3.  EXPERIMENTELLER TEIL

Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen kamen zwei GC-MSD-Systeme der Firma Agilent Technologies in der folgenden Konfiguration zum Einsatz:

Gaschromatograph HP 6890+, Massenselektiver Detektor HP 5973 MSD, Steuersoftware HP-Chemstation G1701BA Version B.00.00. Als Steuerrechner diente ein HP Vectra XA (Windows NT).

Gaschromatograph HP 6890N, Massenselektiver Detektor HP 5973N MSD, Steuersoftware HP-Chemstation G1701DA Version D.00.00.38. Als Steuerrechner diente eine Evo Workstation von Compaq (Windows 2000).

Beide Geräte waren mit einer chromatographischen Trennsäule des Typs HP-5ms (30 m Länge, Innendurchmesser 0,25 mm, Innenbeschichtung 0,25 µm PDMS mit 5 % Phenylanteil) ausgestattet. Helium 5.0 diente als Trägergas.

Die verwendeten Septen (Thermogreen LB-2, vorgebohrt), die SPME-Insertliner (Innendurchmesser 0,75 mm) und die SPME-Fasern (PDMS/DVB, Schichtdicke 65 µm) wurden von Supelco (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.

Die Automatisierung der SPME-Extraktion wurde durch den Multi Purpose Sampler MPS2 (s. Abb. 9) der Firma Gerstel (Mühlheim/Ruhr, Deutschland) unter Verwendung der Software „cycle composer“ der Firma Chromtech GmbH (Idstein, Deutschland) realisiert.

Die Bestimmungen des Squalengehaltes der Extrakte wurden mit einer HPLC-Anlage der Firma Shimadzu Europe GmbH (Duisburg, Deutschland) durchgeführt. Sie bestand aus folgenden Komponenten: einer Pumpe des Typs LC-6A, einem Autosampler SIL-9A, einem Photodiodenarray-Detektor SPD-M10Avp und einem Steuerrechner (Standard IBM PC). Als Steuersoftware für den SPD-M10Avp wurde die Class-VP 5.032 bzw. LCsolution Version 1.02 SP2 verwendet.

Die Trennung wurde an einer Umkehrphasensäule für die HPLC des Typs Lichrospher-RP8ec, 5 µm, 250 x 4,0 mm (Merck, Darmstadt, Deutschland) mit Acetonitril (UV grade) als mobiler Phase durchgeführt. Die mobile Phase wurde mit einem Vakuum-Degasser DG-1210 (Optilab Chromatographie Technik, Berlin, Deutschland) von gelöstem Gas befreit.

Für das Abdampfen von Lösungsmitteln und zum Erhitzen von Reaktionsmischungen wurde ein zwischen 30 und 120°C digital einstellbarer Metallblockthermostat/Evaporator der Firma Liebisch (Bielefeld, Deutschland), Type 2366-DA, mit N₂-Zufuhr über Multiplex-Ventildepot verwendet.

Kurze Schüttelvorgänge erfolgten mit einem Vortex-Rüttler VF2 der Firma Janke & Kunkel GmbH & Co. KG (Staufen, Deutschland). Zwischen 12 K unter Raumtemperatur und 99°C thermostatisiertes und zeitprogrammiertes Schütteln wurde mit dem Thermomixer comfort der Firma Eppendorf (Hamburg, Deutschland) mit speziell an die Gefäße angepasstem Wechselblock durchgeführt.

Zum Pulverisieren von Haarproben wurde eine Kugelmühle der Firma Retsch (Haan, Deutschland), Typ M 2000, verwendet. Für Ultraschallbehandlungen kam ein Sonorex Super RK 255 H der Firma Bandelin electronic (Berlin, Deutschland) zum Einsatz.

Außerdem wurden eine Zentrifuge Heraeus-Labofuge 400 der Firma Kendro Lab. Prod. (Osterode, Deutschland), ein Trockenschrank Typ UE 300 der Firma Memmert GmbH & Co. KG (Schwabach, Deutschland), ein Mixer 5432 von Eppendorf (Hamburg, Deutschland) und ein pH-Meter Piccolo ATC der Firma Hanna Instruments (Kehl/Rhein, Deutschland) verwendet.

