer, die keine vollständige Gleichgewichtseinstellung erlaubt, nur grob abschätzbar. Die Berechnung würde das Lösen der den Stofftransport beschreibenden Differentialgleichungen erfordern, was in Unkenntnis der vielen Randbedingungen praktisch nicht möglich ist.

Ist das Headspace-Volumen nicht vernachlässigbar klein, wie es bei Herleitung von Gleichung (1) aus Gl. (4) angenommen wurde, so führt eine Erhöhung der Temperatur zu einer Änderung der Verteilungskoeffizienten zugunsten des Dampfraums, was mit einer Anreicherung des Analyten in demselben einhergeht und die Extraktionsausbeute zusätzlich zu der Verkleinerung von K_fp mit steigender Temperatur (Gl. (5)) erniedrigen kann, sofern die Konzentrationserhöhung in der Gasphase die Verkleinerung von K_fh nicht überkompensiert. Andererseits muss man Substanzen mit geringerer Flüchtigkeit bei erhöhter Temperatur extrahieren, um in einer möglichst kurzen Extraktionsdauer zu einer Gleichgewichtseinstellung zu gelangen, da eine zu lange Dauer der Extraktion zu einem geringen Probendurchsatz führt und Substanzverluste durch das Einstichloch im Septum beim Rühren auftreten können. Daher muss für jeden Analyten ein praktikabler Kompromiss gefunden werden, der mit Hilfe von Optimierungsexperimenten unter Bestimmung der Extraktionsausbeuten bei verschiedenen Temperaturen ermittelt werden kann.

In der Praxis ist man bei den meisten Anwendungen für Analyten mit geringerer Flüchtigkeit bestrebt, von einer möglichst hohen Temperatur auszugehen, um eine ausreichende Konzentration des Analyten im Dampfraum zu erhalten. Die maximale Extraktionstemperatur wird sowohl durch die Temperaturbeständigkeit der Faser und der Analyten als auch durch den Siedepunkt des Probenmediums begrenzt.

Systeme, die eine kontrollierte Kühlung der Faser erlauben, würden zwar durch die Möglichkeit der Anwendung hoher Extraktionstemperaturen ohne entsprechende Einbußen in der Extraktionsausbeute besonders gute Ergebnisse bei kurzen Extraktionszeiten liefern, sind aber technisch schwer zu realisieren und zur Zeit noch nicht kommerziell erhältlich. Zudem würde unter Faserkühlung die Selektivität der Extraktion geringer werden, da dann auch niedrig siedende Probenbestandteile in höherem Maße an der Faser adsorbiert würden.

Der Zusatz von Neutralsalzen, die im Probenmedium gut löslich sind (in wässrigem Medium z. B. NaCl oder Na₂SO₄), kann die Extraktionsausbeute erhöhen. Im Allgemeinen verstärkt sich dieser Aussalzeffekt mit zunehmender Polarität des Analyten. Er basiert auf der Erhöhung des Dampfdruckes des Analyten infolge einer Verkleinerung der Hydrathülle. Auch hier muss die optimale Salzart und -menge experimentell ermittelt werden.

Eine weitere Variable, welche die Extraktionsausbeute bei der SPME beeinflusst, besonders wenn es sich beim Analyten um eine protonierbare oder deprotonierbare Spezies handelt, ist der pH-Wert der Probe. Meist wählt man bei einer Säure einen pH-Wert, der um mindestens zwei Einheiten unter dem pK_s-Wert der Säure liegt [173], sodass sie zum Großteil in der besser extrahierbaren Neutralform vorliegt. Bei Basen sollte der pH-Wert umgekehrt mindestens zwei pH-Einheiten über dem pK_s-Wert der protonierten Form liegen. Durch eine günstige Wahl des pH-Wertes können aber unter Berücksichtigung analoger Zusammenhänge auch gezielt basische oder saure Verunreinigungen in der Probe festgehalten und so von der Faser ferngehalten werden.

Die Zusammensetzung des Probenmediums wirkt sich wie die Faserauswahl auf die Größe des Verteilungskoeffizienten K_fp aus, der ein Maß für die maximal erreichbare Extraktionsausbeute ist. Zusatz von organischen Lösungsmitteln, wie er z. B. beim Dotieren der Probe mit in Ethanol oder Methanol gelösten inneren Standards auftritt, kann somit zu verminderter Extraktionsausbeute durch verbesserte Löslichkeit des Analyten in der Probe und Konkurrenz der im Headspace in hoher Konzentration vorliegenden Lösungsmittelmoleküle um die Adsorptionsstellen an der Faser führen. Daher sollte der Lösungsmittelanteil nach Möglichkeit unter 1 % des Probenvolumens betragen bzw. besser wässrige Lösungen des Standards verwendet werden.

