4.  ERGEBNISSE UND DISKUSSION

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Headspace-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) in Kombination mit GC-MS für die quantitative Bestimmung von FSEE angewandt, nachdem vorherige Versuche, FSEE in Haaren nach Flüssigextraktion und SPE mit anschließender GC-MS nachzuweisen, nicht zu den erforderlichen Nachweisgrenzen geführt haben [134]. Durch die Anreicherung der Analyten an einer SPME-Faser über dem Dampfraum der Probe war zu erwarten, dass nur noch ein Bruchteil vor allem der schwereren oder polaren im Extrakt enthaltenen Lipide mitextrahiert würden und es so zu einer Anreicherung der lipophilen FSEE käme. In allen zur Entwicklung und Optimierung der Methode zur FSEE-Bestimmung durchgeführten Experimenten wurden die vier Ester Ethylmyristat, Ethylpalmitat, Ethyloleat und Ethylstearat gemessen.

Außerdem wurde eine schnelle und robuste HPLC-DAD-Methode zur quantitativen Bestimmung von Squalen aus Hautoberflächen- und aus Haarlipiden entwickelt.

In der Haaranalytik kommt der Vorbehandlung im Sinne des Entfernens äußerer Anhaftungen sowie der Lagerung der Proben generell eine große Bedeutung zu. Ohne einen vor der Extraktion ausgeführten Waschvorgang kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Analyten selbst oder analytisch störende Substanzen aus äußeren Quellen auf das Haar gebracht wurden und das Ergebnis verfälschen. Dies kann absichtlich (man kann auf einschlägigen Seiten im Internet z. B. Shampoos bestellen, deren Anwendung den Nachweis von Betäubungsmitteln im Haar gezielt stören soll), aber auch unabsichtlich, beispielsweise durch Behandlung mit Haarkosmetika oder Kontamination durch Stäube, Rauch oder andere äußere Einflüsse geschehen.

Die sachgemäße Lagerung der Haarproben ist von Bedeutung, da unter Einwirkung von Licht, Wärme oder Feuchtigkeit empfindliche Analyten nach und nach durch Hydrolyse oder Oxidation zerstört werden können, wenn eine zeitnahe Messung nach der Probennahme nicht möglich ist oder asservierte Proben nachträglich untersucht werden sollen.

Um die Voraussetzungen für eine hohe Messempfindlichkeit und eine Vergleichbarkeit von FSEE-Konzentrationen in Haarextrakten zu schaffen, musste ausgeschlossen werden, dass auf der Haaroberfläche haftende Ethylester mit erfasst werden oder die Messung durch andere Kontaminationen gestört wird. Daher wurden die Haarproben der Todesfälle und stark verschmutzte Proben zunächst mit einer Tensidlösung (Dodecylsulfat in H₂O) gewaschen und getrocknet. Alle Haarproben wurden vor der eigentlichen Extraktion äußerlich mit n-Heptan entfettet. In einigen Fällen wurden die so erhaltenen n-Heptan-Lösungen parallel zum Haarextrakt auf FSEE untersucht, um Aufschluss über deren Einlagerungsweg ins Haar zu erhalten. Wie in Abschnitt 4.2.1 gezeigt wird, erwies sich diese äußere Dekontamination als sehr wichtig, da die in der äußeren Haarlipidschicht gefundenen FSEE-Mengen zum Teil die in der Haarmatrix gefundenen bei weitem überstiegen.

Versuche zur Klärung des Einflusses wiederholter Haarwäschen mit einem handelsüblichen Shampoo auf die Menge der extrahierten FSEE wurden ebenfalls durchgeführt und werden in Abschnitt 4.3.2.7 im Zusammenhang mit den Einflussgrößen auf die FSEE-Konzentrationen im Haar beschrieben.

Die zu untersuchenden Proben wurden grundsätzlich in Aluminiumfolie eingewickelt und bei < 4°C im Kühlschrank aufbewahrt. Unter diesen Bedingungen konnte auch nach Ablauf von 4 Monaten bei erneuter Extraktion und Messung von 3 jeweils in Doppelbestimmung untersuchten Haarproben von Lebenden keine Verminderung des FSEE-Gehaltes festgestellt werden.

Wiederholte Messungen an zwei individuellen Proben von Todesfällen (Probe 1 und Probe 2 in Tabelle 5) und einem Alkoholikerhaarpool nach Lagerung bei Raumtemperatur in einem Glasgefäß über 5 Monate zeigten jedoch, dass unter diesen Bedingungen eine deutliche Abnahme der FSEE-Konzentrationen auftreten kann (vgl. Tabelle 5). Bei dem Haarpool, der aus nur mit Tensidlösung gewaschenem Haar von Todesfällen mit vermutetem Alkoholabusus zusammengestellt worden war, kam es innerhalb dieses Zeitraumes zu einer Abnahme der FSEE-Konzentrationssumme auf 62 % des Ausgangswertes. Wahrscheinlich ist diese Abnahme auf Hydrolyse der Ester durch Feuchtigkeitsreste im Haar und Autoxidation, in erster Linie aber auf den mikrobiellen Befall einzelner Leichenhaar-

Tabelle 5: Verminderung der FSEE-Konzentrationen im Haar bei längerer Lagerung bei Raumtemperatur.

proben, die dem Pool zugemischt wurden, zurückzuführen. In den anderen beiden untersuchten Fällen reduzierte sich die Konzentrationssumme auf 50 bzw. 31 % des Ausgangswertes, wobei die Probe mit der höheren Ausgangskonzentration, die von einem extremen Alkoholiker stammte, einen stärkeren relativen Rückgang zeigte.

Es empfiehlt sich daher, Haarproben von Todesfällen möglichst zeitnah zur Probenentnahme zu analysieren. Falls das nicht möglich ist, sollten die Proben bis zur Analyse vor Feuchtigkeit geschützt und tiefgekühlt gelagert werden, um eine starke Reduzierung des FSEE-Gehalts infolge von Bakterienbefall und Hydrolyse zu vermeiden.

Eine alkalische Hydrolyse der Haare vor der Extraktion, wie sie für den Nachweis einer Vielzahl anderer Verbindungen mit gutem Erfolg durchgeführt werden kann [192-194], kam aufgrund der im Basischen instabilen Esterbindung nicht in Betracht. Auch auf eine enzymatische Auflösung des Haars musste wegen der Gefahr der Esterspaltung verzichtet werden. Zunächst wurde daher der HS-SPME eine Fest/Flüssig-Extraktion der Haare vorangestellt. Ein für diesen Schritt geeignetes Extraktionsmittel muss zum einen die Fähigkeit besitzen, Haare zu quellen, um die Diffusion der FSEE aus dem Haar heraus zu beschleunigen, zum anderen muss es sich durch ein gutes Lösungsvermögen für die Analyten auszeichnen. Schließlich darf es nicht mit den FSEE reagieren. Zum Quellen des Haares sind protische Lösungsmittel wie z. B. Wasser, Methanol, Ethylenglykol aber auch DMSO als aprotisches Solvens geeignet, da sie die Fähigkeit besitzen, unter Volumenzunahme des Haares und Auflockerung der Haarstruktur in das Haar einzudringen [144]. Zum Lösen der Fettsäureethylester sind im Gegensatz dazu nur relativ unpolare Lösungsmittel wie Heptan, Chloroform oder CH₂Cl₂ etc. geeignet. Alkohole wie Methanol und Ethanol besitzen zwar sowohl ein Quellvermögen für Haare als auch ein gewisses Lösevermögen für lipophile Substanzen, jedoch haben Vorversuche gezeigt, dass es bei Verwendung von Methanol oder Ethanol zur Esterbildung oder Umesterung kommen kann [134]. Eine weitere Voraussetzung ist, dass das Lösungsmittel anschließend unter milden Bedingungen wieder entfernt werden kann. Daher bot es sich an, ein zweiphasiges Lösungsmittelgemisch bestehend aus einem polaren, in die Haarstruktur eindringenden und einem unpolaren, leicht verdampfbaren Lösungsmittel zu verwenden. Nach diesen Vorüberlegungen wurden einige zweiphasige Lösungsmittelsysteme auf ihre Eignung als Extraktionsmittel untersucht. Für die Extraktion wurden 50 mg des Alkoholikerhaarpools mit den zweiphasigen Gemischen in Glasgefäßen bei Raumtemperatur für 22 h geschüttelt, die unpolare Lösungsmittelphase abgetrennt und nach Eindampfen und Zugabe von 1 ml Phosphatpuffer (pH 7,6) und 0,5 g Kochsalz mit der in Abschnitt 3.4.4 beschriebenen HS-SPME/GC-MS-Methode untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 6 angegeben. Ein Gemisch aus DMSO und n-Heptan stellte sich als das effektivste Extraktionsmittel heraus. Bei der zusätzlich erprobten Verwendung von Chloroform oder Dichlormethan statt n-Heptan als Lösemittel verschlechterte sich der chromatographische Untergrund deutlich, ohne dass höhere Extraktionsausbeuten erzielt wurden. In den weiteren Versuchen kam deshalb ein Gemisch aus 2 ml n-Heptan als Lösemittel und 0,5 ml DMSO als Quellmittel zum Einsatz.

Tabelle 6: Relative Ausbeuten der Extraktion von Fettsäureethylestern aus einem Alkoholikerhaarpool.

Durch Mehrfachextraktion von Haarproben wurden die absoluten Extraktionsausbeuten bei Verwendung dieses Extraktionsgemisches ermittelt. Dazu wurden die Haarproben nach der ersten Extraktion und vollständiger Abtrennung der Heptanphase erneut mit 2 ml n-Heptan überschichtet und für 22 h geschüttelt. Die zweite Extraktion lieferte Werte, die im Mittel nur noch ca. 4 % der Werte für die erste Extraktion betrugen. Nach einem dritten Extraktionsschritt konnten keine FSEE mehr im Extrakt nachgewiesen werden. Es ergaben sich somit absolute Extraktionsausbeuten von > 90 % für alle untersuchten Fettsäureethylester. Um den zeitlichen Verlauf der Extraktion zu klären, wurden in einer weiteren Versuchsreihe jeweils 50 mg Alkoholikerhaarpool für eine Dauer zwischen 3 und 24 h mit dem n-Heptan/DMSO-Gemisch extrahiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 11 graphisch dargestellt. Für das Ethylpalmitat war die Extraktion bereits nach ca. 6 h vollständig, für die anderen Ester war ein weiterer Anstieg der Konzentrationen zu verzeichnen, bis nach ca. 12 Stunden ein Plateau erreicht wurde. Für die praktische Anwendung der Methode wurde eine Extraktionsdauer von 15 h festgelegt.

	Abb. 11: Einfluss der Extraktionsdauer auf die im n-Heptan/DMSO-Extrakt gemessene FSEE-Konzentration. Es wurden jeweils 50 mg Alkoholikerhaarpool mit 0,5 ml DMSO und 2 ml n-Heptan extrahiert und Doppelbestimmungen durchgeführt.

Auf Ultraschallbehandlung wurde vollständig verzichtet, da Vorversuche ergeben hatten, dass es durch die im Haar befindliche Restfeuchtigkeit in Verbindung mit den hohen Temperaturen, die bei Ultraschall lokal entstehen können, zu verstärkter Hydrolyse der Ester kommen kann. Zudem konnten im Chromatogramm eine wesentliche Erhöhung des Grundrauschens und eine erhöhte Zahl störender Matrix-Peaks beobachtet werden. Ähnliche Beobachtungen wurden beim Mahlen der Haare mit einer Kugelmühle gemacht. Als Extraktionsgefäße wurden ausschließlich Glasgefäße mit Schraubverschluss und teflonbeschichteten Septen verwendet, da sich im Laufe der Untersuchungen herausgestellt hatte, dass aus den zunächst verwendeten Polypropylen-Röhrchen mit Schraubverschluss bei der Extraktion neben Weichmachern und Oligomeren, die ein erhebliches Grundrauschen erzeugten, auch Substanzen herausgelöst wurden, die in Abstinenzlerhaarproben einen positiven Befund für alle vier FSEE, vor allem aber für Ethylstearat, vortäuschten. Aufgrund der starken Matrixbelastung und der kaum auswertbaren resultierenden Signale konnte nicht endgültig geklärt werden, ob es sich hierbei wirklich um diese Verbindungen gehandelt hat. Dies erscheint aber eher unwahrscheinlich.

Um dieses mehrere Aufarbeitungsschritte umfassende und relativ aufwändige Verfahren zu vereinfachen, wurde in weiteren Experimenten überprüft, ob die FSEE auch ohne den vorgeschalteten Extraktionsschritt durch HS-SPME direkt aus dem Haar extrahierbar sind. Dazu wurde zunächst eine Menge von ca. 30 mg Haar und je 40 ng der deuterierten FSEE in 20 µl DMSO in ein 10 ml HS-Gefäß gegeben und nur unter Zusatz der HS-SPME-Probenflüssigkeit (s. S. 58f) mit einer PDMS/DVB-Faser extrahiert und mit GC-MS analysiert. Bei Anwendung dieses „direkten“ HS-SPME-Verfahrens gelangten zwar sowohl FSEE aus dem Haar als auch deuterierte Standards an die Faser und konnten anschließend mittels GC-MS detektiert werden, die Reproduzierbarkeit der quantitativen Ergebnisse war aber unter diesen Bedingungen nicht zufrieden stellend (Standardabweichungen von bis zu 40 %). Der Zusatz verschiedener Reagenzien (Ethylenglykol, Harnstoff-Lösung mit und ohne Zusatz von Thioglykolsäure) in das Headspace-Gefäß mit dem Ziel, ein Quellen der Haare zu bewirken und eine einheitliche Oberfläche der Probenflüssigkeit und reproduzierbarere Diffusionsverhältnisse zu schaffen, brachte in dieser Hinsicht zwar eine Verbesserung, die Standardabweichung für 10 Einzelmessungen eines Alkoholikerhaarpools blieb aber mit über 10 % weiterhin unbefriedigend. Um die quantitativen Ergebnisse der Kurzmethode (K) mit den Ergebnissen bei Verwendung der Methode mit vorhergehender

	Abb. 12: Vergleich der mit der Kurzmethode (30 mg Haare + 40 ng D5-FSEE in 20 µl DMSO + 0,5 g NaCl + 1 ml Phosphatpuffer pH 7,6 in 10 ml Headspace-Gefäß direkt mit HS-SPME extrahiert; HS-SPME/GC-MS-Methode s. Abschnitt 3.4.4) und nach Vorextraktion mit zweiphasigem Extraktionsmittel (Standardmethode, s. Abschnitt 3.4.1) erhaltenen quantitativen FSEE-Werte im Haar.

Extraktion (S: Standardmethode) zu vergleichen, wurden 5 Todesfallhaarproben mit beiden Methoden jeweils in Doppelbestimmung untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 12 wiedergegeben. Es ergaben sich deutlich voneinander abweichende Ergebnisse, wobei unter Verwendung der Kurzmethode in zwei Fällen (Probe 1 und 2) deutlich höhere, in den anderen 3 Fällen (Probe 3-5) dagegen etwas niedrigere Konzentrationssummen gefunden wurden. der Hauptgrund für die erniedrigten Werte liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit in der relativ langsamen Diffusion der FSEE aus dem Haar, die dazu führt, dass sich bei Ende der 30-minütigen HS-SPME-Extraktion das Verteilungsgleichgewicht für die undeuterierten FSEE noch nicht vollständig eingestellt hat. Eine Erklärung für die erhöhten Werte kann in dem Entweichen der deuterierten inneren Standards (D₅-FSEE), die vor Abschluss des Diffusionsprozesses der FSEE aus dem Haar einen überproportionalen Dampfdruck im Dampfraum des Probengefäßes haben, durch das von der SPME-Nadel angestochene Septum gesehen werden (vgl. hierzu Abschnitt 4.1.3.2 und 4.1.3.3). Im Einzelfall kann das Wechselspiel dieser beiden Faktoren in Abhängigkeit von individuellen Eigenschaften der jeweiligen Haarprobe zu einer erniedrigten oder auch zu einer erhöhten FSEE-Konzentration führen. Weitere Versuche, die ein längeres Einweichen der Haare in einem fest verschlossenen Gefäß bei erhöhter Temperatur vor der HS-SPME-Extraktion sowie eine Erhöhung der Extraktionsdauer umfassten, wurden wegen mangelnder Reproduzierbarkeit der quantitativen Ergebnisse abgebrochen. Somit erwies sich diese verkürzte Methode für quantitative FSEE-Bestimmungen als ungeeignet.

Bei der favorisierten Vorextraktion der Haare mit dem zweiphasigen Extraktionsmittel erreicht man vor der HS-SPME-Extraktion bereits eine gleichmäßige Verteilung des deuterierten inneren Standards in der Probenlösung, sodass derartige Probleme ausgeschlossen werden können. Allerdings muss dafür ein erhöhter Aufwand bei der Probenvorbereitung in Kauf genommen werden.

Der gesamte Extraktionsvorgang muss so auf die zu erfassenden Substanzen abgestimmt sein, dass diese möglichst vollständig aus der Haarmatrix in das Extraktionsmedium (SPME-Faser) übergehen, wobei eine gleichzeitige Extraktion störender Matrixbestandteile möglichst nur in geringem Umfang stattfinden soll. Da die in 4.1.2 beschriebene Vorextraktion des Haars mit einem DMSO/n-Heptan-Gemisch alle mobilisierbaren Lipide im Haar erfasst, musste dies von der HS-SPME-Methode geleistet werden.

Bei allen Optimierungsversuchen für die HS-SPME wurde auf den Zusatz deuterierter Standards verzichtet, da hier nur die absoluten Signalintensitäten wichtig sind. In allen Versuchen außer denen zur Auswahl des Faserbeschichtungsmaterials wurde eine PDMS/DVB-beschichtete Faser eingesetzt, die HS-SPME-Extraktion wurde mit einem automatischen Probengeber (MPS2, Firma Gerstel) durchgeführt.

Die zu optimierenden Parameter bei der HS-SPME umfassen die Zusammensetzung der Probenflüssigkeit (pH-Wert, Salzzusatz), die Extraktionstemperatur, die Extraktionsdauer, die Auswahl des Faserbeschichtungsmaterials und ggf. dessen Schichtdicke, die Rührgeschwindigkeit sowie die Desorptionsdauer und -temperatur.

Bei allen Optimierungsexperimenten wurde zu dem nach Eindampfen der Heptanphase des DMSO/n-Heptan-Haarextraktes erhaltenen Rückstand 1 ml Phosphatpuffer pH 7,6 gegebenen, um eine definierte flüssige Oberfläche zu erhalten, auf der ein sich ständig erneuernder Lipidfilm dafür sorgt, dass sich das Verteilungsgleichgewicht zwischen flüssiger Phase und SPME-Faser über den Dampfraum zügig einstellen kann. Ohne Zusatz von Pufferlösung wurden generell niedrigere absolute Peakflächen bei verschlechterter Reproduzierbarkeit erhalten. Der pH-Wert (7,6) wurde schwach alkalisch gewählt, um die im Extrakt in großer Menge vorhandenen freien Fettsäuren (pK_s ≈ 5) als Carboxylate in der flüssigen Phase zu binden, ohne Gefahr zu laufen, die FSEE alkalisch zu hydrolysieren.