Firma E. Merck: DMSO (> 99,7 %), n-Heptan (> 99 %), n-Hexan (> 99 %), NaCl (> 99,5 %), KH₂PO₄ (> 99 %), Na₂HPO₄ x 2H₂O (Puffersubstanz), Ethylenglykol (> 99 %), Indolyl-3-essigsäure (> 99 %), Salzsäure rauchend 37 %, Acetonitril UV grade.

Firma Fluka: SOCl₂ (> 99 %) und Spülmittel zur Haarwäsche: 5 %ige Natriumdodecylsulfat-Lösung (SDS).

Firma Aldrich: 1-Phenyldodecan (97 %), C₂D₅OD (> 99 %), Squalen (97 %), Squalan (> 98 %), Natriummercaptoacetat (> 98 %).

5β-Androstan-3,17-dion wurde vom Institut für Dopinganalytik und Sportchemie, Kreischa, zur Verfügung gestellt.

Die kommerziell erhältlichen FSEE sowie die zur Synthese der übrigen FSEE und der deuterierten D₅-FSEE verwendeten Fettsäuren sind in Tabelle 3 aufgeführt und wurden von der Firma Aldrich bezogen. Die hier eingeführten Abkürzungen werden auch im weiteren Text verwendet. Wenn es sich um deuterierte Ethylester handelt, wird der Abkürzung ein „D₅ -“ vorangestellt.

Die als Standardsubstanzen verwendeten Fettsäureethylester waren zum größten Teil nicht kommerziell erhältlich und mussten zunächst synthetisiert werden. Dazu wurde folgende Vorschrift verwendet [191].

Tabelle 3: Übersicht über die kommerziell erworbenen, in dieser Arbeit verwendeten Fettsäuren/Fettsäureethylester.

In den Abkürzungen folgt dem C jeweils die Zahl der Kohlenstoffatome, die in der Carbonsäure enthalten sind. Die Vorsätze i bzw. a bezeichnen die Isomere der Carbonsäure mit Methylverzweigung in Iso- bzw. Anteiso-Position, die hochgestellten Zahlen nach ∆ geben die Position vorhandener Doppelbindungen an (immer cis). Ein angehängtes -Et bezeichnet den Ethylester der Fettsäure.

Es wurden zwischen 5 und 10 mg der jeweiligen Carbonsäure in ein zuvor ausgeheiztes und mit Schraubverschluss versehenes, 4 cm³ fassendes Glasgefäß eingewogen, in 20 µl Ethanol pro mg Säure gelöst und unter Verwendung eines PTFE-beschichteten Septums fest verschlossen. Nach Kühlen auf -15°C mittels einer Eis/Kochsalz-Mischung wurden 2 µl SOCl₂ pro mg Säure zugegeben. Unter wiederholtem Schütteln wurden die Reaktionsmischungen nun langsam auf Raumtemperatur gebracht und anschließend eine Stunde auf 40°C erwärmt. Die erhaltenen Emulsionen wurden unter Stickstoffstrom von überschüssigem C₂H₅OH, SOCl₂ und entstandenem HCl bzw. SO₂ befreit und zur vollständigen Entfernung dieser Bestandteile jeweils sechs mal in je 150 μl n-Hexan aufgenommen und erneut mit N₂ abgeblasen. Die Prüfung der Reaktionsprodukte auf Vollständigkeit der Umsetzung und Reinheit erfolgte jeweils durch Injektion von 1 µl einer verdünnten Lösung (100 µg/ml) in den Gaschromatographen und massenspektrometrischer Analyse im Full-Scan-Modus. Wenn keine Säure mehr nachzuweisen war, wurde von einer vollständigen Umsetzung (> 99 %) ausgegangen. War noch Edukt nachzuweisen, so wurde die Veresterungsreaktion wiederholt und das Produkt nochmals auf Reinheit untersucht. Die D₅-Fettsäureethylester wurden analog hergestellt, wobei C₂D₅OD anstelle von C₂H₅OH eingesetzt wurde.