Das Verhältnis der Volumina von Headspace und Probe spielt vor allem bei leichtflüchtigen Verbindungen eine Rolle. Bei Analyten mit geringerer Flüchtigkeit spielt das Volumenverhältnis aufgrund der kleinen Dampfraumkonzentration (kleines K_hp) nur eine untergeordnete Rolle.

Auch die Art des Rührens oder Schüttelns (Agitation) während der Extraktion ist für die Dauer der Gleichgewichtseinstellung von Bedeutung. Dabei ist darauf zu achten, dass der Rührvorgang reproduzierbar durchgeführt wird, was am besten über eine Automatisierung des Prozesses zu realisieren ist. Bei direktem Eintauchen der Faser in die Probenlösung (Immersion) bewirkt die Agitation eine schnellere Gleichgewichtseinstellung, da der Konzentrationsgradient in der Grenzschicht Probe/Faser sich bei ständiger Durchmischung nur über eine kurze Distanz erstreckt. Bei der Headspace-Variante ist hingegen die Grenzschicht Probe/Headspace ausschlaggebend, auch hier baut sich ohne Agitation ein Konzentrationsgradient größerer Ausdehnung auf, der zu einem verlangsamten Stofftransport führt.

Die eingesetzte Probenmenge sollte so gewählt werden, dass eine Sättigung der Faser durch den Analyten oder andere Probenbestandteile vermieden wird, aber trotzdem eine ausreichende Empfindlichkeit erreicht werden kann.

Die Verwendung innerer Standards ist bei quantitativen Bestimmungen in biologischem
Material unerlässlich. Der innere Standard sollte dem Analyten nach Möglichkeit strukturell nahe verwandt sein. Diese Forderung gilt bei der HS-SPME ganz besonders, da schon geringe Schwankungen in den experimentellen Bedingungen erhebliche Unterschiede in der Extraktionsausbeute strukturell verschiedener Substanzen bedingen können. Ideal ist die Verwendung entsprechender deuterierter Verbindungen.

Für die Desorption der Analyten von der Faser im GC-Inlet wählt man den Innendurchmesser des Liners nur wenig größer als den Außendurchmesser der verwendeten Faser, um einen schnellen Transport der Analyten durch den Trägergasstrom von der Faser über den Liner auf den Säulenkopf zu gewährleisten. Das Splitventil bleibt während der Desorption geschlossen, um Substanzverluste zu vermeiden. Die Temperatur wird dabei möglichst hoch gewählt, wobei die Obergrenze der Temperaturbelastbarkeit des Fasermaterials und eine eventuelle thermische Labilität des Analyten berücksichtigt werden müssen. Die Desorptionsdauer wählt man möglichst kurz, sie muss jedoch ausreichend lang sein, um eine vollständige Desorption zu gewährleisten, da sonst Empfindlichkeitsverluste auftreten können. In der Regel wird die Desorption mit der Regeneration der Faser für die nächste Messung verbunden. Eine unvollständige Desorption kann daher außerdem zur Verschleppung von Analyten führen.

Derivatisierungen können bei diesem Verfahren direkt in der Matrix (Extraktionsverhalten und Chromatographie des Analyten werden verändert) oder nach der Extraktion (nur das chromatographische Verhalten wird verändert) auf der Faser bzw. im Injektor durchgeführt werden. Bei Derivatisierung in der Probenmatrix ist die Auswahl der Reagenzien dadurch begrenzt, dass in wässrigen Proben nur mit hydrolysestabilen Derivatisierungsreagenzien (z. B. Chlorameisensäureester [174]) gearbeitet werden kann. Wenn der SPME-Extrakt auf der Faser derivatisiert wird, lassen sich zwei Vorgehensweisen unterscheiden. Zum einen die Derivatisierung nach der SPME-Extraktion durch Exponieren der Faser in dem mit Derivatisierungsreagenz gesättigten Dampfraum eines separaten Gefäßes (z. B. Acetylierung oder Silylierung) und zum anderen die Derivatisierung durch Eintauchen der Faser in ein möglichst wenig flüchtiges Derivatisierungsreagenz (z. B. Pyrenyldiazomethan [175]) vor der Extraktion mit schneller Umsetzung der Analyten an der Faser direkt nach dem Adsorptionsvorgang. Für die Derivatisierung im Injektor kommen vor allem Tetraalkylammoniumionen infrage, die durch Eintauchen in eine entsprechende Salzlösung auf die Faser gebracht werden können [176].