Da ein Salzzusatz zur flüssigen Phase bei der HS-SPME häufig zu einem erhöhten Dampfdruck der Analyten im Dampfraum und somit zu einer erhöhten Extraktionsausbeute führt, wurde in einer Reihe von Versuchen der Einfluss verschiedener Salzzusätze untersucht. Hierzu wurden zunächst in Abwesenheit von Haarextrakt jeweils 1 ml Phosphatpuffer und 0,5 g des entsprechenden Salzes zu den FSEE gegeben, wobei ein Teil des Salzes ungelöst als Bodenkörper zurückblieb. Die Ergebnisse sind in Abb. 13 dargestellt und lassen erkennen, dass wider Erwarten ohne Salzzusatz die höchsten Peakflächen erhalten werden. Bei der Untersuchung von Haarextrakten statt der reinen Referenzsubstanzen stellte sich jedoch heraus, dass bei Anwesenheit von Salzen höhere, zumindest aber gleich hohe Flächen gefunden werden wie ohne Salzzusatz. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Salzzusätzen sind vergleichsweise gering ausgeprägt, wie das bei sehr unpolaren Analyten zu erwarten ist (vgl. Abschnitt 2.3.3). Die Zugabe von NaCl lieferte im Vergleich mit den anderen Salzzusätzen die höchste Extraktionsausbeute. Daher wurde in allen weiteren Untersuchungen mit einem Zusatz von 0,5 g NaCl gearbeitet.

	Abb. 13: Einfluss des zugesetzten Salzes (jeweils 0,5 g) auf die GC-MS-Peakflächen von Fettsäureethylestern bei der HS-SPME in Abwesenheit von Haarmatrixbestandteilen. Extraktionstemperatur 100°C, Extraktionsdauer 30 min. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.

Um die Extraktionstemperatur zu optimieren, wurden jeweils 100 ng der vier untersuchten FSEE mit 0,5 g Na₂SO₄ und 1 ml Phosphatpuffer (pH 7,6) versetzt und mit der in Abschnitt 3.4.4 beschriebenen HS-SPME/GC-MS-Methode untersucht. In Abb. 14 sind die absoluten Flächen unter den Peaks der jeweiligen Molmassenspuren gegen die Extraktionstemperatur aufgetragen. Die Extraktionsdauer wurde konstant auf 30 min gehalten. Im Bereich zwischen 40 und 100°C führte eine Temperaturerhöhung bei allen vier Verbindungen zu einer Erhöhung der Extraktionsausbeuten, wobei Ethyloleat und Ethylstearat erst ab ca. 60°C extrahiert wurden. Ab ca. 100°C war nur noch ein geringer Anstieg bzw. für Ethylmyristat sogar eine Erniedrigung der Peakflächen zu verzeichnen. Gleichzeitig wurde mit steigender Temperatur vor allem oberhalb von 100°C die Reproduzierbarkeit stark beeinträchtigt. Sowohl für die verschlechterte Reproduzierbarkeit als auch für die Erniedrigung der Peakfläche des Ethylmyristats bei Temperaturen oberhalb 100°C sind vermutlich Substanzverluste durch das angestochene Septum verantwortlich. Diese Verluste fallen für Ethylmyristat aufgrund der im Vergleich zu den längerkettigen Estern relativ hohen Dampfraumkonzentration am stärksten ins Gewicht und überkompensieren einen positiven Effekt der Temperaturerhöhung, wie er bei den anderen Estern beobachtet werden kann. Daher wurden in der Messmethode 90°C als Extraktionstemperatur festgelegt.

	Abb. 14: Abhängigkeit der GC-MS-Peakflächen von der SPME-Extraktionstemperatur bei konstanter Extraktionsdauer von 30 min. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.

Zur Optimierung der Extraktionsdauer wurden je 100 ng der vier Ester nach Zugabe von 0,5 g Na₂SO₄ und 1 ml Phosphatpuffer (pH 7,6) bei einer konstant gehaltenen Extraktionstemperatur von 100°C zwischen 10 und 60 min lang extrahiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 15 dargestellt. Für alle vier untersuchten FSEE wurde nach ca. 30 min das Verteilungsgleichgewicht zwischen flüssiger Phase und SPME-Faser erreicht. Eine weitere Verlängerung der Extraktionsdauer führte zu einer leichten Erniedrigung der Extraktionsausbeuten. Dies resultiert zum einen aus Substanzverlusten durch die Einstichstelle im Septum und zum anderen aus hydrolytischer Zersetzung der Ester. Um einen hohen Probendurchsatz zu gewährleisten, sollte die Extraktionsdauer als geschwindigkeitsbestimmender Schritt in der automatisierten SPME nach Möglichkeit kurz gehalten werden. Andererseits ist ein Abbruch der Extraktion vor Erreichen des Verteilungsgleichgewichts mit einer erniedrigten Empfindlichkeit durch verminderte Extraktionsausbeuten und einer geringeren Reproduzierbarkeit verbunden, vor allem im Bereich starker Steigung der Extraktionsausbeute gegen die Extraktionsdauer. In der Methode für die FSEE-Konzentrationsbestimmungen aus Haarextrakten wurde daher eine Extraktionsdauer von 30 min festgelegt.

	Abb. 15: Abhängigkeit der GC-MS-Peakflächen von der Extraktionsdauer bei konstanter Extraktionstemperatur von 100°C. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.

Bei der Faserwahl müssen grundsätzlich zwei Faktoren in Betracht gezogen werden: zum einen die Polarität des Analyten und zum anderen seine Flüchtigkeit und Molekülgröße. Üblicherweise wählt man zunächst ein Beschichtungsmaterial, das eine ähnliche Polarität wie der Analyt aufweist. Die Filmdicke wählt man mit steigender Molekülmasse tendenziell dünner, um Verschleppungseffekte durch langsamere Diffusionsgeschwindigkeiten im Faserinneren für größere Analyten zu vermeiden. Große Beschichtungsvolumina bewirken durch die erhöhte Aufnahmekapazität eine effektive Extraktion flüchtiger Substanzen.

Nach den Herstellerangaben und durch Vergleich mit vorher publizierten Ergebnissen bezüglich anderer, ähnlich unpolarer Analyten erschienen als Faserbeschichtungsmaterial entweder PDMS/DVB (65 µm) oder reines PDMS (30 µm) als besonders geeignet. Faserbeschichtungen aus Polyacrylat oder auf Carbowax^®-Basis kamen aufgrund ihrer hohen Polarität weniger in Betracht. Die PDMS/DVB-Faser kombiniert als bipolare Faser eine hohe Lipophilie der quasiflüssigen PDMS-Schicht, in der sich die schwach polaren FSEE sehr gut lösen, mit einem DVB-Anteil, der in Form poröser Partikel eingearbeitet ist und zusätzliche Adsorptionsstellen zur Verfügung stellt.

In Abb. 16 sind die Ergebnisse der experimentellen Überprüfung verschiedener Faserbeschichtungsmaterialien hinsichtlich ihrer Eignung zur Extraktion von FSEE aus einem Haarextrakt dargestellt. Dazu wurden zunächst mehrere Haarproben extrahiert, die Extrakte vereinigt und zu gleichen Teilen in HS-Gefäße gebracht. Alle Messungen wurden am selben Tag in Doppelbestimmung durchgeführt, um Flächenschwankungen, die durch

	Abb. 16: Relative HS-SPME-Extraktionsausbeuten für FSEE aus Haarextrakt bei Verwendung verschiedener Faserbeschichtungsmaterialien (Extraktionsausbeute für PDMS/DVB = 100 %).

den Zustand der Ionenquelle, die MS-Tuning-Parameter oder die Chromatographie bedingt sein könnten, nach Möglichkeit klein zu halten. Im direkten Vergleich der PDMS/DVB-Faser (65 µm) mit der PDMS-Faser (30 µm) stellte sich heraus, dass mit der reinen PDMS-Faser für alle vier FSEE nur < 70 % der Extraktionsausbeuten, die bei Verwendung der PDMS/DVB-Faser erhalten wurden, erreicht werden konnten. Die zusätzlichen Adsorptionsstellen an den DVB-Partikeln wirken sich dabei besonders günstig auf die leichteren FSEE aus, die bei Verwendung der 30 µm PDMS-Faser nur eine relative Extraktionsausbeute von 40 % erreichten. Eine Erhöhung der Beschichtungsdicke auf 100 µm PDMS resultierte zwar in einer leichten Erhöhung der relativen Extraktionsausbeuten (< 80 % bezogen auf PDMS/DVB, 65 µm), ist aber auch mit einer erhöhten Verschleppungsgefahr durch verlangsamte Desorption vor allem der schwereren FSEE verbunden. Die polaren Fasermaterialien lieferten erwartungsgemäß ebenfalls deutlich reduzierte relative Extraktionsausbeuten, wobei die Carbowax^®-basierte Faser (CW/DVB, 65 µm) durch den Anteil an DVB-Partikeln im Vergleich zu der reinen Polyacrylat-Faser (PA, 85 µm) deutlich bessere Ergebnisse lieferte (CW/DVB um 80 %, PA < 30 %). Im Ergebnis wurde die PDMS/DVB-Faser für die Routinemessungen gewählt.

Die Desorptionsdauer muss ausreichend lang gewählt werden, um eine vollständige Desorption des SPME-Extrakts zu gewährleisten, da sonst mit Verschleppung gerechnet werden muss. Andererseits soll die Analysendauer nicht durch eine unnötig lange Desorption verlängert werden, um einen hohen Probendurchsatz zu gewährleisten. Die Hitzeeinwirkung im Injektorblock kann zudem die Lebensdauer der Faser verkürzen. Eine Desorptionsdauer von 5 min erwies sich in dieser Hinsicht als praktikabler Kompromiss.

In früheren Untersuchungen von Sporkert und Pragst wurde festgestellt, dass die absolute Extraktionsausbeute bei der HS-SPME mit steigender Probenmenge sinkt [194,195]. Im Falle der FSEE, bei denen nur der Lipidextrakt statt des ganzen alkalisch hydrolysierten Haars analysiert wird, konnte derselbe Effekt beobachtet werden. In einer Versuchsreihe wurden 0, 10, 20, 50 und 100 mg eines Abstinenzlerhaarpools mit je 40 ng der vier undeuterierten FSEE in 20 µl CHCl₃ versetzt und nach dem Standardverfahren (Abschnitt 3.4.1) extrahiert. Die Untersuchung der Extrakte mit der in Abschnitt 3.4.4 beschriebenen HS-SPME/GC-MS-Methode und Vergleich der erhaltenen Peakflächen mit der bei Direkteinspritzung der gleichen Menge FSEE erhaltenen Flächen ergab die in Abb. 17 dargestellten absoluten Extraktionsausbeuten. Danach wurden bei Einsatz einer Haarmenge von 5 mg die höchsten HS-SPME-Extraktionsausbeuten erzielt (32-39 %). Weitere Erhöhung der Haarmenge führte zu einem Abfall der Extraktionsausbeute auf Werte zwischen 5 und 10 % bei einer Haarmenge von 100 mg. Als Erklärung für diese Beobachtung können im Haarextrakt enthaltene oberflächenaktive Substanzen, die zu einer verbesserten Löslichkeit der FSEE in der flüssigen Phase und damit einem kleineren Verteilungskoeffizienten für das Verteilungsgleichgewicht zwischen Faser und der flüssigen Phase führen, herangezogen werden. Eine andere Erklärung wären Sättigungs- und Verdrängungseffekte auf der Faser durch andere koextrahierte, im GC-MS-SIM nicht erfasste Probenbestandteile. Dass ohne Haarextrakt etwas niedrigere Extraktionsausbeuten gefunden werden als bei Verwendung von 5 oder 10 mg Haar, liegt wahrscheinlich an Adsorptionseffekten an der Glasoberfläche des Headspace-Gefäßes oder am schnelleren Verdampfen der FSEE im Stickstoffstrom bei Abwesenheit schwerflüchtiger Haarlipide, in die sie sonst nach Verdampfen des n-Heptans eingebettet sind. Für die routinemäßige Analyse von Haarproben auf FSEE wurden 30-50 mg Haar eingesetzt, da so eine akzeptable Extraktionsausbeute auf der einen Seite und eine ausreichend große Menge Analyt auf der anderen Seite zu einem guten Signal-Rausch-Verhältnis führen.

	Abb. 17: Absolute Extraktionsausbeuten bei der HS-SPME-Extraktion von FSEE aus Haarextrakten bei Variation der Haareinwaage.

Bei der Methodenentwicklung wurden zunächst nur die vier FSEE Ethylmyristat (C14-Et), Ethylpalmitat (C16-Et), Ethyloleat (C18Δ⁹-Et) und Ethylstearat (C18-Et) analysiert, da die entsprechenden Fettsäuren nach Literaturangaben den größten Anteil an der Gesamtheit der in Haarlipiden anwesenden Fettsäuren ausmachen [144]. Im Verlauf der Arbeit wurden weitere FSEE, darunter verzweigte und mehrfach ungesättigte, in die Analytik einbezogen, um einen Gesamtüberblick über die im Haar gespeicherten FSEE zu erhalten, gegebenenfalls die Spezifität der Methode durch Auswahl bestimmter Ester zu erhöhen und nach typischen Veränderungen in den Konzentrationsverhältnissen der Ester zu suchen, wie sie prinzipiell bei chronisch exzessivem Alkoholkonsum oder bei externer Kontamination auftreten können.

Zum Nachweis der FSEE musste eine leistungsfähige GC-MS-Methode erstellt werden, die es erlaubt, alle zu erfassenden FSEE sowie deren deuterierte D₅-Analoga in einem Analysengang mit ausreichender Empfindlichkeit zu detektieren. Zu diesem Zwecke wurden zunächst die Massenspektren und die Retentionszeiten aller einbezogenen Ethylester bzw. der entsprechenden deuterierten Standards gemessen. Dazu wurde für jeden der zu untersuchenden FSEE je 1 μl einer Lösung von 100 µg/ml in Chloroform direkt ins GC-MS injiziert und im Full Scan-Modus unter Verwendung des in Abschnitt 3.4.4.2 beschriebenen Temperaturprogramms gemessen. Die Retentionszeiten unter diesen Bedingungen und die Molmassen der 72 Verbindungen sind in Tabelle 7 angegeben. Typische Beispiele für Massenspektren gesättigter, ungesättigter und verzweigter FSEE sind in den Abb. 18-20 dargestellt. Die Massenspektren aller untersuchten Verbindungen sind im Anhang (Abschnitt 8) zu finden. Die Spektren der deuterierten FSEE sind dort jeweils neben denen der entsprechenden nicht deuterierten dargestellt. FSEE mit gleicher Kohlenstoffanzahl sind seitenweise zusammengefasst. In allen gemessenen Spektren ist das Signal für das Molekülion klar erkennbar.

Ein durchgängig in allen Spektren auftretendes Fragment ist das McLafferty-Ion, das durch eine Umlagerung unter Abspaltung eines Olefins aus dem Molekülion entsteht (vgl. Gl. (6), m/z = 88 für nicht deuterierte bzw. 93 für deuterierte FSEE). Bei den gesättigten FSEE bildet dieses Ion den Basispeak. Das Ion der Masse 101 (bzw. 106) – ein Produkt der γ-Spaltung (vgl. Gl. (7)) – ist ebenfalls in allen Spektren gut zu sehen.

Tabelle 7: Retentionszeiten R_t unter den in Abschnitt 3.4.4.2 genannten Bedingungen und Molmassen der in dieser Arbeit untersuchten FSEE.

Abgesehen von diesen für alle untersuchten FSEE allgemein gültigen Mechanismen zeigen die gesättigten und die ungesättigten FSEE ein unterschiedliches Fragmentierungsverhalten.

Massenspektren gesättigter FSEE

Als Beispiel ist in Abb. 18 das Massenspektrum von Ethylstearat (C18-Et) dargestellt. Bei den gesättigten FSEE führen neben McLafferty-Umlagerung und γ-Spaltung die unter homolytischer Spaltung einer C-C-Bindung analog zur γ-Spaltung gebildeten Ionen zu den stärksten charakteristischen Massenpeaks. Sie entstehen formal durch Abspaltung von CH₃(CH₂)_k-Einheiten von den Molekülionen (k ≤ n-5, mit n = Anzahl der Kohlenstoffatome der zugrunde liegenden Fettsäure). Die stärksten Peaks dieser Art liefern bei unverzweigten gesättigten FSEE die Ionen [M-43]⁺ und die Ionen mit m/z = 157 (m/z = 162 für D₅-FSEE). Da die Estergruppe noch Bestandteil dieser Fragmente ist, können deuterierter Standard und nicht deuterierter Ester auch anhand dieser Ionenspuren getrennt voneinander ausgewertet werden.

	Abb. 18: Massenspektrum von Ethylstearat (C18-Et) mit Zuordnung der Fragmente. Die Skala für k = 0-13 markiert die durch Abspaltung der entsprechenden Alkylreste vom Molekülion gebildeten Ionen.

Da die Spaltung der C-C-Bindung in Nachbarschaft zu Methylverzweigungen bevorzugt wird, unterscheiden sich die verschiedenen Isomere der gesättigten FSEE (iso/anteiso/unverzweigt) bezüglich der Intensitäten relativ zum Basispeak der Ionen [M-15]⁺, [M-29]⁺, [M-43]⁺ und [M-57]⁺ (vgl. Gl. (8) und (9), Abb. 18 und 19 sowie die Massenspektren im Anhang, s. Abschnitt 8 a, b, c, d, e und h). So ist die Intensität des Ions [M-15]⁺ bei Verzweigungen in Iso-Position größer als die bei Verzweigungen in Anteiso-Position oder bei unverzweigten Estern. Dagegen ist die Intensität von [M-57]⁺ und geringfügig die von [M-29]⁺ bei Estern mit einer Verzweigung in Anteiso-Position größer als die der anderen beiden Isomere. Entsprechend ist das Signal für [M-43]⁺ bei Iso-Verzweigung am größten. Interessant ist, dass auch der Molpeak bei FSEE mit Iso-Verzweigung relativ zum Basispeak größer ist als bei den anderen untersuchten Isomeren.

Massenspektren ungesättigter FSEE

Demgegenüber sind die Massenspektren der ungesättigten FSEE durch die große Fülle von Fragmenten vergleichsweise informationsarm. Als Beispiel ist in Abb. 20 das Massenspektrum des Ölsaureethylesters (C18∆⁹-Et) dargestellt. Charakteristische Ionen dieser Spektren sind neben dem McLafferty-Ion das entsprechende Gegenstück [M-88]⁺ und das

Ion [M-45]⁺, das durch Abspaltung des Ethoxyradikals (vgl. Gl. 10) entsteht ([M-93]⁺ und [M-50]⁺ für die deuterierten Analoga). Im Gegensatz zu den gesättigten Estern unterscheiden sich die Spektren der deuterierten und nicht deuterierten ungesättigten FSEE bis auf die Molekülionen und die Ionen [88]⁺ bzw. [93]⁺ sowie [101]⁺ bzw. [106]⁺ kaum, da bei der Mehrzahl der Ionen, die eine ausreichende Intensität aufweisen, der CH₃-CH₂-O- bzw. der CD₃-CD₂-O-Rest bereits abgespalten ist.

Da sich nach der Ionisierung im Massenspektrometer Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette beliebig umlagern können, sind die Spektren von an unterschiedlicher Position ungesättigten FSEE gleicher Molmasse praktisch nicht zu unterscheiden (vgl. die Massenspektren im Anhang 8 f). Ungesättigte FSEE gleicher Summenformel lassen sich daher

	Abb. 20: Massenspektrum von Ölsäureethylester (C18Δ9-Et).

bezüglich der Lage der Doppelbindung nur identifizieren, wenn sie gaschromatographisch ausreichend sauber voneinander getrennt werden. Die gemessenen Retentionszeiten für C18Δ⁵-Et, C18Δ⁶-Et, C18Δ⁹-Etund C18Δ¹³-Etin Tabelle 7 belegen, dass die verwendete Trennsäule dies grundsätzlich leistet. Lediglich C18Δ⁶-Et und C18Δ⁹-Etliegen von der Retentionszeit her so nahe beisammen, dass eine Trennung nicht möglich ist. Es ist jedoch anzunehmen, dass das Δ⁹-Isomer (Ölsäureethylester) stark überwiegt, da Ölsäure neben Palmitin- und Stearinsäure die dominierende freie Fettsäure im Sebum ist (vgl. Abschnitt 2.2.3). Bei den einfach ungesättigten Ethylestern C20Δ⁵-Et, C20Δ¹¹-Etund C20Δ¹³-Etergibt sich mit der verwendeten Säule für die beiden erstgenannten Ester ebenfalls kein Retentionszeitunterschied. Dieses Problem wurde bis zur Untersuchung der Haarproben zurückgestellt. Im Verlaufe der Messung und Auswertung der Haarproben konnten keine derartigen Ester nachgewiesen werden. Die Trennung von C20Δ⁵-Etund C20Δ¹¹-Etwar daher nicht erforderlich.