In zwei Fällen waren nur die Ethylester, nicht aber die Säuren verfügbar. Die deuterierten Vergleichsverbindungen mussten daher in diesen Fällen aus den Ethylestern durch Umesterung hergestellt werden. Hierzu wurden je 10 mg Nonadecansäureethylester bzw. Linolensäureethylester in 100 μl D₆-Ethanol gelöst und nach Kühlung auf -15°C mit 0,5 μl konzentrierter Salzsäure versetzt. Unter wiederholtem Schütteln wurde die Reaktionsmischung langsam auf Raumtemperatur gebracht und 24 Stunden bei 40°C gehalten. Danach wurde wie bei der Synthese der FSEE verfahren. Die beiden erhaltenen Ester D₅ - C19-Et und D₅ - C18Δ^9,12,15-Et wurden mittels GC-MS auf noch vorhandenes Edukt untersucht. Die nicht deuterierten Ethylester waren jeweils mit etwa 10 % Anteil enthalten. Daher wurde die Umesterung mit dem Produktgemisch in gleicher Weise wiederholt. Bei anschließender Prüfung durch GC-MS betrug der undeuterierte Anteil weniger als ein Prozent.

Von den in allen Fällen als Öl erhaltenen FSEE wurde je ca. 1 mg eingewogen und in Chloroform gelöst, sodass die Konzentration 1 mg/ml betrug. Dann wurden die Lösungen zunächst im Verhältnis 1:10 verdünnt. Für Standardmischungen mehrerer FSEE wurden je 20 μl der 0,1 mg/ml Lösung der deuterierten Ester zusammengegeben und auf einen Milliliter aufgefüllt (Endkonzentration der Ester je 2 µg/ml).

3,52 g Kaliumdihydrogenphosphat und 9,1 g Dinatriumhydrogenphosphat x 2 H₂O wurden in destilliertem Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt. Dann wurde durch Zugabe von ca. 10 ml NaOH-Lösung (1 mol/l) auf pH 7,6 eingestellt (pH-Kontrolle mit pH-Meter).

120,12 g Harnstoff und 5,71 g Natriummercaptoacetat wurden in destilliertem Wasser gelöst und auf 250 ml aufgefüllt.

Für die Durchführung dieser Untersuchungen lag ein Votum der Ethikkommission der Charité vor. Bei lebenden Probanden wurde nach einer mündlichen und schriftlichen Aufklärung das schriftliche Einverständnis eingeholt. Die Untersuchung der Haarproben von Todesfällen erfolgte im Rahmen der staatsanwaltschaftlichen Untersuchungsaufträge.

In der Regel wurde ein etwa bleistiftdickes Bündel Haare am Hinterkopf des Probanden zusammengebunden und so nahe wie möglich über der Kopfhaut (verbleibende Restlänge ca. 1 mm) mit einer Schere abgeschnitten. Die Lagerung bis zur weiteren Vorbereitung der Probe erfolgte nach Einwickeln in Aluminiumfolie und Verwahren in einem geschlossenen und beschrifteten Umschlag im Kühlschrank bei < 4°C.

Haarproben von Todesfällen wurden während der Obduktion im Institut für Rechtsmedizin der Charité Campus Mitte entnommen. Hierbei wurden zunächst Todesfälle ausgewählt, bei denen aus polizeilichen Ermittlungen, aus Aussagen Bekannter oder Verwandter bzw. der gesamten Auffindesituation möglichst eindeutig hervorging, dass es sich um starke Alkoholiker handelte. In den meisten Fällen wurde dies bei der Obduktion durch alkoholtypische Organveränderungen bestätigt. Zum direkten Vergleich wurden auch Haarproben von Verstorbenen ohne Verdacht auf Alkoholismus asserviert.

Die Haarproben von Normaltrinkern und Abstinenzlern bzw. Kindern stammen aus dem privaten Umfeld der Mitarbeiter des Instituts für Rechtsmedizin bzw. anderen Freiwilligen. Zu jeder dieser Haarproben wurde ein Fragebogen ausgefüllt, auf dem Alter, Geschlecht, Haarfarbe, Trinkgewohnheiten und Besonderheiten der Haarpflege der jeweiligen Person erfasst wurden. Die Proben wurden zur Anonymisierung durchnummeriert und die entsprechenden Zusatzinformationen in einer Datei erfasst. Weitere Proben wurden im Zusammenhang mit medizinisch psychologischen Untersuchungen zur Überprüfung der Fahreignung analysiert. In Zusammenarbeit mit dem Evangelischen Krankenhaus Herzberge, Berlin, wurden außerdem insgesamt 29 Haarproben von Patienten in der stationären Entzugsbehandlung entnommen.