Die vielseitigen Anwendungen dieser Methode wurden von Pawliszyn in einer Monographie zusammengefasst [177]. Die Headspace-Festphasenmikroextraktion wird zur Lösung analytischer Probleme der Umwelt- und Lebensmittelchemie eingesetzt [178], findet aber auch für Fragestellungen der forensischen [179], klinischen [180] und pharmazeutischen Analytik [181] Anwendung.

Für HS-SPME sind auch relativ schwerflüchtige Analyten (semivolatile Verbindungen) geeignet, die mit einer statischen Headspace-Methode in der Regel nicht erfasst werden können. Die Methode schließt also die Lücke zwischen statischen Headspace-Methoden und der Injektion von gelösten Extrakten.

Besonders bieten sich Untersuchungen aus komplex zusammengesetzten Matrices mit HS-SPME an, da durch Auswahl einer SPME-Faser mit optimaler Selektivität die Belastung des Extraktes mit störenden Matrixkomponenten im Vergleich zu anderen Extraktionsverfahren sehr niedrig gehalten werden kann.

Diese Methoden gehören seit vielen Jahren zum Standardrepertoire des Analytikers, daher soll an dieser Stelle lediglich auf Literatur verwiesen werden, in der diese Techniken ausführlich beschrieben sind.

Die Gaschromatographie (GC), insbesondere die Kapillargaschromatographie, ist eines der wichtigsten Trennverfahren in der chemischen Analytik. Ein ausführlicher Überblick über diese Methode ist z. B. in den Werken von Engewald [182] oder Otto [183] zu finden.

Die Massenspektrometrie (MS) zählt heute zu den wichtigsten Detektionsmethoden in Verbindung mit der GC, da sie bei Mitführen innerer Standards (z. B. deuterierter Analoga) zur hochempfindlichen und genauen quantitativen Bestimmung von Substanzen genutzt werden kann. Zusätzlich liefert sie Strukturinformationen zu unbekannten Komponenten, die in vielen Fällen auch bei Fehlen von Vergleichsspektren zu einer eindeutigen Zuordnung führen können. Die in der Praxis am häufigsten mit der GC gekoppelten Massenspektrometer arbeiten mit einem Quadrupol als Massenfilter, so auch die für diese Arbeit genutzten Systeme. Die Prinzipien der Massenspektrometrie wurden beispielsweise von Budzikiewicz [184] und DeHoffmann [185] ausführlich dargelegt, detaillierte Erläuterungen zur Interpretation von Massenspektren finden sich in einer Monographie von McLafferty [186].

Die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ist eine leistungsfähige Trennmethode für polare organische Substanzen. Die wesentlichen Grundlagen, Prinzipien und praktischen Aspekte dieser Trennmethode wurden beispielsweise von Aced und Möckel [187] sowie von Meyer [188] ausführlich beschrieben.

In der vorliegenden Arbeit kam eine Trennsäule mit einer stationären Phase aus alkyliertem Kieselgel zum Einsatz (RP-Phase). Bei dieser so genannten Umkehrphasen-Chromatographie wird als Laufmittel (mobile Phase) ein polares Solvens genutzt (z. B. eine wässrige Pufferlösung), dem nach Bedarf Anteile organischer Lösungsmittel oder andere Substanzen, sog. „Modifier“, zugesetzt werden können.

Die Grundlagen der UV-Spektroskopie an organischen Molekülen werden in einschlägigen Lehrbüchern, z. B. von Skoog [189], beschrieben.

Die kontinuierliche Detektion des UV-Spektrums mittels eines Photodiodenarrays ist eine durch Einsatz von Computertechnik möglich gewordene Weiterentwicklung der bei fester oder variabler Wellenlänge arbeitenden UV-Detektoren und wird seit ca. 20 Jahren genutzt. Der Aufbau und die Funktionsweise eines Diodenarraydetektors (DAD) wird in einer Monographie von Huber und George beschrieben [190].