Identifizierung verzweigter FSEE

Für die gesättigten Fettsäureethylester mit Methylverzweigungen in Iso- bzw. Anteiso-Position und die unverzweigten FSEE gleicher C-Anzahl konnten zwar im direkten Vergleich charakteristische Unterschiede in den Intensitätsverhältnissen einzelner Ionen festgestellt werden (vgl. Abb. 19), diese ermöglichen jedoch keine eindeutige Identifizierung. Daher müssen zur separaten Detektion und Ermöglichung einer Quantifizierung auch diese FSEE bereits über die Retentionszeiten voneinander unterscheidbar sein. Die Retentionszeiten der verzweigten sind deutlich kleiner als die der unverzweigten FSEE gleicher Kohlenstoffanzahl (Δt > 0,1 min) und die Retentionszeiten von iso-verzweigten Estern sind um 0,03 bis 0,04 min kleiner als die von Estern mit Verzweigung in Anteiso-Position.

Chromatographische Trennung aller untersuchten FSEE

Die zu untersuchenden FSEE sollten sich somit abgesehen von den angegebenen, für die Praxis irrelevanten Ausnahmen gut trennen und auswerten lassen. Ein Totalionenchromatogramm einer Testlösung mit 32 Ethylestern konnte diese Annahme bestätigen (Abb. 21). Durch Betrachtung geeigneter charakteristischer Molekülfragmente können auch die im GC nicht ausreichend getrennten FSEE klar unterschieden werden. Für FSEE

	Abb. 21: Totalionenchromatogramm bei Analyse einer Mischung aus Standardlösungen von 32 Fettsäureethylestern (C14-Et, C16-Et, C18Δ9-Et und C18-Et wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht mit aufgenommen). Injektionsvolumen 1 µl, Konzentration je 31,25 µg/ml.

mit 18+2 C-Atomen ist dies in Abb. 22 exemplarisch dargestellt – der Übersichtlichkeit halber sind nur die Massenspuren der Molekülionen [M]⁺ abgebildet. Durch Wechselwirkungen der Ester untereinander sind hier die Retentionszeiten im Vergleich zu den Einzelmessungen teilweise um bis zu 2 s verschoben (vgl. Werte für R_t in Tabelle 7). Die Identifizierung der FSEE wurde dadurch nicht beeinträchtigt, da die deuterierten Standards eine ähnliche Verschiebung zeigten und die Retentionszeitdifferenzen zwischen FSEE und D₅-FSEE nicht mehr als 0,5 s von den bei den Einzelmessungen festgestellten Differenzen

	Abb. 22: Charakteristische Massenspuren der im Totalionenchromatogramm (TIC) nicht sauber getrennten FSEE mit 18 + 2 C-Atomen (die Ionenspuren wurden aus dem Datenfile, das in Abb. 21 als TIC dargestellt ist, extrahiert).

abwichen. Auf Grundlage der in den Einzelmessungen und der Testlösung (Abb. 21) ermittelten Retentionszeiten wurden für die einzelnen FSEE SIM-Fenster definiert. Da sich die Retentionszeiten von FSEE gleicher C-Anzahl nur geringfügig unterschieden, wurden alle FSEE mit gleicher Kohlenstoffanzahl jeweils in einem SIM-Fenster zusammengefasst. Für einige FSEE wurde nur die Molmassenspur aufgenommen und auf das Mitführen von Bestätigungsmassen bewusst verzichtet, da bis zu 8 FSEE in einem Zeitfenster zu messen waren und die Nachweisempfindlichkeit sonst zu stark herabgesetzt worden wäre. Bei Fettsäureethylestern, die nach den ersten Haaruntersuchungen als mögliche Alkoholmarker infrage kamen, wurde mindestens eine weitere substanzcharakteristische Bestätigungsmasse mit möglichst hoher Intensität hinzugefügt.

Die Identifizierung der FSEE erfolgte somit durch Prüfung auf den Molpeak und mindestens eine weitere charakteristische Masse zur richtigen Retentionszeit (in Abb. 23: m/z = 298 und 157) und durch die Prüfung der Retentionszeitdifferenz zwischen FSEE und entsprechendem deuteriertem Standard (in Abb. 23: m/z = 303 und 162), der je nach FSEE zwischen 0,01 und 0,03 min bei kürzerer Retentionszeit der D₅-FSEE liegen muss.

13 Alkoholikerhaarproben wurden mit der oben beschriebenen Methode auf alle genannten Ester überprüft. Das in sieben Zeitfenstern (vgl. Tabelle 4) mit unterschiedlichen SIM-Massen aufgenommene Chromatogramm ist für eine solche Probe in Abb. 24 wiedergegeben. Der Übersichtlichkeit halber sind nur die Molekülionen-Massen der nicht deuterierten Verbindungen in die Darstellung einbezogen. Bei den Estern der C₁₈-Carbonsäuren

	Abb. 23: GC-MS-SIM-Chromatogramm für C17-Et (Ethylheptadecanoat, Rt = 9,95 min) und D5 - C17-Et (D5-Ethylheptadecanoat, Rt = 9,93 min). Es sind jeweils die Massenspuren für das Molekülion (m/z = 298 u. 303) und die Bestätigungsmassen (m/z = 157 u. 162) dargestellt.

	Abb. 24: SIM-Chromatogramm der Haarprobe SN 529/01 (50 Jahre alt gewordener, männlicher Alkoholiker, postmortale BAK 3,2 mg/g). Es wurden die Ethylester folgender Carbonsäuren identifiziert: iC14 = 12-Methyltridecansäure 0,73 ng/mg, C14 = Myristinsäure 2,58 ng/mg, iC15 = 13-Methylmyristinsäure 0,14 ng/mg, aC15 = 12-Methylmyristinsäure 0,63 ng/mg, C15 = Pentadecansäure 1,32 ng/mg, iC16 = 14-Methylpentadecansäure 0,60 ng/mg, C16 = Palmitinsäure 3,82 ng/mg, iC17 = 15-Methylpalmitinsäure 0,02 ng/mg, aC17 = 14-Methylpalmitinsäure 0,20 ng/mg, C17 = Heptadecansäure 0,41 ng/mg, C18Δ9,12 = Linolsäure 0,79 ng/mg, C18Δ6 = cis-6-Octadecensäure + C18Δ9 = Ölsäure 7,85 ng/mg, C18 = Stearinsäure 1,55 ng/mg, C19 = Nonadecansäure positiv, C20 = Arachinsäure 0,12 ng/mg.

wurden unter Einbeziehung der einfach und doppelt ungesättigten Verbindungen drei Ionenspuren aufgezeichnet (m/z = 312, 310 und 308), die in diesem Zeitfenster oberhalb nochmals separat abgebildet sind. Man erkennt, dass die Ester gleicher Molasse sehr gut voneinander getrennt sind. Lediglich die beiden isomeren, einfach ungesättigten C18-Ester führen wie erwartet zu einem gemeinsamen Signal.

Bei der quantitativen Auswertung der 13 Alkoholikerhaarproben wurden für die vier Ester Ethylmyristat (C14-Et), Ethylpalmitat (C16-Et), Ethyloleat (C18Δ⁹-Et) und Ethylstearat (C18-Et) die höchsten Haarkonzentrationen ermittelt, während die Ester C15-Et, aC15-Et, C17-Et und aC17-Et durchweg etwas geringere Konzentrationen aufwiesen und die Ester mit Verzweigung in Iso-Position sowie der doppelt ungesättigte Ester C18Δ^9,12, C19-Et und C20-Et meist nur im Bereich der Nachweisgrenze gefunden wurden. Für die n-Heptan-Waschflüssigkeiten, die ebenfalls untersucht wurden, ergaben sich ähnliche Konzentrationsverteilungen. Die weiteren Untersuchungen wurden daher auf die vier genannten in der höchsten Konzentration vorkommenden Ester beschränkt, um einerseits den Aufwand bei der Datenauswertung im Rahmen zu halten, andererseits aber die Möglichkeit zu erhalten, Aussagen bezüglich der Konzentrationsverhältnisse der verschiedener Ester zueinander machen zu können (vgl. Tabelle 14).

Die Strukturformel des Squalens ist in Abb. 25 dargestellt. In bisherigen Untersuchungen, die in erster Linie aus Sebum vorgenommen wurden, kamen verschiedene analytische Methoden zur Bestimmung des Squalengehalts zum Einsatz. Neben der Dünnschichtchromatographie [196-200] wurde Gaschromatographie [201] und GC-MS [202,203], aber auch HPLC mit UV-Detektion [201,204] eingesetzt. Systematische Untersuchungen von Squalen im Haar wurden in der Literatur bisher nicht beschrieben.

Zunächst wurde die Bestimmung mittels HS-SPME/GC-MS in einem Analysengang mit

	Abb. 25: Strukturformel des Squalens.

	Abb. 26: Massenspektrum des Squalens (a) und ein typisches bei Analyse eines Haarextraktes erhaltenes Chromatogramm unter Verwendung von 5β-Androstan-3,17-dion als innerem Standard (b). Die Squalenkonzentration im Haar betrug 0,53 µg/mg.

den FSEE angestrebt. Da die Squalenkonzentration c_SQ im Haar um Größenordnungen über der c_i-FSEE liegt, war dies wegen Sättigungseffekten, die an der Faser auftraten und eine verlässliche Quantifizierung unmöglich machten, nicht durchführbar. Als zweite Möglichkeit wurde ein Aliquot des Haarextraktes mit innerem Standard versetzt, direkt in das GC-MS eingespritzt und im SIM-Modus gemessen. Zunächst durchgeführte Versuche mit Squalan, dem Dodecahydroprodukt des Squalens als innerem Standard ergaben keine zufrieden stellende Reproduzierbarkeit. Bei Verwendung von 5β-Androstan-3,17-dion, das für die GC-MS-Analyse schließlich als innerer Standard gewählt wurde, trat dieses Problem dagegen nicht auf. Zur Kalibration wurden Mengen zwischen 100 ng und 3,5 µg Squalen und 100 ng innerer Standard in 30 µl Ethylacetat gelöst und 1 µl in das GC-MS eingespritzt. Es ergab sich eine lineare Kalibrationsfunktion (R² = 0,9992) mit y-Achsen-

	Abb. 27: Mögliche Konformation des Squalenmoleküls.

abschnitt 0. In Abb. 26 sind das Massenspektrum des Squalens und ein typisches Chromatogramm eines Haarextraktes abgebildet.

Schließlich wurde eine HPLC-DAD-Methode zur Bestimmung des Squalens entwickelt. Obwohl man bei den vorliegenden isolierten C-C-Doppelbindungen die langwelligste Absorptionsbande im Bereich um 185 nm erwarten würde, zeigt Squalen eine ausgeprägte UV-Absorption zwischen 190 und 220 nm. Diese bathochrome Verschiebung beruht vermutlich auf der Wechselwirkung von π-Elektronen benachbarter Doppelbindungen bei Faltung des Moleküls in eine Konformation, wie sie in Abb. 27 dargestellt ist und der dadurch bedingten Erniedrigung der Energiedifferenz zwischen π- und π^*- Orbital. Die Chromatogramme für eine nur Squalen enthaltende Testlösung und einen Haarextrakt sind in Abb. 28 zusammen mit dem UV-Spektrum des Squalens abgebildet. Aufgrund der hohen Lipophilie des Squalens wird auf der RP8-Säule eine relativ lange Retentionszeit erreicht, die zu einer effektiven Abtrennung anderer UV-absorbierender im Extrakt enthaltener Substanzen führte. Die GC-MS-Methode und die HPLC-DAD-Methode lieferten bei Untersuchung gleicher Extrakte gut übereinstimmende Ergebnisse. Die HPLC-Methode zeichnete sich durch eine einfache Probenvorbereitung, eine kurze Analysendauer (15 min pro Analyse) und durch eine gute Robustheit aus, die bei der GC-MS-Methode nicht gegeben war und eine tägliche Kalibration notwendig machte. Daher wurde für die weiteren Untersuchungen die HPLC-DAD-Methode gewählt. Um sicherzustellen, dass unter den Extraktionsbedingungen, die für die FSEE-Bestimmung optimiert wurden (vgl. Abschnitt 4.1.2), auch das Squalen vollständig extrahiert wird, wurden jeweils 30 mg einer Alkoholikerhaarprobe wie in Abschnitt 3.4.1 beschrieben mit dem zweiphasigen Extraktionsmittel geschüttelt, wobei die Schütteldauer zwischen 2 und 34 Stunden variiert und sowohl auf FSEE als auch auf Squalen untersucht wurde. Die Ergebnisse sind in Abb. 29 dargestellt. Bei der untersuchten Probe stiegen die extrahierten Mengen innerhalb von ca. 10 h bis zu einem nahezu konstanten Wert an. Die Schwankungen der Werte bei

	Abb. 28: HPLC-DAD-Chromatogramme von Squalen. (a) Injektion einer Squalen-Lösung in Acetonitril (Injektionsvolumen 10 µl, Konzentration 0,1 ng/ml), rechts oben ist das UV-Spektrum des Squalens eingefügt. (b) Haarextrakt, Squalenkonzentration im Haar 0,27 ng/mg.

Extraktionszeiten > 10 h können durch Inhomogenität der untersuchten Probe in Verbindung mit der methodisch bedingten Messungenauigkeit (sowohl für c_i-FSEE als auch für c_SQ zwischen 5 und 10 % Varianz, vgl. Abschnitt 4.1.6) erklärt werden. Es wird deutlich, dass die FSEE und das Squalen mit annähernd gleicher Geschwindigkeit extrahiert werden, wodurch auch bei einer unvollständigen Extraktion der Quotient c_{i FSEE}/c_SQ nahezu konstant bleibt. Die Untersuchung von drei weiteren Proben bestätigte dieses Ergebnis, wobei die Extraktionsgeschwindigkeit sich von Haarprobe zu Haarprobe geringfügig unterschied. In allen vier Fällen war nach ca. 15 h (also der in der Methode festgelegten Extraktionsdauer) kein weiterer Anstieg der extrahierten Mengen mehr feststellbar.

	Abb. 29: FSEE-Summenkonzentrationen (ci-FSEE), Squalenkonzentrationen (cSQ) und relative FSEE-Konzentrationen ci FSEE/cSQ gemessen in der Haarprobe eines Alkoholikers unter Variation der Extraktionsdauer.

Die exakte Kalibration und Validierung der Methode wurde auf die vier Ester Ethylmyristat, Ethylpalmitat, Ethyloleat und Ethylstearat beschränkt. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden im Zusammenhang mit der Kalibration unter Verwendung der Software Valistat ermittelt. Dieses Excel-basierte Programm liefert eine mit der DIN-Norm 32645 konforme Auswertung der Validierungsdaten.

Für die Kalibration wurden 10-mal 30 mg eines Abstinenzlerhaarpools jeweils in ein 4 ml fassendes Glasgefäß mit Schraubgewinde eingewogen. Nach Zugabe von 0,5 ml DMSO und 2 ml n-Heptan wurden 8 Proben auf die in Tabelle 8 angegebenen Konzentrationen aufgestockt, indem jeweils 10 µl einer die vier Ester in geeigneter Konzentration enthaltenden Lösung (in CHCl₃) zugegeben wurden. Die Verteilung von 1 : 4 : 4 : 1 für C14-Et : C16-Et : C18-Et : C18Δ⁹-Et wurde entsprechend der nach Voruntersuchungen zu erwartenden Verteilung der Ester in den Haarextrakten gewählt. Die ersten 5 Kalibratoren (K1 bis K5), die auch zur Berechnung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen herangezogen wurden, lagen äquidistant auf den für die Summenkonzentration relevanten Konzentrationsintervall zwischen 0 und 2 ng/mg verteilt, drei weitere Kalibratoren (L1 bis L3) wurden hinzugefügt, um die Kalibrierfunktion auch für sehr hohe Konzentrationssummen bis 16 ng/mg auf Linearität zu prüfen. Danach wurden 10 µl D₅-Fettsäureethylester- Standardmischung (je 2 µg/ml) zugegeben und nach dem in Abschnitt 3.4 beschriebenen Verfahren die FSEE-Konzentrationen bestimmt. Zu den Leerwertproben wurden jeweils 10 µl reines CHCl₃ gegeben, um gleiche Volumen- und Lösungsmittelverhältnisse herzustellen. Insgesamt wurden sechs Kalibrationen an sechs verschiedenen Tagen durchgeführt. Die ermittelten geringen FSEE-Konzentrationen des Abstinenzlerhaarpools (Mittelwerte: C14-Et 0,03 ng/mg, C16-Et 0,05 ng/mg, C18Δ⁹-Et 0,28 ng/mg und C18-Et 0,01ng/mg) wurden jeweils von den direkt aus den Flächenverhältnissen errechneten Konzentrationen der Kalibratoren abgezogen. Es wurde das Flächenverhältnis der Molekülionenpeaks FSEE/D₅-FSEE als Funktion der Konzentration bewertet. Die statistische Auswertung der Daten mit Valistat ergab Linearität (Mandel F-Test auf Linearität) über den gesamten Kalibrationsbereich zwischen 0 und 16 ng/mg bei Nachweisgrenzen zwischen 0,006 und 0,035 ng/mg und Bestimmungsgrenzen zwischen 0,020 und 0,112 ng/mg für die vier FSEE. Die einzelnen Werte sind in Tabelle 9 aufgelistet. Die relativ hohe Nachweisgrenze für C18Δ⁹-Et ist auf die geringere Signalintensität des Molekülionenpeaks infolge stärkerer Fragmentierung zurückzuführen. Der Grubbs-Test auf Ausreißer fiel für alle FSEE negativ aus. Der F-Test ergab für alle vier Ester homogene Varianzen. Die Steigungen der linearen Kalibrierfunktionen lagen zwischen 0,91 und 0,96, wobei ein Anstieg mit länger

Tabelle 8: Resultierende FSEE-Konzentrationen der aufgestockten Haarproben bei Zugabe von jeweils 10 µl Kalibratorlösung zu 30 mg Haarpool unter Abzug der Leerwerte.

Tabelle 9: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der HS-SPME/GC-MS-Methode zur Bestimmung von FSEE im Haar nach DIN 32645 sowie Steigung der Kalibrationsgeraden und lineare Regressionskoeffizienten, die aus den Kalibrationsdaten mit Hilfe des Programms Valistat berechnet wurden. LOD: Nachweisgrenze (limit of detection), LOQ: Bestimmungsgrenze (limit of quantification), R²: linearer Regressionskoeffizient, a: Geradensteigung der Kalibrationsgeraden.

werdender Kohlenstoffkette zu verzeichnen war. Bei Direkteinspritzung der Kalibratoren nach Zusatz von deuterierten inneren Standards wurde hingegen eine Steigung von 1,0 erhalten. Dies deutet darauf hin, dass bei der SPME die deuterierten FSEE eine etwas höhere Affinität zur unpolaren SPME-Faser besitzen als die nicht deuterierten. Dieser Effekt ist bei den kurzkettigeren FSEE aufgrund des höheren relativen Deuterierungsgrades stärker ausgeprägt.