Aus 25 Alkoholikerhaarproben, die relativ hohe Mengen an FSEE enthielten, wurde ein Alkoholikerhaarpool erstellt, um ausreichend Probenmaterial konstanter Zusammensetzung zur Erarbeitung der analytischen Methode zu erhalten. Dafür wurden die vorgereinigten Haarproben nach Zurückbehalten von jeweils ca. 300 mg Haar für Einzeluntersuchungen mit einer Schere in 1-3 mm lange Stücke zerschnitten und anschließend vereinigt. Um einen homogenen Pool zu erhalten, wurden die so erhaltenen 26 g Haare in einem verschlossenen Schraubglas durch Schütteln und Umrühren intensiv vermischt.

Zur Herstellung eines Kinder-/Abstinenzlerhaarpools wurden vorher gewaschene, getrocknete und in 1-3 mm lange Stücke zerschnittene Haarproben von Kindern und Abstinenzlern, die niedrige FSEE-Konzentrationen zeigten, zu einem homogenen Haarpool vereinigt.

Ein Wattestäbchen aus 100 % Baumwolle („Bel nature“, Fa. Hartmann, Heidenheim, Deutschland) wurde in n-Heptan getränkt und anschließend eine ca. 2 x 2 cm große Fläche auf der Stirn, dem Rücken oder dem Oberarm mit dem befeuchteten Wattestäbchen sorgfältig abgewischt (Abb. 10 links). Der Kopf des Wattestäbchens wurde dann in ein 4 ml fassendes, braunes Glasgefäß mit Schraubverschluss gebracht und ohne Berührung mit den Händen über der Gefäßkante vom Stiel abgebrochen. Das Gefäß wurde bis zum vollständigen Verdunsten des n-Heptans offen stehen gelassen und schließlich mit Septum und Schraubverschluss fest verschlossen. Die Lagerung bis zur Vorbereitung und Messung der Proben erfolgte im Kühlschrank bei < 4°C.

	Abb. 10: Durchführung eines Wischtests an der Stirn (linkes Bild) und Anbringen eines Pflasters (Drugs of Abuse Patch der Firma PharmCheck) am Oberarm (rechtes Bild).

Es wurden Pflaster („Drugs of Abuse Patch“) der Firma PharmCheck (Haltom City, Texas, USA) verwendet. Nachdem eine Stelle am Oberarm des Probanden zunächst mit n-Heptan entfettet und gereinigt worden war, wurde das Pflaster auf die vorbereitete Stelle gelegt und die Schutzfolie langsam und vorsichtig abgezogen, sodass die selbsthaftende Schutzfolie über dem Pflaster den Hautbereich um das Pflaster herum dicht abschloss (Abb. 10 rechts). Nach Ablauf der vorgesehenen Tragezeit wurde das Pflaster durch vorsichtiges Anheben und Ablösen der Schutzfolie vom Oberarm entfernt, zunächst in Aluminiumfolie und dann in einen beschrifteten Umschlag gepackt. Auch die Pflaster wurden bis zur Untersuchung bei einer Temperatur von < 4°C im Kühlschrank gelagert.

In diesem Abschnitt werden die endgültigen, nach Optimierung angewendeten Methoden beschrieben. Methodenentwicklung und -optimierung werden im Ergebnis- und Diskussionsteil dargestellt (Abschnitt 4.1).

Reinigung und Zerkleinerung der Haarproben

Zur Reinigung wurden stark verschmutzte Haarproben zunächst in Wasser, das mit einigen Tropfen 5 %iger Dodecylsulfat-Lösung versetzt wurde, ca. 1 min lang intensiv gewaschen und mit warmem Wasser gut ausgespült. Bei extremer Verschmutzung der Haare bei Todesfällen wurde dieser Waschvorgang wiederholt, bis das Waschwasser keine Trübung mehr aufwies. Nach Vortrocknen mit einem Papierhandtuch wurde bei 35°C im Trockenschrank zwölf Stunden getrocknet. Danach wurden sie zur äußerlichen Entfettung zweimal mit n-Heptan gewaschen, falls die äußere Lipidschicht nicht untersucht wurde. Haarproben von lebenden Personen, die nicht verschmutzt waren, wurden nur mit n-Heptan entfettet. Anschließend wurden die Haarproben je nach Länge in Segmente geteilt und diese für die Analyse mit einer Schere in 1-3 mm lange Stücke zerschnitten.