Die Reproduzierbarkeit der Methode wurde überprüft, indem ein gut durchmischter Alkoholikerhaarpool 10-mal innerhalb von 2 Tagen gemessen wurde. Dabei ergaben sich relative Standardabweichungen von 15,7 % (Mittelwert 0,09 ng/mg) für Ethylmyristat, 6,6 % (Mittelwert 0,54 ng/mg) für Ethylpalmitat, 5,9 % (Mittelwert 0,58 ng/mg) für Ethyloleat und 3,5 % (Mittelwert 0,15 ng/mg) für Ethylstearat. Die relativ hohe Standardabweichung für Ethylmyristat resultiert aus der niedrigen Konzentration und störenden Matrixbestandteilen im Retentionsbereich dieser Substanz, wirkt sich aber aufgrund des relativ geringen Gesamtanteils von C14-Et an der Konzentrationssumme von ca. 5-10 % nur schwach auf das Ergebnis aus.

Auf eine Validierung mit Valistat wurde hier verzichtet, da ein „Leer-Sebum“ nicht erhältlich ist (natürliches Sebum enthält immer einen Anteil von ca. 10 % Squalen) und eine vollständige Validierung aufgrund der über den gesamten Untersuchungszeitraum beobachteten guten Flächenkonstanz nicht als notwendig erachtet wurde. Für die Kalibration wurden zehn verschiedene Kalibratoren (zwischen 0,01 und 4 µg Squalen in 10 µl Acetonitril) hergestellt und in die HPLC injiziert. Es ergab sich ein linearer Zusammenhang zwischen der Squalenkonzentration und der Peakfläche bei 208 nm (R² = 0,9999). Die Nachweis- und die Bestimmungsgrenze wurden aus dem drei- bzw. zehnfachen Rauschen der Grundlinie im Retentionsbereich des Squalens abgeschätzt und lagen mit 0,003 bzw. 0,01 µg/mg Haar weit unter den zu erwartenden Konzentrationen (die Squalenkonzentrationen von 52 untersuchten Haarproben von Abstinenzlern und Normaltrinkern lagen zwischen 0,10 und 1,97 µg/mg, der Median betrug 0,56 µg/mg). Zur Methodenkontrolle wurden bei jeder Serie mindestens drei Mal 10 µl einer Squalen-Lösung (100 µg/ml in Acetonitril) injiziert. Die statistische Auswertung der auf diese Weise erhaltenen Peakflächen bewies die gute Reproduzierbarkeit der Methode (Standardabweichung von 1,2 %, n = 57) auch ohne Zusatz eines inneren Standards. Um die Reproduzierbarkeit der Methode unter Einbeziehung der Haarextraktion zu überprüfen, wurden 35 Haarproben wie in Abschnitt 3.4.5 beschrieben in Dreifachbestimmung bei separater Extraktion untersucht. Die durchschnittliche Standardabweichung für die drei Werte lag mit 6,38 % in einem akzeptablen Bereich. Die relativ zur Messung der reinen Squalen-Lösungen erhöhte Standardabweichung kann durch die inhomogene Verteilung des Analyten in der Gesamthaarprobe erklärt werden.

Bei der Anwendung von Pflastern oder Wischtests zur Sebumgewinnung werden ähnliche Lipidmengen annähernd gleicher Zusammensetzung erhalten wie bei der Haarextraktion, daher besitzen die Betrachtungen bezüglich der Kalibration und der Reproduzierbarkeit der Methode auch bei der Analytik für diese Formen der Probennahme Gültigkeit.

In Abschnitt 2.2.4 wurde bereits auf die prinzipiell möglichen Wege der Substanzeinlagerung in das Haar eingegangen. Als Ort für die Speicherung extrem lipophiler Substanzen wie der FSEE kommt nur der Lipidanteil der Haare infrage. Lipide kommen im bzw. am Haar als äußere Sebumschicht und in Form von Strukturlipiden vor [144,145]. Die Strukturlipide bestehen in erster Linie aus dem an Lipiden reichen Zellmembrankomplex und aus über Thioestergruppen kovalent gebundenen Fettsäuren [205,206]. Außerdem findet man im Haar „freie Lipide“, die sich zwar im Inneren des Haares befinden, aber nur durch intermolekulare Wechselwirkungen gebunden sind. Die beim Extrahieren des Haars erhaltenen Lipide bestehen hauptsächlich aus eingelagertem Sebum und

	Abb. 30: Mögliche Einlagerungswege für FSEE in das Haar.

internen freien Lipiden. Bei Extraktion mit sehr unpolaren Lösungsmitteln können auch Teile der Strukturlipide des Zellmembrankomplexes herausgelöst werden. Insgesamt ergibt sich ein Lipidanteil der Haare von ca. 1-9 Gew.-% [144]. Die Zusammensetzung dieser Lipide entspricht ungefähr der des Sebums. Es ist anzunehmen, dass Sebumbestandteile und im Sebum gelöste Stoffe durch Diffusion mit dem Konzentrationsgefälle ins Innere des Haares gelangen und dort gespeichert werden können. Im Wesentlichen kommen daher für die FSEE die drei in Abb. 30 dargestellten Einlagerungswege infrage:

(i) Die FSEE werden in den Talgdrüsen, die in die Haarkanäle münden, aus Ethanol gebildet und erst nachträglich aus dem Sebum in das fertige Haar eingelagert.

(ii) Sie werden in den Basalzellen der Haarwurzel durch Veresterung mit Ethanol gebildet, das über den Blutkreislauf auch in diese Zellen gelangt. Die vielfältige synthetische Aktivität dieser Zellen bietet hierfür gute Voraussetzungen. Auch die Diffusion von FSEE aus angrenzendem Hautgewebe in die Basalzellen ist möglich.

(iii) Sie können, wie es auch für viele Drogen angenommen wird, als fertige Moleküle über den Blutkreislauf in die Haarwurzel gelangen und in den sich rasch teilenden und schließlich keratinisierenden Zellen eingeschlossen werden.

Eine Einlagerung aus dem Schweiß ist für diese lipophilen Verbindungen unwahrscheinlich. Auf die Problematik der Kontamination durch haarkosmetische Produkte, die Ethanol oder FSEE enthalten können, wird in Abschnitt 4.3.2 gesondert eingegangen.

Bereits in Abschnitt 4.1.4 wurde gezeigt, dass in den Haarextrakten auch ungeradzahlige und in Iso- bzw. Anteiso-Position verzweigte Ester, die typisch für Sebum sind, nachgewiesen werden können und in den n-Heptan-Waschflüssigkeiten ähnliche Konzentrationsverhältnisse der Ester zueinander wie in den Haarextrakten gefunden werden. Um die hieraus gefolgerte Annahme, dass der Weg über das Sebum (Mechanismus (i)) am stärksten an der Einlagerung der FSEE beteiligt ist, zu überprüfen, wurden Untersuchungen durchgeführt, die in den folgenden Kapiteln beschrieben werden.

Eine größere Zahl an Haarproben wurde in mehreren Abschnitten untersucht. Die einbezogenen Probanden wurden in vier Gruppen eingeteilt. Gruppe A bestand aus 19 Alkoholikern, die sich einer freiwilligen stationären Entziehungsbehandlung unterzogen hatten, Gruppe B aus 10 Todesfällen mit bekanntem und durch Obduktionsergebnisse bestätigtem chronisch erhöhtem Alkoholkonsum zu Lebzeiten, Gruppe C aus 13 Normaltrinkern mit einer per Fragebogen erfassten Trinkmenge von bis zu 20 g Ethanol/Tag und Gruppe D aus 5 Abstinenzlern. Die Haarproben wurden je nach Länge und Gewicht in 2 bis 12 Segmente aufgeteilt. Drei Proben wurden in gesamter Länge untersucht, da nicht genügend Material für eine Segmentierung zur Verfügung stand. Da in der Haaranalytik die Sicherheit der zeitlichen Zuordnung eines Segments generell mit zunehmendem Abstand von der Haut abnimmt, wurden die Segmente im Verlauf von proximal nach distal länger werdend gewählt. Die Segmentlängen betrugen im kopfnahen Bereich ca. 1-2,5 cm und bei langem Haar im distalen Bereich bis zu 12 cm. Jedes Segment wurde vor der Extraktion zunächst mit 2 x 1 ml n-Heptan gewaschen und sowohl die Waschflüssigkeiten als auch die n-Heptan/DMSO-Extrakte auf FSEE untersucht (vgl. Abschnitt 3.4.1). Dabei wurden nur die vier in der höchsten Konzentration vorkommenden FSEE C14-Et, C16-Et, C18Δ⁹-Et und C18-Et erfasst. Mit e-FSEE (externe FSEE) werden im Folgenden die FSEE auf der Haaroberfläche bezeichnet, die beim Waschen mit n-Heptan abgelöst wurden, i-FSEE (interne FSEE) steht für die bei der anschließenden Extraktion mit dem zweiphasigen n-Heptan/DMSO-Gemisch extrahierten FSEE. Die Konzentrationsangaben beziehen sich auch für die Lipide aus der Waschflüssigkeit immer auf das Gewicht der Haarprobe. In den Tabellen 10 bis 13 ist ein Teil der auf diese Weise erhaltenen Daten für die Gruppen A bis D dargestellt. Die Tabellenspalte ganz rechts zeigt den Verlauf der FSEE-Summenkonzentrationen in Form kleiner Graphiken (x-Achse: Abstand von der Kopfhaut; y-Achse: c_FSEE), die unterschiedlichen Segmentlängen blieben dabei unberücksichtigt. Neben Daten zum Trinkverhalten (falls vorhanden) und der Haarlänge sind auch die c_i-FSEE und c_e-FSEE für den kopfnahen Abschnitt von 6 cm Länge angegeben, die aus den gemessenen Segmentkonzentrationen berechnet wurden. Für Haar, das kürzer als 6 cm war, wurde der Mittelwert über die Gesamtlänge eingesetzt.

Bei Vergleich des von den Probanden berichteten Trinkverhaltens mit den bei der segmentweisen Untersuchung erhaltenen FSEE-Konzentrationen ließ sich keine zeitliche Überein-stimmung in den zugehörigen Haarsegmenten feststellen. Dies soll an zwei Beispielen verdeutlicht werden. In Abb. 31 sind die c_i-FSEE und c_e-FSEE der 31 cm langen Haarprobe eines Alkoholikers (Fall-Nr. HV01) dargestellt, der über einen längeren Zeitraum 200-300 g Ethanol pro Tag konsumiert hatte und 8 Tage vor Probennahme den Alkoholkonsum vollständig einstellte. Im Verlauf der ersten 12 cm ist ein starker Anstieg der c_i-FSEE zu beobachten, obwohl in den letzten Monaten das Trinkverhalten nahezu konstant war. Danach fallen die Werte langsam ab. Für die e-FSEE liegt das Konzentrationsmaximum weiter distal. Dieser Verlauf wurde qualitativ bei allen Probanden der Gruppe A, die ihr Trinkverhalten über einen längeren Zeitraum nicht geändert hatten, gefunden. Bemerkenswert ist, dass auch in Haarproben von Patienten aus Gruppe A, die nach einer längeren

	Abb. 31: Konzentrationsprofile im Haar zweier Alkoholentzugspatienten (HV01 und HV05) für aus dem Haar extrahierte FSEE (i-FSEE) und aus den n-Heptan-Waschlösungen erhaltene FSEE (e-FSEE).

Abstinenzphase kurze Zeit vor der Probennahme einen 2- bis 5-wöchigen Rückfall hatten, ähnliche Konzentrationsverläufe gefunden wurden. Abb. 31 rechts zeigt einen solchen Fall (HV05), der nach 14 Monaten Abstinenz für zwei Wochen eine tägliche Alkoholmenge von 400 g konsumiert hatte. Zwischen erneutem Abstinenzbeginn und Probennahme lagen 3 Tage. Auch bei den Todesfällen (Gruppe B) und den Gruppen C und D (Normaltrinker und Abstinenzler) zeigte sich für die Mehrzahl der Fälle ein solches Konzentrationsprofil. Dieser in den meisten Fällen zu beobachtende deutliche Anstieg der Konzentrationen von kopfnahen zu weiter von der Kopfhaut entfernten Segmenten sowohl für die i-FSEE als auch für die e-FSEE deutet auf eine Akkumulation der FSEE mit zunehmendem Alter des Haares, d. h. Abstand von der Haarwurzel, durch fortgesetzten Eintrag aus dem Sebum hin. Für die wenigen Fälle, bei denen für c_i-FSEE der typische Anstieg von proximal nach distal nicht gefunden wurde (z. B. SH04 und SH09 aus Tabelle 12), kann eine fehlende Konstanz im Trinkverhalten als Erklärung herangezogen werden. Bei einigen Fällen wichen die Profile für die c_e-FSEE von denen der c_i-FSEE ab. Dies kann mit Unterschieden in der Häufigkeit und Art der Haarwäsche zusammenhängen. Die völlig fehlende Korrelation der Segmentkonzentrationen mit dem Trinkverhalten in der entsprechenden Zeit ist ebenfalls als starker Hinweis darauf zu werten, dass die Einlagerung auf diesem Wege stattfindet.

In Tabelle 14 sind die Ergebnisse für die vier Gruppen von Probanden zusammengefasst. Die c_i-FSEE liegen für die Alkoholiker (Gruppe A und B) mit Ausnahme der Proben HV07 und HV08 um 1 ng/mg oder höher und somit in einem typischen Bereich für exzessiven Alkoholkonsum (vgl. Abschnitt 4.3.1). Während bei HV08 der niedrige Wert durch die 2-monatige Abstinenz vor der Probennahme erklärt werden kann, fehlt eine solche Erklärung für HV07. Möglicherweise lag hier eine Stoffwechselstörung vor, die mit verminderter Sebumsekretion einhergeht. Es fällt auf, dass der Mittelwert der c_i-FSEE in Gruppe B mit 6,8 ng/mg deutlich über dem von Gruppe A (3,6 ng/mg) liegt. Gleichzeitig übersteigt der Mittelwert der c_e-FSEE von Gruppe B (27,7 ng/mg) den entsprechenden Wert von Gruppe A (3,9 ng/mg) um ein Vielfaches. Die vergleichsweise hohen c_e-FSEE bei Gruppe B können darauf zurückgeführt werden, dass es sich bei den Todesfällen zum Großteil um Personen handelte, die stark verwahrlost waren und keine regelmäßige Haarpflege mehr betrieben. Dies kann unter Annahme des Einlagerungsweges über das Sebum auch die relativ zu Gruppe A erhöhten c_i-FSEE erklären, wobei nicht ausgeschlossen werden kann, dass in Gruppe B zusätzlich auch ein höherer durchschnittlicher Alkoholkonsum stattge-

funden hatte. Die Werte der Gruppen C und D liegen deutlich niedriger als die der Gruppen A und B. Dass in Gruppe C einige Individuen relativ hohe Konzentrationen an e-FSEE aufweisen, kann zumindest für die Fälle HV02, HV05, HV08 und HV09 damit begründet werden, dass wenige Tage vor Probennahme von diesen Probanden im Rahmen von Silvesterfeiern einmalig größere Mengen Alkohol aufgenommen wurden als in den Monaten davor.

In praktisch allen Alkoholikerhaarproben ist Ethyloleat der dominierende FSEE. Ethylpalmitat liefert den zweithöchsten Beitrag, die anderen beiden Ester tragen nur in geringem Maße zur Gesamtkonzentration bei. Generell stellt das Ethyloleat bei den e-FSEE einen deutlich größeren Anteil als bei den i-FSEE. Diese Unterschiede in den Konzentrationsverhältnissen der FSEE untereinander zwischen den äußeren Lipiden und den aus der

Haarmatrix erhaltenen Extrakten weisen darauf hin, dass auch die beiden alternativen Mechanismen (ii) und (iii) einen Beitrag zur Einlagerung leisten. Allerdings ist dieser Beitrag als eher gering einzuschätzen, da der Hauptunterschied in dem in den Haarex-

Tabelle 14: Vergleich der Gesamtkonzentrationen der i-FSEE und der e-FSEE sowie der Konzentrationsverhältnisse der vier Ester, gemessen im Haar von vier Probandengruppen (A: 19 Alkoholiker in Entzugs-behandlung, B: 10 Todesfälle mit Alkoholanamnese, C: 13 Normaltrinker, D: 5 Abstinenzler). Die Angaben beziehen sich auf das kopfnahe Segment (0-6 cm) und wurden aus den Segmentkonzentrationen errechnet.

trakten gegenüber den äußeren Lipiden verringerten Anteil an Ethyloleat bestand, der auch durch die relative Instabilität dieser ungesättigten Verbindung gegenüber oxidativen Einflüssen oder eine schnellere Auswaschung erklärt werden könnte.

Die Wägung der Waschrückstände ergab für die äußerlich am Haar anhaftenden Lipide Gewichte zwischen < 0,1 und 12 % der Haareinwaage. Da die auf das Haargewicht bezogenen FSEE-Konzentrationen in der äußeren Lipidschicht und in der Haarmatrix die gleiche Größenordnung wie die c_i-FSEE aufweisen, folgt, dass die Konzentrationen der e-FSEE bezogen auf das Gewicht der Waschrückstände in den meisten Fällen um ca. zwei Größenordnungen höher liegen. Dies ist als weiterer Hinweis darauf zu werten, dass die Einlagerung der FSEE aus dem Sebum erfolgt, da aufgrund des Konzentrationsgradienten eine Diffusion der FSEE von der Haaroberfläche entlang des Zellmembrankomplexes in die Haarstruktur stattfinden kann.

Squalen ist in den extrahierbaren Haarlipiden des die ersten 6 cm umfassenden Segments im Mittel zu einer Konzentration von ca. 0,6 µg/mg Haar enthalten (die gemessenen Werte lagen zwischen 0,1 und 2,97 µg/mg, vgl. Abschnitt 4.4). Bei segmentweiser Untersuchung von Haarproben zeigen die Konzentrationen in den Haarextrakten für Squalen einen qualitativ ähnlicher Verlauf wie die c_i-FSEE, wobei die Konzentrationsmaxima für längere Haarproben meist zu kopfnäheren Segmenten hin verschoben sind (vgl. Abb. 40 in Abschnitt 4.4). Es kann angenommen werden, dass Squalen nicht oder nur zu einem sehr geringen Teil bereits in der Haarwurzel in das Haar eingelagert wird, da sonst kein genereller Anstieg von proximal nach distal festzustellen sein dürfte, wie er in der Regel gefunden wurde. Bei einem Squalengehalt des Sebums von 10-20 % bedeutet dies, dass Haar im Mittel ca. 0,4 % (zwischen 0,1 und 1,5 %) seines Eigengewichts an Sebum aufnimmt. Die im Vergleich zum Sebum um ca. zwei Größenordnungen niedriger liegenden FSEE-Konzentrationen im Haar lassen sich somit unter Annahme der Einlagerung aus dem Sebum zwanglos erklären, was als eine weitere Bestätigung für diesen Einlagerungsweg zu sehen ist.

Zur Untersuchung von Hautoberflächenlipiden auf FSEE und Squalen wurden mit Hilfe von Pflaster- und Wischtests Versuche durchgeführt, die in Abschnitt 4.7 näher beschrieben werden. Es ergab sich, dass FSEE in den Oberflächenlipiden der Haut, die in erster Linie aus Sebum bestehen, nachweisbar sind. Squalen wurde bei diesen Untersuchungen immer parallel bestimmt, da aufgrund der bei dieser Art der Probennahme stark schwankenden erhaltenen Lipidmengen die Einbeziehung eines weiteren Hautlipidbestandteils als Bezugsgröße unerlässlich war. Die auf Squalen bezogenen relativen FSEE-Konzentrationen (c_i-FSEE/c_SQ) lagen in ähnlichen Konzentrationsbereichen wie die bei Untersuchung der Lipidextrakte aus dem Haar erhaltenen (vgl. Abschnitt 4.4 und 4.7). Auch dieses Ergebnis ist als Hinweis darauf zu werten, dass die Einlagerung der FSEE und des Squalens ins Haar hauptsächlich über das Sebum stattfindet.

Im Folgenden sollen die Untersuchungsergebnisse zu verschiedenen Faktoren, die Einfluss auf die FSEE-Konzentrationen im Haar nehmen können, diskutiert werden. Neben dem Trinkverhalten der Probanden werden sowohl störende Effekte durch haarkosmetische Behandlungen als auch die Abhängigkeit von der Haarart berücksichtigt.

Um zu prüfen, ob ein Zusammenhang zwischen dem Trinkverhalten der Probanden und den FSEE-Konzentrationen im Haar besteht, wurden zunächst Haarproben von 6 Abstinenzlern, 17 Normaltrinkern, 19 Alkoholikern in stationärer Entzugsbehandlung und 22 postmortal entnommene Proben von im Institut für Rechtsmedizin der Charité obduzierten Todesfällen mit aus der Vorgeschichte bekanntem exzessivem Alkoholkonsum untersucht. Die Ergebnisse wurden größtenteils bereits in den Tabellen 10-13 dargestellt. Zusätzlich wurden 5 Probanden, die zuvor wegen Alkohol im Straßenverkehr aufgefallen waren und einer Fahreignungsprüfung unterzogen werden sollten, mit einbezogen. In Abb. 32 sind die Untersuchungsergebnisse graphisch dargestellt. Die Konzentrationsangaben beziehen sich auf das kopfnahe Segment von maximal 6 cm Länge.

Bei Setzen eines Cut-off-Wertes von 1 ng/mg, der in Abb. 32 als gestrichelte Linie eingezeichnet ist, ließ sich für die Summe der Konzentrationen von C14-Et, C16-Et, C18Δ⁹-Et und C18-Et mit wenigen Ausnahmen zwischen der Gruppe mit chronisch exzessivem Alkoholkonsum und Normaltrinkern bzw. Abstinenzlern klar unterscheiden. Die Proben der Abstinenzler ergaben in der Regel Konzentrationen unter 0,4 ng/mg.

In den Fällen mit detaillierten Trinkangaben aus der Gruppe der Normaltrinker konnte unter Einbeziehung der Abstinenzler und weiterer Probanden (insgesamt 56 Personen) allerdings keine Korrelation zwischen den erfassten Trinkmengen (zwischen 0 und 43 g Alkohol pro Tag) und den FSEE-Konzentrationen im Haar festgestellt werden. Dies deutet darauf hin, dass im unteren bis mittleren Konzentrationsbereich Schwankungen durch Unterschiede in Haarbehandlung und/oder Hauttyp etc. relativ stark ins Gewicht fallen.

	Abb. 32: Nach Extraktion des zuvor gewaschenen Haars erhaltene Haarkonzentrationen (ci-FSEE) für Probanden aus verschiedenen Konsumentengruppen. Der Cut-off-Wert für ci-FSEE von 1 ng/mg ist mit Pfeil und gestrichelter Linie markiert. Untersuchte Haarlänge: 6 cm oder kürzer, bei segmentweise unterrsuchten längeren Haarproben wurden die durch gewichtete Mittelwertbildung erhaltenen Werte für den Abschnitt von 0-6 cm von der Kopfhaut dargestellt.

Auch die Haarproben der Kinder-/Abstinenzlergruppe wiesen geringe Konzentrationen an FSEE auf, die allerdings für die Proben von Kleinkindern durchweg unter 0,1 ng/mg lagen. Vermutlich sind diese geringen Konzentrationen auf die Bildung von FSEE aus endogenem Ethanol in den Sebumdrüsen, in denen neben anderen Verbindungen auch Fettalkohole gebildet werden, oder aber auf direkten Eintrag von Ethanol bzw. FSEE ins Haar durch Shampoo oder Haarpflegemittel zurückzuführen. Auch die Bildung endogenen Ethanols im Verdauungstrakt [207,208] mit anschließender Veresterung vorhandener Fettsäuren ist möglich, allerdings erscheint es unwahrscheinlich, dass die auf diesem Wege erreichten Blutalkoholkonzentrationen von maximal 0,035 mg/g (Median 0,0004 mg/g, n = 1557) [209] ausreichend hoch sind. Durch physiologische Reduktion von Acetat könnten schließlich in den Sebumdrüsen geringe Mengen Ethanol entstehen, da dort bei der Lipidsynthese auch Fettsäuren in Fettalkohole umgewandelt werden. Geringe Mengen FSEE konnten von Chan et al. auch in Meconium von Neugeborenen, deren Mütter während der gesamten Schwangerschaft strikt abstinent waren, nachgewiesen werden [210]. Meconiumproben von Kindern, deren Mütter während der Schwangerschaft Alkohol konsumiert hatten, wiesen dagegen deutlich höhere Werte auf [211].

Bei einigen wenigen Fällen führt die Verwendung des Cut-off-Wertes von 1 ng/mg somit zu einer falschen Zuordnung. Auf mögliche Gründe hierfür und Möglichkeiten, solche Fälle im Vorfeld zu erkennen, soll in den folgenden Kapiteln näher eingegangen werden.

Um den Einfluss verschiedener haarkosmetischer Behandlungen auf die FSEE-Konzentrationen im Haar zu untersuchen, wurden mehrere Experimente unter Verwendung handelsüblicher Haarkosmetika durchgeführt. Neben wiederholter Haarwäsche und der Anwendung von Haarwachs bzw. Haarwasser wurden Behandlungen wie Dauerwelle, Tönung, Färbung und Bleichung des Haars durchgeführt und jeweils vor und nach der Behandlung die FSEE-Konzentrationen sowohl im Haarextrakt (i-FSEE) als auch in den n-Heptan-Waschlösungen (e-FSEE) bestimmt.

Die Haarprobe eines Alkoholikers wurde mit einem Tönungsgel (pH 5, Einwirkzeit 20 Minuten) nach Anwendungsvorschrift behandelt. Das Gel enthielt 2-Amino-6-chlor-4-nitrophenol als farbgebenden Bestandteil. Nach Tönung zeigte sich eine um 3,6 % erniedrigte Gesamtkonzentration der vier untersuchten FSEE im Haarextrakt gegenüber einer um 54,6 % geringeren Konzentrationssumme in der Waschlösung (vgl. Abb. 33 a, links oben).

Der Einfluss dieses und ähnlich zusammengesetzter handelsüblicher Tönungsprodukte auf die untersuchten FSEE in der Haarmatrix ist erwartungsgemäß gering, da das Haar vor und während der Behandlung nicht aufquillt und sich die Farbstoffe lediglich in der Cuticula anlagern. Der höhere Verlust von FSEE in der Waschflüssigkeit ist durch die im verwendeten Tönungsgel zur besseren Benetzung der Haare eingesetzten Tenside zu erklären, die den Lipidfilm auf der Haaroberfläche teilweise entfernen.

Bei der Coloration der Haarprobe eines Alkoholikers mit einer Mischung aus einer Tönungscreme und einer Oxidationslösung (pH 11, Einwirkzeit 20 Minuten) zeigten sich ähnlich wie bei der Tönung nur geringe Effekte auf die Konzentrationen der i-FSEE. Im Haarextrakt betrug der Verlust der Konzentrationssumme der vier untersuchten Ester 11,8 % (s. Abb. 33 b, rechts oben). Der entgegen der Erwartung relativ gering ausfallende Verlust an FSEE in der Waschlösung von nur ca. 8 % kann sich aus Inhomogenitäten der verwendeten Haarprobe und/oder der geringen lipidlösenden Wirkung der verwendeten Reagenzien erklären.

Die Haarprobe eines Alkoholikers wurde unter Verwendung einer Haarfarbe mit Oxidationsemulsion (pH 11, Einwirkzeit 45 Minuten) gefärbt. Die Mischung enthielt 2,5-Diaminotoluol und 2-Amino-6-chlor-4-nitrophenol als färbende Bestandteile, Ammoniak sowie 6 % Wasserstoffperoxid. Nach der Färbung fand sich eine um rund 64 % niedrigere Summe der untersuchten FSEE im Haarextrakt gegenüber 97 % Verlust in der Waschflüssigkeit (der Ausgangswert war bei dieser Probe mit ca. 70 ng/mg außergewöhnlich hoch). Dabei veränderte sich in dem Haarextrakt im Gegensatz zu der externen Lipidschicht (Waschflüssigkeit) das Verhältnis der FSEE zueinander nicht (s. Abb. 33 c, links unten). In der Waschflüssigkeit zeigte sich ein höherer Anteil von Ethylpalmitat nach der Färbung, Ethyloleat hatte demgegenüber einen wesentlich geringeren Anteil an der Gesamtkonzentration der untersuchten FSEE als zuvor. Der große Verlust im Haarextrakt erklärt sich durch den Einsatz von Oxidationsfarbstoffen in Verbindung mit Wasserstoffperoxid und

	Abb. 33: FSEE-Konzentrationen der Haarextrakte (i-FSEE) und der Waschflüssigkeiten (e-FSEE) bezogen auf die Haareinwaage vor und nach haarkosmetischer Behandlung. Die Behandlungen wurden mit unterschiedlichen Alkoholikerhaarproben durchgeführt.

Ammoniak, der zu einem Aufweichen der Haarstruktur führt. Im Gegensatz zur Tönung können die Reagenzien so ins Innere des Haars gelangen und dort zu oxidativer Zersetzung bzw. Hydrolyse der FSEE führen. Bei der Färbung werden die an der Haaroberfläche haftenden Lipide nahezu vollständig entfernt, wobei für Ethyloleat der oxidative Angriff an der Doppelbindung zu einer zusätzlichen Verminderung der Konzentration führt.

Die Haarprobe eines Alkoholikers wurde mit einer Suspension aus einem Blondierpulver (Natriumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Magnesiumperoxid, Tenside) und einer 6 %igen Wasserstoffperoxid-Lösung (pH 11, Einwirkzeit 65 Minuten) behandelt.

Im Haarextrakt zeigte sich gegenüber dem Ausgangswert eine um ca. 8 % geringere Gesamtkonzentration der untersuchten FSEE gegenüber fast 86 % Verlust der FSEE in der Waschflüssigkeit (s. Abb. 33 d, rechts unten). Die Konzentrationsverhältnisse der einzelnen FSEE zueinander blieben nahezu unverändert. Der Konzentrationsverlust im Haarextrakt ist wahrscheinlich auf einen Auswascheffekt zurückzuführen, fällt aber vergleichsweise gering aus.

Bemerkenswert ist, dass offenbar das Quellen des Haars bei Anwesenheit oxidierender Substanzen allein nicht ausreicht, interne FSEE in größerem Umfang herauszulösen oder zu zersetzen. Erst bei zusätzlicher Anwesenheit von Farbstoffen oder anderer in Färbungsmitteln enthaltener Chemikalien ist ein stärkerer konzentrationsreduzierender Effekt festzustellen.

Die Haarprobe einer Normaltrinkerin wurde einer Haarwäsche mit anschließender Dauerwellbehandlung unterzogen. Das verwendete Wellmittel enthielt Ammoniumthioglykolat, Ammoniumbicarbonat und Ammoniak (pH 9,5). Nach 25 Minuten Einwirkzeit wurden die Haare gespült und mit einer Fixierlösung (Phosphorsäure, Wasserstoffperoxid und einige nichtreaktive Verbindungen, pH 4, Einwirkzeit 15 Minuten) behandelt.

Die Ergebnisse sind in Abb. 34 graphisch dargestellt. Es fand sich nach der Haarwäsche mit einem handelsüblichen Shampoo eine im Haarextrakt um rund 5 % und in der Waschflüssigkeit eine um rund 81 % verringerte Gesamtkonzentration der vier untersuchten FSEE. Nach der Dauerwellbehandlung war die Gesamtkonzentration um rund 17 % im Haarextrakt und rund 87 % in der Waschflüssigkeit erniedrigt. Während die Konzentra-

	Abb. 34: Vergleich der FSEE-Konzentrationen einer Normaltrinkerprobe im Haarextrakt (i-FSEE) und in den Waschflüssigkeiten (e-FSEE) vor der Behandlung, nach dem Waschen und nach anschließender Dauerwellbehandlung.

tionen der FSEE im Verhältnis zueinander im Haarextrakt nahezu unverändert blieben, zeigte sich für die e-FSEE eine relativ höhere Konzentration von Ethylpalmitat nach der Haarwäsche gegenüber einem verringerten Anteil an Ethyloleat.

Die Dauerwellbehandlung hatte einen etwas stärkeren vermindernden Effekt auf die FSEE-Konzentration im Haar als die vorangestellte Haarwäsche. Die Kombination von Haarwäsche und anschließender Dauerwellbehandlung führte in der Summe zu einem Verlust von ca. 17 % der FSEE im Haar. Die hohen Verluste in der Waschflüssigkeit sind größtenteils bereits durch die Haarwäsche verursacht worden.

In einigen der untersuchten Proben von Freiwilligen fanden sich in den Waschflüssigkeiten trotz geringer Alkoholaufnahme hohe Konzentrationen an FSEE. So wurde bei der Probe SH 41 im Haar eine Konzentrationssumme von 0,2 ng/mg Haar gefunden, in der Waschflüssigkeit derselben Haarprobe fand sich eine Summe von 3,34 ng/mg Haar (vgl. Abb. 35 a, links oben). Der Proband gab einen Alkoholkonsum von 15-17 g/Tag an. Zur Haarpflege wurde im Fragebogen der Gebrauch von Haarwachs der Marke Murray´s^® und

	Abb. 35: FSEE-Konzentrationen im Haar und in der Waschflüssigkeit nach Anwendung von Haarwachs a) bei regelmäßiger Anwendung nach Haarwäsche (2 x wöchentlich). Es wurden zwei Segmente untersucht. b) bei einmaliger Behandlung einer Abstinenzlerhaarprobe mit anschließender Haarwäsche. c) bei einmaliger Behandlung einer Alkoholikerhaarprobe.

Haarwäsche mit einer Frequenz von 2-mal pro Woche angegeben. Aufgrund dieses ungewöhnlichen Befundes wurde das verwendete Haarwachs auf seinen Gehalt an FSEE untersucht. Es ergab sich in dem genannten Haarwachs eine Konzentrationssumme der FSEE von 17,6 ng/mg. Als Quelle für die vergleichsweise hohe Konzentration von FSEE in Haarwachsen dient wahrscheinlich das bei der Herstellung verwendete Lanolin, welches bei der Schafwollproduktion beim Waschen der Wolle in großen Mengen anfällt und breite Verwendung in der Herstellung von Kosmetika und Arzneimitteln findet. Dieses auch als Wollwachs bezeichnete Gemisch besteht aus Estern, Di-Estern und Hydroxyestern von aliphatischen Alkoholen und Fettsäuren sowie verschiedenen Sterolen; ca. 0,5 % der Fettsäuren und ca. 12 % der Alkohole liegen im Lanolin unverestert vor [212].

Ethyloleat und Ethylpalmitat waren mit jeweils ca. 45 % Anteil an der Konzentrationssumme dominierend. Ethylmyristat und Ethylstearat waren lediglich zu 3 % und 6 % beteiligt. Diese Verteilung der vier FSEE entspricht in etwa der durchschnittlichen Verteilung in den untersuchten Haarproben. Läge eine andere Verteilung vor, so hätte ein möglicher Eintrag von FSEE aus dem Wachs ins Haar aufgrund der Verschiebungen in den Konzentrationsverhältnissen erkannt werden können. Bei der gefundenen Verteilung hingegen könnte ein solcher Eintrag zu falsch positiven Ergebnissen führen.

Um zu untersuchen, welche Folgen die Anwendung eines solchen Haarwachses für die FSEE-Konzentrationen im Haar und in den Waschflüssigkeiten hat, wurde daher das Haarwachs nach Anwendungsvorschrift auf die Haarproben einer Abstinenzlerin und eines Alkoholikers aufgetragen. Nach Anwendung des Haarwachses fand sich bei der Abstinenzlerin (vgl. Abb. 35 b, links unten) in der Waschflüssigkeit eine etwa achtfach höhere c_{e FSEE} als zuvor. Nach einer Haarwäsche mit einem handelsüblichen Shampoo am folgenden Tag wurde der größte Teil des Wachses wieder entfernt, die c_e-FSEE war nun noch etwa doppelt so hoch wie vor dem Auftragen des Wachses. Viel interessanter verhielten sich die FSEE-Konzentrationenim Haarextrakt. Hier fand sich nach dem Auftragen des Wachses eine um 21 % geringere Konzentration der vier Ester. Eine anschließende Haarwäsche zeigte keinen wesentlichen Effekt mehr auf die Konzentration im Haarextrakt. Offenbar fand eine Diffusion der FSEE aus dem Haar in das sehr lipophile aufgetragene Wachs statt, da die FSEE-Konzentration im Haar von ca. 0,4 ng/mg bezogen auf einen angenommenen Lipidanteil des Haars von 1 % [144], in dem sie gelöst sind, mit ca. 40 ng/mg größer ist als die FSEE-Konzentration im Haarwachs (17,6 ng/mg). Wie groß dieser Effekt bei einer Alkoholikerhaarprobe ist, wurde in einem weiteren Versuch überprüft (vgl. Abb. 35 c, rechts oben). Neben der erwarteten Zunahme von c_e-FSEE in der Waschflüssigkeit nach Auftragen des Haarwachses und Lagerung der Probe bei Zimmertemperatur über vier Tage zeigte sich im Haarextrakt hier eine noch deutlichere Differenz zum Ausgangsniveau. Der Verlust an i-FSEE nach der Behandlung betrug ca. 57 %.

Es ist danach denkbar, dass ein vormals im Wertebereich des chronisch exzessiven Alkoholkonsums liegender Proband nach der Anwendung von Haarwachs unter die Grenze von 1 ng/mg sinkt, also ein falsch negatives Ergebnis resultiert. Dabei ist aber zu bedenken, dass die Haarprobe im Versuch mit einer Menge Haarwachs, die weit über der bei kosmetischer Verwendung angewandten lag, benetzt wurde und die so behandelte Probe unbewegt gelagert wurde, wodurch kein natürlicher Verlust der aufgetragenen Haarwachsschicht durch Abrieb, Witterungseinflüsse oder Haarwäsche stattfinden konnte. Dennoch muss festgehalten werden, dass Haarwachse trotz ihres relativ hohen Eigengehaltes an FSEE besonders in Kombination mit häufiger Haarwäsche einen extrahierenden Effekt auf die Fettsäureethylester im Haar ausüben können.

Es wurden zwei Versuche mit 40 bzw. 20 Haarwäschen an einer Haarprobe eines Normaltrinkers und eines Alkoholikers unter Verwendung eines handelsüblichen Shampoos (Nivea Hair-Care Glanz Shampoo) durchgeführt. Mit der 15 cm langen und 8 g schweren Haarprobe eines Normaltrinkers wurde täglich eine Haarwäsche durchgeführt (Shampookontakt ca. 30 s) und nach Trocknung bei Raumtemperatur nach jeder 5. Wäsche eine Stichprobe von ca. 70 mg zur Analyse entnommen. Die Bestimmung der FSEE-Konzen-

	Abb. 36: Konzentrationsverlauf für die FSEE-Konzentrationen im Haarextrakt (ci-FSEE) und in der Waschflüssigkeit (ce-FSEE) für 40 Haarwäschen bei einer Normaltrinkerprobe (links) und für 20 Haarwäschen bei einer Alkoholikerhaarprobe (rechts).

trationen erfolgte nach der in Abschnitt 3.4.1 beschriebenen Methode. Abb. 36 zeigt links den Konzentrationsverlauf der FSEE in Haarextrakt und Waschflüssigkeit für 40 aufeinander folgende Haarwäschen für das Normaltrinkerhaar. In Abb. 36 rechts ist der Konzentrationsverlauf der FSEE für eine Alkoholikerhaarprobe im Verlauf von 20 Haarwäschen dargestellt. Für diese Untersuchung wurde mit der 11 cm langen Haarprobe (4,8 g Gesamtgewicht) eines Todesfalls mit bekanntem exzessivem Alkoholkonsum zu Lebzeiten täglich eine Haarwäsche durchgeführt, eine Stichprobe entnommen und diese wie die Normaltrinkerprobe auf FSEE analysiert.