Untersuchung der äußeren Lipidschicht

30 bis 50 mg der Haarprobe wurden in ein braunes, 4 ml fassendes Glasgefäß mit Schraubgewinde eingewogen, zweimal mit je 1 ml n-Heptan versetzt und nach Verschließen mit einem PTFE-beschichteten Septum und Schraubdeckel 1 min geschüttelt. Das n-Heptan wurde danach jeweils mit einer Pipette abgezogen und für die Analyse auf FSEE in einem 10 ml Headspace-Gefäß vereinigt. Nach Zugabe von je 40 ng der deuterierten Standards in 20 µl Chloroform wurde das Lösungsmittel im Stickstoffstrom abgeblasen. Für die HS-SPME-Untersuchung wurden zum Rückstand 0,5 g NaCl und 1 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 7,6) gegeben und das Gefäß mit einer magnetischen Bördelkappe und einem PTFE-beschichtetem Septum verschlossen.

Extraktion der Haarprobe

Die vorbehandelte Haarprobe wurde nun mit 2 ml n-Heptan, 0,5 ml DMSO und je 40 ng der deuterierten Standards (D₅-FSEE) in 20 µl Chloroform versetzt und nach Verschließen mit einem teflonbeschichteten Septum und einem Schraubverschluss 15 h bei Raumtemperatur geschüttelt.

Anschließend wurden, falls eine Squalenbestimmung durchgeführt wurde, 500 µl der n-Heptan-Phase für die Squalenanalytik abgenommen und in ein Spitzvial überführt. Nach vollständigem Verdampfen des Lösungsmittels mittels Stickstoffstrom wurde der Rückstand in 50 µl Acetonitril aufgenommen. Hiervon wurden 10 µl in die HPLC-DAD-Anlage eingespritzt und nach der in Abschnitt 3.4.5 beschriebenen Methode auf Squalen untersucht. Die verbliebenen 1,5 ml der n-Heptan-Phase wurden für die HS-SPME-Bestimmung der FSEE in ein 10 ml Headspace-Gefäß überführt und ebenfalls im Stickstoffstrom bis zur Trockne eingedampft. Dann wurden 0,5 g NaCl und 1 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 7,6) zugegeben und das Gefäß mittels einer magnetischen Bördelkappe mit PTFE-beschichtetem Silikonseptum fest verschlossen.

Die in dieser Weise aufgearbeiteten Proben (Oberflächenlipide und Haarextrakte) wurden dann nach der in Abschnitt 3.4.4 beschriebenen HS-SPME/GC-MS-Methode untersucht.

Zu der nach dem in Abschnitt 3.3.2 beschriebenen Verfahren gewonnenen Wischprobe (Wattestäbchenkopf) wurden in einem 4 ml Glasvial 2 ml n-Heptan gegeben. Nach 5-minütigem Schütteln bei Raumtemperatur wurden 0,5 ml der Lipidlösung abgenommen und unter Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde unter intensivem Schütteln in 100 µl Acetonitril aufgenommen. Zur Bestimmung der Squalenkonzentration wurden 10 µl dieser Lösung in die HPLC-DAD-Anlage injiziert. Weitere 0,5 ml der Lösung wurden in ein 10 ml Headspace-Gefäß überführt, mit je 20 ng der deuterierten FSEE in 10 µl Chloroform versetzt und zur Trockne eingedampft. Anschließend wurden 0,5 g NaCl und 1 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 7,6) zugegeben. Mit einer magnetischen Bördelkappe mit integriertem PTFE-beschichtetem Silikonseptum wurde das Gefäß nun fest verschlossen. Danach wurde die Probe nach der in Abschnitt 3.4.4 beschriebenen HS-SPME/GC-MS-Methode auf FSEE untersucht.