Für die Normaltrinkerprobe schwankten die gemessenen c_i-FSEE um einen Mittelwert von 0,38 ng/mg Haar. Die Schwankungen resultieren vermutlich aus der Inhomogenität dieser großen Haarprobe, in der sich auch teilweise blondierte Strähnen befanden. Zudem waren die FSEE-Konzentrationen insgesamt sowohl in der Waschflüssigkeit als auch im Haarextrakt eher gering. Eine deutliche Beeinflussung der FSEE-Konzentration in diesem für Normaltrinker typischen Bereich zeigte sich nicht. Im zweiten Versuch wurde die Haarprobe eines Alkoholikers mit sehr hoher FSEE-Konzentration verwendet. Hier zeigte sich in den Waschflüssigkeiten eine deutliche Konzentrationsabnahme von 51,2 ng/mg auf 9,38 ng/mg bereits nach zwei Haarwäschen. Die Folgewerte stabilisierten sich zunächst in einem Bereich um 5 ng/mg, um dann nach etwa 13 Haarwäschen stetig bis auf 1,38 ng/mg nach der zwanzigsten Haarwäsche abzunehmen. Die FSEE-Konzentrationen im Haarextrakt dagegen schwankten nur geringfügig um einen Mittelwert von 10,9 ng/mg. Hier zeigte sich keine ausgeprägte Konzentrationsabnahme. Häufiges Waschen der Haare mit handelsüblichem Shampoo hat demnach keinen relevanten Einfluss auf eine bereits erreichte FSEE-Konzentration im Haar. Durch die ständige Entfernung großer Anteile des äußeren Lipidfilms könnte der Fettsäureethylestereintrag über die äußere Lipidschicht in das Haar jedoch gemindert werden, woraus geringere FSEE-Konzentrationen im Haar resultieren würden. Es ist jedoch anzunehmen, dass dies nur bei sehr häufiger Haarwäsche von Bedeutung ist.

Neben der enzymatisch katalysierten Bildung der FSEE aus freien Fettsäuren oder Lipiden und endogenem sowie getrunkenem Ethanol kann eine möglicherweise von Enzymkatalyse unabhängige Bildung von FSEE durch den Kontakt von exogenem Alkohol und Haarlipiden nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden. Produkte wie Haarwässer und Deodorants, aber auch Haarsprays, Haarfestiger oder anderen Haarkosmetika können Ethanol in größerer Menge enthalten, das bei der Applikation zur Bildung von FSEE führen könnte.

In einem ersten Experiment wurde daher die Haarprobe einer Normaltrinkerin für zwei Monate in einer mit Ethanol gesättigten Atmosphäre gelagert. Danach betrug die FSEE-Konzentration im Haarextrakt 16,5 ng/mg gegenüber einem Wert von 0,23 ng/mg vor der Behandlung. Um zu klären, ob bereits die regelmäßige Anwendung ethanolhaltiger Haarkosmetika wie Haarspray, Haarwasser oder Schaumfestiger zu falsch positiven Ergebnissen führen kann, wurden weitere Experimente durchgeführt. Dazu behandelten drei Normaltrinker während eines Zeitraumes von zwei Monaten täglich die gleiche Kopfhautregion mit Birkenhaarwasser (62,5 Vol.-% Ethanol), während die übrige Kopfhaut unbehandelt blieb. Anschließend wurde aus dem behandelten und dem unbehandelten Bereich jeweils eine Haarprobe entnommen. Bei der Untersuchung auf den Gehalt an FSEE zeigte sich bei allen drei Probanden ein deutlicher Unterschied zwischen behandelter und unbehandelter Seite (vgl. Abb. 37). Bei Proband 1 zeigt sich besonders in den kopfnahen Haarabschnitten eine gegenüber dem unbehandelten Haar deutlich höhere c_i-FSEE für die

	Abb. 37: Vergleich der ci-FSEE im Haar vor und nach zweimonatiger Behandlung einer Kopfhälfte mit ethanolhaltigem Haarwasser bei drei Probanden. Die Haarproben der Probanden 1 und 3 wurden segmentweise untersucht

behandelte Kopfseite. Die Abnahme der c_i-FSEE weiter distal lässt sich dadurch erklären, dass das Haarwasser mit den Fingerspitzen in die Kopfhaut einmassiert wurde, somit fand ein direkter Kontakt mit dem Haarwasser hauptsächlich im kopfnahen Bereich statt.

Der tägliche Gebrauch von Deodorant und Haarspray führte bei zwei Probanden zu ungewöhnlich hohen FSEE-Konzentrationen im Haar. Im Fall A (männlich, 23 Jahre alt, durchschnittlicher Alkoholkonsum ca. 4 g Ethanol/Tag), der in Abb. 38 dargestellt ist, benetzte der Proband seine Brustbehaarung täglich mit einem Haarspray. Die c_i-FSEE im 1,5 cm langen Haupthaar betrug 0,14 ng/mg, dagegen wurde in den 2 cm langen Brusthaaren eine c_i-FSEE von 3,5 ng/mg gemessen. Somit lag die c_i-FSEE im Haupthaarextrakt in einem typischen Bereich für Normaltrinker, wohingegen die c_i-FSEE im Brusthaar mit deutlich über 1 ng/mg in einem Bereich lag, der üblicherweise bei chronisch exzessivem Alkoholkonsum gefunden wird. Fall B (männlich, 22 Jahre, abstinent) in Abb. 38 zeigt die Ergebnisse für einen Probanden, der täglich Haarspray benutzte. Im Haarextrakt der 6,5 cm langen Haupthaare wurde eine c_i-FSEE von 2,1 ng/mg gefunden.

Für die untersuchten Fälle, in denen regelmäßig ethanolhaltige Haarkosmetika zur Anwendung kamen, ergaben sich somit für die FSEE als Marker exzessiven Alkoholkonsums falsch positive Werte. Daraus ergibt sich die Empfehlung, bei Ergebnissen, die im Widerspruch zur angegebenen Trinkmenge stehen, zusätzlich Haarproben aus anderen Körperregionen, in denen keine entsprechende Behandlung stattgefunden hat, zu untersuchen (vgl. Abschnitt 4.3.3).

	Abb. 38: Einfluss eines ethanolhaltigen Deodorants (A) bzw. Haarsprays (B) auf die FSEE-Konzentrationen im Haarextrakt zweier Probanden. Fall A: Normaltrinker, Brusthaar mit Deodorant behandelt, Haupthaar unbehandelt. Fall B: Abstinenzler, das untersuchte Kopfhaar wurde regelmäßig mit Haarspray behandelt.

Um auszuschließen, dass in Haarpflegeprodukten enthaltene FSEE bei der Anwendung in das Haar gelangen und so zu falsch positiven Ergebnissen führen, wurden über 50 handelsübliche Shampoos, Haarwachse, Tönungsgels, Haarsprays und weitere Haarkosmetika auf ihren Gehalt an den vier FSEE Ethylmyristat, Ethylpalmitat, Ethyloleat und Ethylstearat untersucht. In allen Produkten konnten zumindest Spuren dieser FSEE nachgewiesen werden (zwischen 0,13 und 29,6 ng/mg), obwohl sie in keinem der Produkte als Inhaltsstoffe deklariert waren. Die Ergebnisse im Einzelnen wurden in einer Publikation, die sich ausschließlich mit dem Einfluss der Haarkosmetik auf die FSEE-Konzentrationen befasst, veröffentlicht [213].

Eine wesentliche Beeinflussung der c_i-FSEE durch die in den Produkten befindlichen FSEE ist bei bestimmungsgemäßer Anwendung für die meisten Produkte unwahrscheinlich. Haarwachse enthielten die höchsten Mengen an FSEE und wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf c_i-FSEE und c_e-FSEE bereits in Abschnitt 4.3.2.6 beschrieben.

Grundsätzlich können Substanzen in sämtlichen Körperhaaren eingelagert werden. In der Vergangenheit wurden zum Zwecke der Haaranalyse neben Haupthaar auch Scham-, Achsel-, Brust- und Barthaar sowie Behaarung der Extremitäten herangezogen. Für illegale Drogen ließ sich hierbei feststellen, dass qualitative Befunde in der Regel bestätigt werden konnten, die quantitativen Ergebnisse aber je nach Substanz und abhängig vom Entnahmeort zum Teil erheblichen Schwankungen unterlagen. Dieser Befund kann dadurch erklärt werden, dass Körperbehaarung aufgrund der unterschiedlichen Wachstumszyklen andere Zeitbereiche repräsentiert als gleich langes Kopfhaar. Auch Unterschiede in der Produktivität der Schweiß- und Sebumdrüsen können hierzu beitragen. Die Besonderheiten des Haarwachstums sowie mögliche äußere Einflüsse auf die FSEE-Konzentrationen sind für die verschiedenen Haararten in Tabelle 15 zusammengefasst.

Um zu klären, inwieweit auch Haare von alternativen Entnahmeorten für die Prüfung auf FSEE als Alkoholmarker geeignet sind, wurden bei zwei lebenden Normaltrinkern und 22 Sektionsfällen neben Kopfhaar auch Haare von anderen Regionen des Körpers auf FSEE untersucht, darunter Bart-, Achsel-, Brust- und Schamhaare sowie Haare von Armen und Beinen [214]. Bei den Todesfällen lag überwiegend exzessiver Alkoholkonsum vor, was

Tabelle 15: Daten zu Haarwachstum und Besonderheiten menschlicher Haare [213].

* Dauer der anagenen und der katagenen + telogenen Phase des Haarwachstumszyklus in Jahren (j), Monaten (m), Wochen (w) oder Tagen (t).

sowohl durch die Obduktionsbefunde als auch durch die c_i-FSEE-Werte bestätigt wurde.

In Tabelle 16 sind die ermittelten c_i-FSEE in den unterschiedlichen Haarsorten zusammengestellt. Das Verhältnis der vier Ester zueinander entsprach in allen Haararten dem bekannten Muster mit hohen Konzentrationen von Ethylpalmitat und Ethyloleat bei wesentlich geringeren Konzentrationen von Ethylmyristat und Ethylstearat. Im Folgenden werden die Ergebnisse für die verschiedenen Entnahmeorte getrennt behandelt.

Die FSEE-Konzentrationssummen in Schamhaar variierten stark in einem Bereich zwischen 0,14 und 8,5 ng/mg. In Abb. 39 wurden die c_i-FSEE im Schamhaar gegen die c_{i FSEE} im Haupthaar aufgetragen. Es zeigt sich keine klare Korrelation der Konzentrationen. Bei Anwendung des für Haupthaar ermittelten Cut-off-Wertes von 1 ng/mg würden 2 der Fälle (S072/01, S177/01) bei isolierter Betrachtung der Schamhaarprobe falsch negativ bewertet werden. In der überwiegenden Mehrzahl der Fälle führt die Betrachtung der Schamhaarkonzentration aber zu der gleichen qualitativen Zuordnung wie die Betrachtung der Konzentration im Kopfhaar. Die beobachteten Unterschiede beruhen zum einen auf der ungleichen Verteilungsdichte und Größe der Talgdrüsen in Scham- und

Tabelle 16: FSEE-Konzentrationen in Kopf-, Scham-, Achsel-, Bart- und Körperhaaren [214].

* W = Wade, B = Brust, A = Augenbrauen.

Fortsetzung Tabelle 16

* W = Wade, B = Brust, A = Augenbrauen.

Kopfregion mit deutlicher stärkerer Exkretion auf der behaarten Kopfhaut und zum anderen auf einem unterschiedlichen zeitlichen Ablauf des Haarzyklus (s. Tabelle 15) mit einem relativ hohen Anteil von Schamhaaren in der Telogenphase [215]. Dies bedeutet, dass die Schamhaare einerseits mit weniger Sebum in Kontakt kommen, andererseits aber die Dauer der Sebumexposition länger ist. Weiterhin können Unterschiede in den Gewohnheiten der hygienischen und kosmetischen Behandlung zu der schlechten Korrelation beitragen.

In den meisten untersuchten Fällen zeigte sich eine gegenüber dem Kopfhaar verringerte c_{i FSEE} im Schamhaar, was sich in der Steigung der Trendlinie, die deutlich unter 1 liegt, widerspiegelt. Die Untersuchung von Schamhaar allein könnte im Einzelfall bei Anwen-

	Abb. 39: Vergleich der ci-FSEE für Haupthaar- und Schamhaarproben derselben Probanden mit Trendlinie. Diagramm B stellt eine Ausschnittsvergrößerung von Diagramm A dar.

dung des für Kopfhaar festgelegten Cut-off-Wertes daher zu falsch negativen Ergebnissen führen und ist insofern kritisch zu bewerten.

Mit Ausnahme des Probanden SH02, der täglich ein alkoholhaltiges Deodorant angewendet hatte (s. Abschnitt 4.3.2.8), lag die im Achselhaar gefundene c_i-FSEE für die acht untersuchten Fälle unter der im Haupthaar gefundenen. Im Fall S093/01 ergab die isolierte Betrachtung der in den Achselhaaren gefundenen c_i-FSEE bei Anwendung des Cut-off-Wertes von 1 ng/mg ein falsch negatives Ergebnis. In einem Fall (S317/01) wurde eine im Verhältnis zu den anderen FSEE ungewöhnlich geringe Konzentration von Ethyloleat gefunden.

Für Konzentrationsunterschiede zwischen Achselhaar und Haupthaar können ähnlich wie bei Schamhaar neben unterschiedlichen Wachstumszyklen und Wasch- bzw. Hygienegewohnheiten auch Unterschiede in der Verteilung der Hautdrüsen verantwortlich sein. So finden sich in der Achselregion nur relativ wenige Talgdrüsen, dafür aber eine Vielzahl apokriner Schweißdrüsen mit einem speziellen Lipidmetabolismus [216].

Die isolierte Betrachtung von FSEE-Konzentrationen in Achselhaaren kann also sowohl zu falsch negativen als auch zu falsch positiven Ergebnissen führen und ist daher ähnlich wie die Analyse von Schamhaar kritisch zu bewerten.

In 15 Fällen wurden Barthaare auf ihren Gehalt an FSEE untersucht. Für acht Fälle lag die gemessene c_i-FSEE im Barthaar über der c_i-FSEE im Haupthaar, für sieben Fälle darunter. Bei den Alkoholikern unter den Sektionsfällen lag die c_i-FSEE im Barthaar ausnahmslos über 1 ng/mg Haar. Bei Barthaaren ist ein direkter Kontakt mit alkoholischen Getränken zumindest bei Kinn- und Oberlippenbart als wahrscheinlich anzusehen. Der exogene Alkohol könnte dabei von der Haut absorbiert werden und in den Talgdrüsen oder im bereits sezernierten Haartalg zur Bildung von FSEE führen. Ein vergleichbarer Effekt wurde bei der Anwendung ethanolhaltiger Haarlotionen beobachtet (s. Abschnitt 4.3.2.8).

Bei Berücksichtigung einer unteren Grenze für c_i-FSEE von 1 ng/mg als Hinweis auf chronisch exzessiven Alkoholmissbrauch ergab sich für alle untersuchten Fälle eine Übereinstimmung in der Zuordnung bei Vergleich mit den korrespondierenden c_i-FSEE im Haupthaar. Insofern erscheint Barthaar als geeignetes alternatives Untersuchungsaterial. Allerdings sollte der möglichen Kontamination durch Alkohol in Getränken Rechnung getragen werden, indem bei Fehlen von Kopfbehaarung Haare einer weiteren Körperregion untersucht werden.

Es wurden in sechs Fällen Haare von weiteren Körperregionen untersucht, darunter dreimal Brusthaare, viermal Beinhaare und einmal Augenbrauen. Die Variationsbreite von Länge, Durchmesser und Wachstumszyklus ist bei diesen Körperhaaren am größten. In vier Fällen wies die c_i-FSEE in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Analyse des Haupthaars auf chronisch exzessiven Alkoholkonsum hin, allerdings ergaben sich tendenziell kleinere c_i-FSEE. Für allgemein gültige Aussagen bezüglich der Verwendbarkeit von Körperbehaarung war die Anzahl der untersuchten Fälle allerdings zu gering. Eine Beeinflussung der FSEE-Konzentrationen im Brusthaar durch ethanolhaltige Deodorants wurde für einen Fall bereits in Abschnitt 4.3.2.8 beschrieben.

Bei der Probennahme ergibt sich für diese Haarsorten häufig das Problem, dass die benötigte Haarmenge nicht oder nur unter ästhetischer Beeinträchtigung des Probanden erhalten werden kann. Daher ist zu empfehlen, in der Praxis zunächst auf die zuvor genannten alternativen Haarsorten zurückzugreifen.

Neben Einflüssen der Haarkosmetik und der Wahl des Entnahmeortes kommen als weitere störende Nebeneffekte individuelle Unterschiede und Schwankungen in der Sebumproduktion und -zusammensetzung in Abhängigkeit von Hauttyp, Lebensalter, Geschlecht, Krankheit und/oder jahreszeitlichen und klimatischen Einflüssen infrage. Auch Unterschiede in der Aufnahmekapazität des Haars für Sebum bzw. FSEE, die durch variierende Haardurchmesser sowie unterschiedliche Durchlässigkeit der Cuticula z. B. infolge haarkosmetischer Behandlung zustande kommen können, stellen ein Problem dar. Die Haarfarbe, die grundsätzlich einen Einfluss auf die Kinetik der Substanzeinlagerung ausüben kann [217], spielt für die FSEE-Konzentrationen mit hoher Wahrscheinlichkeit keine Rolle, da die Einlagerung in erster Linie über das Sebum stattfindet und somit nicht vom Melaningehalt des Haars, der für Unterschiede in den Einlagerungsraten für bestimmte Substanzen verantwortlich ist, beeinflusst ist. Eine systematische und quantitative Untersuchung der genannten Einflüsse war im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich, zumal Größen wie die Sebumexkretionsrate einer Messung nur schwer zugänglich sind und nur bei lebenden Probanden gemessen werden können.

In den vorangegangenen Abschnitten wurde gezeigt, dass neben dem Trinkverhalten auch andere Größen Einfluss auf die gemessenen FSEE-Konzentrationen nehmen können. Eine Möglichkeit zur Korrektur dieser vielfältigen individuellen Einflüsse stellt die Anwendung von Squalen als natürlicher Bezugssubstanz dar; diese Größe wird im nächsten Abschnitt eingeführt.

Da die FSEE hauptsächlich über das Sebum in das Haar eingelagert werden, kann die von zahlreichen Faktoren wie Alter, Geschlecht, Jahreszeit etc. abhängige Aktivität der Sebumdrüsen sowie die individuell unterschiedliche Lipid-Aufnahmekapazität des Haars zu Problemen bei der Interpretation der c_i-FSEE führen. Zudem findet je nach Häufigkeit und Intensität der Anwendung von Haarkosmetika eine unterschiedlich starke Elimination der FSEE aus dem Haar statt (s. Abschnitt 4.3.2.1 bis 4.3.2.7). Bei den segmentweise untersuchten Haarproben ergab sich außerdem durch zunehmende Akkumulation der FSEE in der Regel ein Anstieg der Konzentrationen von proximal nach distal (vgl. Abschnitt 4.2.1), was ebenfalls zu Problemen bei der Interpretation der Werte führen kann, insbesondere wenn es nicht möglich ist, das vorzugsweise zur Analyse herangezogene 6 cm lange kopfnahe Haarsegment zu untersuchen.

Als Lösungsansatz für diese Problematik wurde nach einer geeigneten Bezugsgröße gesucht, die als natürlicher Bestandteil des Sebums in möglichst konstantem Verhältnis zum Extraktgewicht anwesend und analytisch gut erfassbar ist. Durch teilen der c_i-FSEE durch die Konzentration einer solchen Bezugsgröße, die aus demselben Extrakt bestimmt wurde, erhält man als neue Größe relative FSEE-Konzentrationen, für welche die genannten Effekte zumindest teilweise kompensiert sein sollten. Neben dem auf die Haareinwaage bezogenen Fettsäuregehalt oder dem Cholesteringehalt kommt in diesem Zusammenhang vor allem die Konzentration des Squalens (vgl. Abschnitt 4.1.5) als Bezugsgröße in Betracht, da es in Sebum zu 10 bis 20 Gew.-% enthalten ist und sich durch eine vergleichsweise hohe chemische und biochemische Stabilität auszeichnet. Die Squalenkonzentrationen in menschlichem Sebum schwanken bei Messung unter einheitlichen Bedingungen innerhalb einer akzeptablen Breite. Die unterschiedlichen in der Literatur angegebenen Konzentrationsbereiche (8,9±2,9 % für 26 gesunde Freiwillige [196], 19,9±6,6 % für 20 Erwachsene [197], 10-15 % für Aknepatienten [198], 11 % für gepooltes menschliches Sebum [199] bzw.
21-30 % in frisch isolierten Sebumdrüsen [200], 9-13 % für 100 gesunde Freiwillige [202], 13,0-17,5 % für 16 Aknepatienten [218]) sind dabei eher auf methodische Unterschiede bei der Probennahme oder der Analytik zurückzuführen als auf tatsächliche Unterschiede im Squalengehalt des Sebums für die verschiedenen Probandengruppen.

Daher wurde in der vorliegenden Arbeit Squalen als natürliche Bezugssubstanz gewählt, das nach der in Abschnitt 3.4.5 beschriebenen Methode mittels HPLC-DAD bestimmt wurde. In Abb. 40 sind sowohl die FSEE- und die Squalenkonzentrationen als auch die Quotienten c_i-FSEE/c_SQ aus diesen beiden Größen graphisch dargestellt, die bei segmentweiser Untersuchung der Haarproben eines Alkoholikers und eines Normaltrinkers gefunden wurden. Man erkennt, dass für Squalen ein ähnlicher Konzentrationsverlauf von proximal nach distal erhalten wird, wie für die internen FSEE, allerdings ist das Konzentrationsmaximum für Squalen in Richtung Kopfhaut verschoben. In drei weiteren

	Abb. 40: FSEE-Konzentrationen ci-FSEE, Squalenkonzentrationen cSQ und relative FSEE-Konzentrationen ci FSEE/cSQ in den Segmenten einer Alkoholikerhaarprobe (a) und einer Normaltrinkerhaarprobe (b).

segmentweise untersuchten Haarproben zeigte sich ein analoger Verlauf. Daraus ist zu schließen, dass das ebenfalls unpolare und wahrscheinlich nach einem ähnlichen Mechanismus ins Haar eingelagerte Squalen (vgl. 4.2.2) aufgrund von Unterschieden in den physikochemischen Eigenschaften eine andere Einlagerungs- und Auswaschkinetik besitzt als die FSEE. Durch Betrachtung des Quotienten c_i-FSEE/c_SQ werden so die oft zu niedrig ausfallenden FSEE-Konzentrationen der kopfnahen Segmente zwar nach oben korrigiert, insgesamt ergibt sich jedoch über die gesamte Länge keine konstante Größe. Vielmehr findet man im ersten Segment (0-3 cm) und bei längeren Haarproben in den distalen Segmenten ab ca. 10 cm im Vergleich zu c_i-FSEE zum Teil deutlich erhöhte Werte. Für die weiteren Untersuchungen wurde daher nur der proximale Abschnitt von 6 cm Länge herangezogen. Haarproben, die kürzer als 6 cm waren, wurden in voller Länge untersucht. Um genauer aufzuklären, ob der Einfluss der Haarlänge auf die FSEE-Konzentrationen bei Haarproben mit einer Länge unter 6 cm durch Berechnung von c_{i FSEE}/c_SQ kompensiert werden kann, sind weitere Untersuchungen in kleineren Abschnitten (mit beispielsweise
1 cm Länge) nötig, die im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt wurden.

Um einen ersten Eindruck zu erhalten, ob durch Heranziehen der auf Squalen bezogenen relativen FSEE-Konzentrationen eine Erhöhung der Aussagesicherheit erreicht werden kann und welche Cut-off-Werte für die neue Größe anzuwenden sind, wurden für Haarproben von 13 Abstinenzlern, 16 Normaltrinkern und 24 Todesfällen mit exzessivem Alkoholkonsum zu Lebzeiten sowohl c_i-FSEE als auch c_SQ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 dargestellt. Tabelle 18 zeigt die Ergebnisse für 39 weitere Todesfälle, bei denen aus der Vorgeschichte nicht eindeutig zu entnehmen war, ob zu Lebzeiten ein auffälliges Trinkverhalten vorlag. In einigen Fällen bestand jedoch ein Verdacht auf Alkoholismus. Neben den erhobenen Obduktionsbefunden, den Ermittlungsergebnissen der Polizei sowie der postmortalen Blutalkoholkonzentration sollte in diesen Fällen die Bestimmung der FSEE und des Squalens einen weiteren Hinweis erbringen.

Die Squalenkonzentrationen schwankten im gesamten Untersuchungsgut zwischen 0,02 µg/mg im Haar zweier Kinder und 1,97 µg/mg im Haar der Normaltrinkerin N5. Die mittlere Squalenkonzentration betrug ohne Einbeziehung der beiden Kinderhaarproben 0,53 µg/mg. Es konnte kein deutlicher Unterschied zwischen der mittleren c_SQ der erwachsenen Abstinenzler (0,77 µg/mg) und der Normaltrinker (0,75 µg/mg) festgestellt werden. Für die untersuchten Todesfälle hingegen wurden erheblich niedrigere Konzentrationen gefunden, wobei für die als Alkoholiker einzustufenden Todesfälle im Mittel 0,34 µg/mg und für die Nichtalkoholiker bzw. Grenzfälle im Mittel 0,54 µg/mg festgestellt wurden. Diese Unterschiede können teilweise durch die unterschiedliche Altersverteilung mit einem überproportionalen Anteil älterer Personen unter den Todesfällen, andererseits aber durch Effekte des starken Alkoholkonsums auf Stoffwechselfunktionen und somit auch auf die Talgproduktion und -zusammensetzung bedingt sein. In Abb. 41 ist die Verteilung der Squalenkonzentrationen über das Lebensalter für die untersuchten Nichtalkoholiker aufgetragen. Es ist zu erkennen, dass mit zunehmendem Alter die Squalenkonzentration im Haar tendenziell abnimmt. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass sich die Sebumproduktion in höherem Alter hormonbedingt verringert.

Zur Evaluierung der Daten wurde als Cut-off-Wert zur Unterscheidung von exzessiven Alkoholkonsumenten und Normaltrinkern/Abstinenzlern für den Quotienten c_i-FSEE/c_SQ ein Wert von 2 ng/µg gesetzt, der sich aus dem Cut-off-Wert für c_i-FSEE von 1 ng/mg

	Abb. 41: Altersabhängigkeit der Squalenkonzentration im Haar erwachsener Normaltrinker und Abstinenzler. Es wurden 11 Abstinenzler, 16 Normaltrinker und 25 Todesfälle, die unauffällige FSEE-Konzentrationen zeigten, einbezogen (n = 52). Die Trendlinie ist schwarz eingezeichnet.

(s. Abschnitt 4.3.1) unter Annahme einer durchschnittlichen Squalenkonzentration von
0,5 µg/mg errechnet. Der obere Grenzwert für Abstinenzler verschiebt sich so von
0,4 ng/mg (c_i-FSEE) auf 0,8 ng/µg (c_i-FSEE/c_SQ). Für Kinderhaarproben erscheint eine analoge Modifikation des Cut-off-Wertes von 0,1 ng/mg für c_i-FSEE nicht sinnvoll, da offenbar infolge der schwachen Sebumproduktion vor Beginn der Pubertät extrem niedrige Squalenkonzentrationen erhalten werden, die zu einem erhöhten Quotienten c_i-FSEE/c_SQ führen. Daher werden die Kinderhaarproben aus den folgenden Betrachtungen ausgeschlossen, zumal sich bei Kindern in der Regel die Frage nach chronischem Alkoholmissbrauch nicht stellt.

Abstinenzler- und Normaltrinkerproben (Tabelle 17)

Bezüglich der Werte für c_i-FSEE wurden in diesen beiden Gruppen ähnliche Ergebnisse gefunden, wie die in Abschnitt 4.3.1 (Abb. 32) beschriebenen. Es gab aber auch einige Abweichungen, auf die hier ein besonderes Augenmerk gerichtet werden soll. In drei Fällen (A12, N11 und N15) gaben die Probanden im Fragebogen an, regelmäßig ethanolhaltige Haarpflegemittel zu benutzen, was die erhöhten Werte für diese Haarproben erklärt (vgl. Abschnitt. 4.3.2.8). Die Fälle A10 und A13 liegen für c_i-FSEE zwar mit 0,44 und
0,82 ng/mg über dem Abstinenzlerbereich (< 0,4 ng/mg), zeigen aber für c_i-FSEE/c_SQ Werte,

Tabelle 17: FSEE-Konzentrationssumme (c_i-FSEE, Summe der Konzentrationen von C14-Et, C16-Et, C18Δ⁹-Et und C18-Et) und Squalenkonzentration c_SQ sowie relative FSEE-Konzentrationen (c_i-FSEE/c_SQ) im Haar von Abstinenzlern, Normaltrinkern und Todesfällen mit exzessivem Alkoholkonsum zu Lebzeiten.

Fortsetzung Tabelle 17

^a Angaben der Probanden in einem Fragebogen.

^b Verwendung ethanolhaltiger Haarlotion.

^c Der exzessive Alkoholkonsum ging zweifelsfrei aus den polizeilichen Ermittlungen hervor und wurde durch typische Obduktionsbefunde bestätigt, es waren keine Daten zur täglichen Trinkmenge verfügbar.

Tabelle 18: FSEE-Konzentrationssummen c_i-FSEE (C14-Et, C16-Et, C18Δ⁹-Et und C18-Et) und Squalenkonzentrationen c_SQ sowie relative FSEE-Konzentrationen (c_i-FSEE/c_SQ) im Haar von Todesfällen mit unbekannter Alkoholanamnese.

* Postmortale Blutalkoholkonzentration

die unterhalb des Grenzwertes von 0,8 ng/µg liegen. Im Fall N5 geht der erhöhte Wert für c_{i FSEE} mit einer außergewöhnlich hohen c_SQ einher, sodass sich für den Quotienten c_{i FSEE}/c_SQ mit 0,61 ng/µg ein im Bereich für Normaltrinker liegender Wert ergibt (< 0,8 ng/µg). In diesen drei Fällen führt somit die Betrachtung der relativen FSEE-Konzentrationen zu einer stimmigeren Zuordnung. Für alle anderen Fälle liegen sowohl c_{i FSEE}- als auch c_i-FSEE/c_SQ-Werte in den erwarteten Bereichen.

Alkoholikerhaarproben (Tabelle 17)

Für die Mehrzahl der 24 Alkoholikerhaarproben liegen sowohl c_i-FSEE als auch c_i-FSEE/c_SQ in den für Alkoholiker typischen Wertebereichen. Allerdings weisen 5 Proben c_i-FSEE-Werte von unter 1 ng/mg auf (Proben 496/03, 284/04, 294/04, 374/04 und 439/04) und zwei liegen nur knapp oberhalb des Cut-off-Wertes (Proben 353/03 und 427/04). Da diese 7 Proben durchweg relativ niedrige c_SQ zwischen 0,03 und 0,35 µg/mg zeigen, liegen die relativen FSEE-Konzentrationen mit Werten zwischen 2,72 und 11,39 ng/µg dagegen deutlich oberhalb des Cut-off-Wertes für c_i-FSEE/c_SQ von 2 ng/µg. Auffällig war, dass alle fünf Fälle mit c_i-FSEE < 1 ng/mg schwere bis schwerste alkoholbedingte Organschäden aufwiesen (in allen Fällen verfettete Leber und Bauchspeicheldrüse, pathologische Veränderungen des Herzens, 3 Fälle mit Leberzirrhose), die z. T. todesursächlich waren. Bei den übrigen Fällen waren die Organschädigungen meist geringer ausgeprägt oder nicht vorhanden. Für die Personen mit niedrigen Werten für c_SQ ist zu folgern, dass eine verminderte Menge an löslichen Lipiden im Haar vorlag. Es ist daher davon auszugehen, dass bei diesen Personen wahrscheinlich durch Veränderungen des Stoffwechsels infolge des chronischen Alkoholmissbrauchs entweder die Sebumproduktion deutlich reduziert war oder die Haarstruktur sich auf eine Art verändert hat, die zu einer niedrigeren Lipid-Aufnahmekapazität führt.

Todesfälle mit unbekannter Alkoholanamnese (Tabelle 18)

Von den 39 untersuchten Fällen aus dieser Gruppe ergaben 25 sowohl hinsichtlich c_i-FSEE als auch c_i-FSEE/c_SQ ein negatives Ergebnis in Bezug auf chronisch exzessiven Alkoholkonsum, wobei sechs dieser Fälle (Proben 505/03, 518/03, 276/04, 379/04, 390/04 und 410/04) in der Vergangenheit zum Teil schwere Alkoholprobleme hatten, aber mit hoher Wahrscheinlichkeit zumindest in den letzten Monaten vor dem Tode abstinent waren. Insgesamt sechs Fälle ergaben für beide Parameter Werte, die über den Cut-offs für chronisch exzessiven Alkoholkonsum liegen. Bei vier dieser Fälle wurden typische Organveränderungen festgestellt, die diesen Befund bestätigten. Ein weiterer Fall (Nr. 118/04) zeigte zwar keine alkoholtypischen Organschäden, war aber bei Todeseintritt stark alkoholisiert. Für den Fall 531/04 besteht die Möglichkeit, dass z. B. durch Verwendung alkoholhaltiger Haarpflegemittel ein falsch positives Ergebnis erzeugt wurde (vgl. Abschnitt 4.3.2.8), da die Organe der zum Todeszeitpunkt 20-jährigen bei einem Verkehrsunfall ums Leben gekommenen Person offenbar gesund waren und zu Transplantationszwecken entnommen wurden. Auch aus dem Umfeld des Betroffenen ergaben sich keine Hinweise auf einen chronisch erhöhten Alkoholkonsum. Bei acht weiteren Fällen, die in der letzten Spalte von Tabelle 18 mit „Grenzwertig“ ausgewertet wurden, ergaben sich bei Betrachtung der beiden Größen unterschiedliche Bewertungen. Im Fall 355/03 wurde ein Wert von 1,98 ng/mg für c_i-FSEE gefunden, der in Einklang mit den Organbefunden und dem vermuteten Alkoholmissbrauch steht. Aufgrund des sehr hohen Squalenwertes wird für c_i-FSEE/c_SQ jedoch nur ein Wert von 1,05 ng/µg erreicht. Möglicherweise war bei dieser Person der Squalengehalt des Sebums aufgrund eines ungewöhnlichen Metabolismus außergewöhnlich hoch. Für den Fall 398/03 ergab sich ein nur knapp über dem Cut-off liegender Wert für c_i-FSEE. Eine relativ hohe Squalenkonzentration von 0,83 µg/mg führte auch in diesem Fall zu einem unter 2 ng/µg liegenden Wert für c_i-FSEE/c_SQ, eine klare Bewertung dieses Falles ist daher nicht möglich. Von den verbleibenden sechs Fällen, für die durchweg hohe Werte für c_i-FSEE/c_SQ und c_{i FSEE}-Werte unterhalb des Cut-offs von 1 ng/mg gefunden wurden, waren bei vier Fällen während der Obduktion Organveränderungen feststellbar, die deutlich auf chronischen Alkoholmissbrauch hinwiesen. Als Erklärung kommen die bereits bei den entsprechenden Fällen aus der Alkoholikergruppe beschriebenen Gründe in Betracht. In den zwei Suizidfällen 537/03 und 377/04 waren dagegen keine auffälligen Organbefunde erhoben worden. Im Fall 537/03 lag der Wert für c_i-FSEE allerdings nur knapp unter dem Cut-off, es ist daher davon auszugehen, dass in der letzten Zeit vor dem Tode ein erheblicher Alkoholkonsum stattgefunden hatte. Bei Fall 377/04 ist es aufgrund der Datenlage nicht möglich, eine klare Aussage zu treffen.

Die Klärung der Frage, ob die auf Squalen bezogenen FSEE-Konzentrationen im Haar generell eine Verbesserung der Aussagekraft hinsichtlich des Trinkverhaltens ermöglichen, bleibt weiteren Untersuchungen mit einer größeren Zahl an Probanden vorbehalten. Erste Studien hierzu wurden bereits z. T. in Kooperation mit anderen Institutionen durchgeführt und werden in Abschnitt 4.6 dargestellt. Es erscheint auf Grundlage der hier vorgestellten Betrachtungen sinnvoll, beide Parameter in die Bewertung einfließen zu lassen. Vor allem bei schweren Alkoholikern mit Organschädigungen erwies sich die Einführung der Squalenkonzentration als natürlicher Bezugsgröße als wirksame Korrektur.

Um Aufschluss über das Trinkverhalten in jüngerer Zeit zu erhalten, könnte es von Interesse sein, auch die Waschlösungen von Haarproben auf FSEE und Squalen zu untersuchen, da die Sebumschicht auf dem Haar bei jeder Haarwäsche teilweise entfernt und ständig über die Produktion der Talgdrüsen erneuert wird. Allerdings bietet sich für derartige Fragestellungen eher die Anwendung der in Abschnitt 4.7 beschriebenen Pflaster- und Wischtests an, da die bei dieser Art der Probennahme gewonnenen Lipide neben einem geringen Anteil an Hautlipiden in erster Linie aus Sebum bestehen, aber einige der bei Haarproben potentiell störenden, z. B. durch haarkosmetische Behandlungen hervorgerufenen Effekte entfallen.

In einer vergleichenden Studie in Zusammenarbeit mit dem Laboratoire National de Santé, Abteilung Toxicologie (Luxemburg) wurden drei Haarproben von Abstinenzlern, vier von Normaltrinkern (Trinkmenge bis zu 20 g Ethanol/Tag), 10 von Patienten in Entzugsbehandlung nach dokumentiertem chronischem Alkoholmissbrauch und 11 Haarproben von Todesfällen mit exzessivem Alkoholkonsum zu Lebzeiten auf FSEE und Ethylglucuronid (EtG) untersucht [55]. Die Bestimmung der c_i-FSEE wurde nach dem in Abschnitt 3.4.1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Zur Analyse auf EtG wurden die Haarproben mit Wasser im Ultraschallbad extrahiert und die erhaltenen Extrakte nach Festphasenextraktion an Aminopropylsäulen und Derivatisierung mit Pentafluorpropion-säureanhydrid/Pentafluorpropanol (PFPA/PFPOH) mittels GC-MS mit negativer chemischer Ionisierung (NCI) untersucht. Bei einer Nachweisgrenze im Bereich von wenigen pg/mg kann nach bisherigem Stand der Forschung bereits ein positiver EtG-Befund als Hinweis auf das Vorliegen von exzessivem Alkoholkonsum gewertet werden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 dargestellt. Für die drei Abstinenzlerhaarproben wurden mit c_i-FSEE-Werten zwischen 0,05 und 0,37 ng/mg Konzentrationen festgestellt, die für diese Gruppe typisch sind. Ethylglucuronid konnte in keiner der drei Proben nachgewiesen werden (LOD 2 pg/mg). Auch im Haar der Normaltrinker konnte kein EtG detektiert werden, c_i-FSEE lag für diese Proben zwischen 0,26 und 0,50 ng/mg und somit ebenfalls in einem typischen Bereich (vgl. Abschnitt 4.3.1). In der Gruppe der Patienten in Entzugsbehandlung konnte in allen Proben Ethylglucuronid nachgewiesen werden. Die Konzentrationen lagen zwischen 42 und 415 pg/mg. Die c_i-FSEE-Werte für diese Gruppe lagen zwischen 0,65 und 20,48 ng/mg, für vier Patienten wurden Werte unter 1 ng/mg erhalten. Da zu diesem Zeitpunkt noch keine Untersuchung der Extrakte auf Squalen (vgl. Abschnitt 4.4) durchgeführt wurde, konnte nicht geklärt werden, ob dieser Befund auf eine durch Stoffwechselveränderungen oder häufige Haarwäsche bedingte Verminderung der Gesamtlipidmenge im Haar zurückzuführen war. Für die Todesfälle wurden durchweg positive EtG-Befunde erhalten (72-3380 pg/mg). Die c_i-FSEE-Werte lagen zwischen 1,3 und 30,6 ng/mg und damit ebenfalls alle oberhalb des Cut-off-Wertes von 1 ng/mg.