Bei der Ablösung der Hautlipide war darauf zu achten, dass das n-Heptan nicht unnötig lange mit dem Wattestabkopf in Kontakt blieb, da sonst aus ungeklärter Ursache erhöhte FSEE-Konzentrationen gefunden wurden.

Ein ca. 6 x 6 mm großer Ausschnitt des Pflasters (Gesamtabsorptionsfläche ca. 3 x 4,5 cm) wurde mit einer Schere vom Pflaster abgetrennt und in ein 4 ml fassendes Glasvial mit Schraubverschluss gebracht. Nach Zugabe von 2 ml n-Heptan wurde 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Es wurden jeweils 500 µl des Extraktes für die Bestimmung der Squalenkonzentration bzw. der FSEE-Konzentrationen abgenommen. Die weitere Probenaufarbeitung verlief analog der in 3.4.2 beschriebenen Verfahrensweise für die Wischproben.

Die Probe wurde zunächst im Heizblock des MPS2 bei 90°C für 5 min temperiert. Dann wurde die Nadel mit der PDMS/DVB-Faser durch das Septum eingestochen und für 30 min bei 90°C unter Schütteln (abwechselnd 60 s mit 250 rpm Agitieren und 30 s Pause) exponiert. Nach Einziehen der Faser in die Hohlnadel wurde die Nadel anschließend zum Injektorblock des Gaschromatographen bewegt und durch das Inlet-Septum eingestochen. Die Desorption erfolgte bei 250°C für 5 min. Während der folgenden gaschromatographischen Trennung und massenspektrometrischen Detektion der FSEE wurde bereits mit der Vorbereitung und Extraktion der nächsten Probe in der Sequenz begonnen.

Die GC-Säule wurde durchgängig mit einer Flussrate von 1 ml/min Helium betrieben (constant flow). Die GC-Injektionen erfolgten bei geschlossenem Splitventil (splitless), die Injektortemperatur betrug 260°C. 3 min nach Desorptionsbeginn wurde das Splitventil zur Spülung des Inlets mit einem Fluss von 30 ml/min geöffnet. Das folgende Temperaturprogramm wurde angewendet: 70°C für 3 min, mit 20 K/min auf 300°C, 5 min halten (Gesamtlaufzeit GC: 18,5 min).

Die Temperatur der Ionenquelle betrug 230°C, die des Quadrupols 106°C und die des GC-MS-Interface 280°C. Die Ionisierungsenergie der Ionenquelle lag bei 70 eV, die Elektronenmultiplier-Spannung 200 mV über der nach Autotune eingestellten Spannung. Ein Autotune wurde mindestens einmal pro Woche durchgeführt.

Die unter diesen Bedingungen eingestellten Retentionszeitfenster und die m/z-Werte, die im Selected Ion Mode (SIM) zur Detektion der FSEE verwendet wurden, sind in Tabelle 4 dargestellt. Zur quantitativen Auswertung wurde das Verhältnis der Peakflächen für die in Tabelle 4 fett gedruckten m/z-Werte (jeweils die m/z-Werte des einfach geladenen Molekülions) des undeuterierten zu denen des entsprechenden deuterierten Fettsäureethylesters herangezogen. Für den überwiegenden Teil der Untersuchungen wurde die Analyse auf die vier in der höchsten Konzentration vorkommenden FSEE (Ethylmyristat, Ethylpalmitat, Ethyloleat und Ethylstearat) beschränkt und nur die zu diesen Estern gehörigen Ionenspuren aufgezeichnet. Die Kalibration und die Validierung der Methode sind in Abschnitt 4.1.5.1 beschrieben.

Tabelle 4: SIM-Zeitfenster und zur Detektion der FSEE verwendete m/z-Werte.

Das Laufmittel (100 % Acetonitril) wurde mit einer Flussrate von 1,5 ml/min im Kreislauf geführt. Die Detektion des Squalens erfolgte nach Trennung auf einer RP8-Säule bei einer Retentionszeit von ca. 6 min. Für die Peakidentifikation wurde zusätzlich das UV-Spektrum genutzt. Zur quantitativen Auswertung wurde die Absorption bei 208 nm herangezogen. Die Kalibration und die Validierung dieser Methode sind in Abschnitt 4.1.5.2 beschrieben.