Bei Vergleich der EtG- und der FSEE-Konzentrationen ergab sich keine klare Korrelation zwischen diesen beiden Größen. Auch die Verteilung der Konzentrationen über die Haarlänge, die bei längeren Haarproben durch segmentweise Untersuchung ermittelt wurde, unterschied sich für die beiden Substanzen deutlich. Während für die FSEE wie auch in

Tabelle 19: Vergleich von FSEE- und EtG-Konzentrationen für Haarproben von Abstinenzlern, Normaltrinkern, Entzugspatienten und Todesfällen mit exzessivem Alkoholkonsum zu Lebzeiten. Die Konzentrationen beziehen sich auf das kopfnahe Segment 0-6 cm.

n.n.: nicht nachweisbar (LOD = 2 pg/mg).

den vorhergehenden Untersuchungen ein Anstieg von proximal nach distal und das Durchlaufen eines Maximums bei ca. 10-15 cm festgestellt wurde, konnte für EtG in den meisten Fällen eine Verminderung der Konzentrationen von proximal nach distal beobachtet werden (vgl. Abb. 42). Als Erklärung hierfür können die unterschiedlichen Bildungsorte und Einlagerungsmechanismen der Substanzen herangezogen werden. Während FSEE in erster Linie über das Sebum ins Haar gelangen, ist für das hydrophile EtG anzunehmen, dass die Einlagerungswege über den Blutkreislauf und den Schweiß dominieren. Es ist außerdem davon auszugehen, dass EtG bei Haarwäsche und haarkosmetischer Behandlung leichter ausgewaschen wird als die FSEE.

Des Weiteren konnte weder für FSEE noch für EtG eine klare Korrelation zwischen den Haarkonzentrationen und der Höhe des dokumentierten Alkoholkonsums festgestellt werden. Während dieses Ergebnis für die FSEE aus den in Abschnitt 4.2 dargelegten Gründen zu erwarten war, lässt sich für EtG schließen, dass ein Großteil der Substanz über den Schweiß eingelagert wird, da bei vornehmlicher Einlagerung über den Blutkreislauf der Zeitverlauf des Konsumverhaltens im abschnittsweise untersuchten Haar abgebildet werden müsste.

	Abb. 42: Segmentweise Analyse auf FSEE (weiße Balken) und EtG (schwarze Balken) bei vier Haarproben von in Alkoholentzugspatienten. Die Histogramme sind in logarithmischer Form dargestellt.

Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dass sowohl FSEE als auch EtG grundsätzlich als qualitative Marker für chronisch erhöhten Alkoholkonsum geeignet sind. Aus beiden ist jedoch aufgrund des Einlagerungsmechanismus keine zeitliche Aussage abzuleiten. Bei Untersuchung auf beide Alkoholmarker lässt sich die Aussagesicherheit in Bezug auf chronisch erhöhten Alkoholkonsum verbessern, da eine gegenseitige Bestätigung erfolgen kann und aufgrund der unterschiedlichen Einlagerungswege eine gleichzeitige negative Beeinflussung beider Parameter durch äußere Störeffekte unwahrscheinlicher wird.

Nach Abschluss der Vorversuche und Festlegung der Cut-off-Werte für c_i-FSEE und c_{i FSEE}/c_SQ wurden FSEE-Bestimmungen im Haar an verschiedenen Probandengruppen durchgeführt. Zum Teil wurden in Kooperation mit anderen Instituten zusätzliche Alkoholmarker wie Ethylglucuronid im Haar oder Phosphatidylethanol, GGT-, CDT- und MCV-Werte aus Vollblut bestimmt und die Ergebnisse mit den FSEE-Befunden verglichen.

In Zusammenarbeit mit dem psychiatrischen Universitätskrankenhaus der Universität Basel wurden von 18 Patienten, die zu einer Entgiftungsbehandlung stationär aufgenommen wurden und im letzten Monat vor der Aufnahme zwischen 32 und 253 g (Median 148 g) Ethanol/Tag konsumiert hatten, Haarproben entnommen und auf FSEE untersucht. Parallel wurden mit Phosphatidylethanol, CDT, GGT und MCV vier Alkoholmarker aus dem Blut der Probanden bestimmt. Die Ergebnisse wurden bereits publiziert [219] und sind in Tabelle 20 zusammengefasst.

Die gefundenen Werte für c_i-FSEE lagen zwischen 0,39 und 3,19 ng/mg. In sechs der 18 Fälle wurden Werte unterhalb des Cut-offs von 1 ng/mg erhalten, für alle übrigen (66,7 %) lagen die Werte über dem Cut-off. Auch hier wurden keine Squalenkonzentrationen bestimmt und es gelten diesbezüglich die in Abschnitt 4.5 im Zusammenhang mit den dort untersuchten Entzugspatienten gemachten Betrachtungen. Für CDT wurde in 8 von 17 Fällen (47,1 %) Werte erhalten, die oberhalb des üblichen verwendeten Cut-offs liegen. Das MCV war bei nur 7 von 18 Probanden (38,9 %) auffällig erhöht, GGT dagegen bei 13 von 18 Fällen (72,2 %). Bei GGT steht dieser relativ hohen Sensitivität allerdings eine

Tabelle 20: Vergleich der FSEE-Konzentrationen im Haar mit qualitativen Befunden für weitere Alkoholmarker und der von den Patienten angegebenen Trinkmenge bei stationär aufgenommenen Entgiftungspatienten.

* Durchschnittlicher täglicher Alkoholkonsum im Monat vor der Untersuchung (Patientenangabe).

pos.: oberhalb des Cut-offs; –: unterhalb des Cut-offs; n.g.: nicht gemessen.

Referenzwerte: % CDT < 6 %, MCV < 98 fl, GGT < 20 U/L für Frauen und < 28 U/L für Männer, Phosphatidylethanol < Nachweisgrenze (LOD), c_i-FSEE < 1,0 ng/mg.

geringe Spezifität gegenüber, da erhöhte Leberenzymaktivitäten häufig auf andere patho-logische Ursachen als den Alkoholkonsum zurückgehen. Die Analyse auf Phosphatidylethanol schließlich ergab für alle 18 Probanden einen positiven Nachweis. Allerdings ist für diesen Marker nur ein Alkoholkonsum zu erfassen, der nicht länger als ca. 2 Wochen zurückliegt.

Daraus ergibt sich, dass c_i-FSEE als Marker für chronisch exzessiven Alkoholkonsum bei Verwendung eines Cut-off-Wertes von 1 ng/mg im Vergleich mit bisher eingesetzten Alkoholmarkern im Blut hinsichtlich der Sensitivität mindestens genauso gute Ergebnisse liefert. Als besonderer Vorteil der FSEE im Haar ist das im Vergleich zu den anderen gängigen Markern verlängerte diagnostische Zeitfenster von mehreren Monaten hervorzuheben.

Über einen Zeitraum von 4 Jahren wurden 17 Probanden, deren Fahreignung wegen Verdacht auf chronischen Alkoholabusus von behördlicher Seite infrage gestellt wurde, Kopfhaarproben entnommen und diese auf FSEE untersucht. In allen Fällen gaben die Probanden an, in den letzten Monaten strikt abstinent gewesen zu sein oder nur geringe Mengen Alkohol zu sich genommen zu haben. Diese Behauptung wurde in den meisten Fällen von Seiten eines medizinisch-psychologischen Gutachters bezweifelt, da entweder aufgrund auffälliger Labormarker wie zu hoher GGT- bzw. CDT-Werte oder nach Auswertung der Patientengespräche Hinweise auf einen weiterhin bestehenden Alkoholabusus vorhanden waren. In 10 der 17 Fälle wurden für das 6 cm lange kopfnahe Segment Konzentrationen zwischen 0,10 und 0,36 ng/mg erhalten, die zu der Abstinenzbehauptung für die Monate vor der Probennahme zumindest nicht im Widerspruch stehen. Unter den restlichen 7 Fällen lagen vier Fälle mit c_i-FSEE zwischen 0,5 und 0,6 ng/mg im Bereich, wie er üblicherweise bei Normaltrinkern gefunden wird. Drei Fälle lagen mit Werten zwischen 1,0 und 4,0 ng/mg oberhalb des Cut-off-Wertes von 1 ng/mg und somit in einem für chronisch erhöhten Alkoholkonsum typischen Bereich.

Von sechs Fällen, für die im Rahmen staatsanwaltlicher Ermittlungen oder auf Anordnung eines Richters eine Haaranalyse auf FSEE durchgeführt wurde, ergaben sich für 5 Fälle Werte, die im Abstinenzler- bzw. Normaltrinkerbereich liegen (0,14 bis 0,39 ng/mg). Nur in einem Fall bestätigte sich die Behauptung des Betroffenen, dass er starker Trinker sei. In den anderen Fällen, die angaben, regelmäßig große Mengen Alkohol zu trinken, handelte es sich offenbar um Schutzbehauptungen mit dem Zweck, im Strafverfahren aufgrund von eingeschränkter Schuldfähigkeit ein milderes Urteil zu erwirken.

Für 8 dieser insgesamt 23 untersuchten Fälle wurde zusätzlich die Ethylglucuronid- Konzentration im Haar bestimmt. In fünf dieser Fälle stimmte die qualitative Bewertung für beide Parameter überein (ein positiver EtG-Befund kann bereits als Hinweis auf exzessiven Alkoholkonsum gewertet werden, vgl. Abschnitt 4.5). In zwei Fällen, die für FSEE über dem Cut-off lagen, wurde dagegen für EtG ein negatives Ergebnis erhalten (Fall-Nr. 1579/04 und 1584/04). Allerdings lag die Nachweisgrenze der Methode für EtG bei der

Tabelle 21: FSEE- und EtG-Konzentrationen von Haarproben, die im Zuge gerichtlicher Verfahren oder Fahreignungsprüfungen untersucht wurden.

* bei segmentweiser Untersuchung längerer Haarproben wurden die Werte aus den Segmentkonzentrationen durch gewichtete Mittelwertbildung berechnet.

n.g.: nicht gemessen, LOD: Nachweisgrenze, lag bei diesen Untersuchungen zwischen 5 und 15 pg/mg.

Bearbeitung dieser beiden Fälle mit 15 pg/mg relativ hoch. Alternativ kann aber auch nicht ausgeschlossen werden, dass durch Behandlung mit ethanolhaltigen Haarpflegemitteln ein falsch positiver FSEE-Befund erzeugt wurde. In einem Fall wurde mit 0,24 ng/mg eine relativ niedrige FSEE-Konzentration festgestellt, aber ein positiver EtG-Nachweis erhalten (Fall-Nr. 1810/04). Da zum Zeitpunkt der Untersuchung noch keine Squalenbestimmungen in den Haarextrakten durchgeführt wurden, konnte der sich ergebende Widerspruch in diesem Fall nicht aufgeklärt werden.

In einigen Fällen erwies sich das Verfahren somit als nützliche Hilfe bei der Klärung der Frage, ob chronischer Alkoholabusus vorliegt. Da falsch positive Ergebnisse nicht mit letzter Sicherheit ausgeschlossen werden können, liegt der Hauptbereich der Anwendung für rechtliche Fragen im Ausschluss von exzessivem Alkoholkonsum, der für Führerscheinfragen aber auch für Fragen der Schuldfähigkeit von großer Bedeutung sein kann.

In Zusammenarbeit mit dem National Board of Forensic Medicine, Linköping (Schweden) wurden 193 anonymisierte Haarproben freiwilliger Studenten zunächst auf illegale Betäubungsmittel (Opiate, Amphetamine, Cocain und THC) untersucht. Anschließend wurden von 153 Proben zusätzlich die FSEE- und Squalenkonzentrationen bestimmt, um einen Anhaltspunkt für die Häufigkeit exzessiven Alkoholkonsums in diesem Probandenkollektiv zu erhalten.

Während bei 3 Probanden Cannabiskonsum, bei 8 Konsum von Drogen der Amphetamingruppe, bei 3 Probanden Kokainkonsum und bei 2 weiteren Opiatkonsum nachgewiesen werden konnte, fielen 7 Proben durch erhöhte FSEE-Konzentrationen auf. Dabei gab es keine Überschneidungen der Konsumentengruppen. Dass der Anteil der Probanden mit mutmaßlichem chronischem Alkoholabusus (ca. 4,6 %) im Verhältnis zu den anderen Drogen geringer ist, als es die nationalen Statistiken erwarten lassen, kann zum einen daran liegen, dass die Proben vor der Untersuchung für mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert worden waren (vgl. Abschnitt 4.1.1.2), zum anderen aber auch dadurch zustande gekommen sein, dass im vorliegenden Probandenkollektiv tatsächlich verhältnismäßig wenig Alkoholabusus stattfand. Als dritte Ursache kommt schließlich eine höhere Dunkelziffer bei Drogenkonsum infrage. Die vollständigen Ergebnisse einschließlich einer Auswertung der in einem Fragebogen erhobenen Daten zum Rauschmittelkonsum der Probanden sollen in Kürze publiziert werden.

Im Rahmen einer in Kanada durchgeführten Studie wurden in Blutproben von Autofahrern, die durch Fahren unter Alkoholeinfluss aufgefallen waren, die Alkoholmarker CDT, Phosphatidylethanol, GGT, MCV, ALAT und ASAT bestimmt. Von bisher 36 dieser Personen wurden zusätzlich Haarproben entnommen und auf FSEE, Squalen und EtG untersucht. Da die Studie noch nicht abgeschlossen ist, soll an dieser Stelle nur auf die momentan verfügbaren Ergebnisse eingegangen werden. Eine endgültige statistische Auswertung der vollständigen Daten unter Berücksichtigung der anderen gemessenen Laborparameter und der Alkoholanamnese steht noch aus, soll aber in den kommenden Monaten erfolgen und dann publiziert werden.

Die Ergebnisse der Haaranalytik sind in Tabelle 22 dargestellt. Während für Ethylglucuronid in 30 der 36 Haarproben ein positiver Nachweis geführt werden konnte, wurde für die FSEE nur in 18 Fällen Werte festgestellt, die für mindestens einen der beiden FSEE-Parameter oberhalb des Cut-offs für chronischen Alkoholabusus lagen. Drei Fälle mit Werten für c_i-FSEE/c_SQ im typischen Bereich für exzessiven Alkoholkonsum (> 2 ng/µg) ergaben einen negativen EtG-Nachweis (Fall Nr. BS090) bzw. einen Wert unter 10 pg/mg (Fall Nr. BS001 und BS056). 15 Fälle mit positivem EtG-Nachweis zeigten hingegen für beide FSEE-Parameter Werte unterhalb des Cut-offs. Der erhöhte Anteil der Fälle mit positivem EtG-Nachweis kann zumindest teilweise durch die aufgrund einer verbesserten analytischen Methodik extrem niedrige Nachweisgrenze für EtG bei dieser Untersuchungsreihe (LOD ca. 3 pg/mg) erklärt werden. Ein weiterer Grund für diese Diskrepanz kann darin gesehen werden, dass sich in dem untersuchten Probandenkollektiv mit hoher Wahrscheinlichkeit ein relativ großer Prozentsatz von Personen befand, die bezüglich ihres Alkoholkonsums im Grenzbereich zwischen Normaltrinkern und Alkoholikern lagen. Auch die Tatsache, dass in 14 der 36 Fälle die Werte für c_i-FSEE und c_i-FSEE/c_SQ bei Verwendung der Cut-offs von 1 ng/mg bzw. 2 ng/µg unterschiedliche Aussagen bezüglich der Auswertung hinsichtlich exzessiven Alkoholkonsums ergaben, kann auf diesen Umstand zurückgeführt werden.

Eine vorläufige statistische Auswertung von 18 Proben, für die bereits alle Alkoholmarker gemessen und ausgewertet wurden, ist in Tabelle 23 dargestellt. Ein Korrelationskoeffizient von 1 bzw. -1 zeigt einen perfekten linearen Zusammenhang zweier Größen mit positiver bzw. negativer Geradensteigung an, ein Wert von 0 bedeutet, dass die beiden Größen nicht miteinander korrelieren. Werte > 0,5 bzw. < -0,5 zeigen eine starke Korrelation an. Es ergab sich eine deutliche Korrelation zwischen den relativen FSEE-Konzentrationen im Haar (c_i-FSEE/c_SQ) und den Werten für Phosphatidylethanol im Blut (Pearson-Korrelation nach Normalisierung der Verteilungen: r = 0,62). Die c_i-FSEE hingegen korrelierten positiv mit den Werten für ALAT bzw. ASAT im Blut (r = 0,52 bzw. 0,75). Die Ethylglucuronid-Haarkonzentrationen schließlich zeigten eine starke Korrelation mit den GGT-Werten (r = 0,59).

Tabelle 22: FSEE-Konzentrationen (c_i-FSEE),relative FSEE- und EtG-Konzentrationen (c _i-FSEE/c_SQ und c_EtG) in Haarproben kanadischer Kfz-Führer, die alkoholisiert im Straßenverkehr aufgefallen waren. Werte für FSEE bzw. relative FSEE oberhalb des Cut-off-Wertes sind blau dargestellt.

* bei segmentweiser Untersuchung längerer Haarproben wurden die Werte aus den Segmentkonzentrationen durch gewichtete Mittelwertbildung berechnet.

n.n.: nicht nachweisbar (< LOD = 3 pg/mg).

Tabelle 23: Pearson-Korrelation zwischen allen gemessenen Größen und den 3 im Haar gemessenen Parametern c_i-FSEE, c _i-FSEE/c_SQ und c_EtG. Die Verteilung der Werte für Phosphatidylethanol, GGT, c_i-FSEE c_i-FSEE/c_SQ und c_EtG wurden vor der statistischen Analyse normalisiert, indem zu den Werten 1 addiert und die Wurzel aus dem Ergebnis gezogen wurde (n = 18).

Einschränkend ist zu bemerken, dass mit der bisher in die statistische Untersuchung einbezogenen Anzahl von Probanden (n = 18) keine zuverlässigen Schlüsse gezogen werden können und daher abzuwarten bleibt, ob sich die oben angegebenen Zusammenhänge bei Einbeziehung einer größeren Anzahl von Probanden bestätigen.

Abschließend ist aus den bisherigen Erfahrungen in der Praxis zu schließen, dass FSEE im Haar, insbesondere wenn sie auf die Squalenkonzentration im Haar bezogen werden, eine gute Alternative bzw. Ergänzung zu den bisher aus Blut bestimmten Langzeitmarkern für chronischen Alkoholabusus darstellen. Im Grenzbereich zwischen Alkoholikern und stärkeren Normaltrinkern bestehen jedoch weiterhin Probleme. Durch zusätzliche Bestimmung von Ethylglucuronid im Haar, das über einen anderen Einlagerungsmechanismus ins Haar gelangt als die FSEE (vgl. Abschnitt 4.5), kann die Aussagesicherheit bei chronischem Alkoholabusus weiter erhöht und das Auftreten falsch negativer Ergebnisse minimiert werden. Vor allem in Fällen, bei denen die Betrachtung eines isoliert erhöhten Alkoholmarkers mit geringer Spezifität (beispielsweise GGT) zu einer Benachteiligung führen kann (z. B. Fahreignungsprüfung oder Abstinenzkontrolle während einer Entzugsbehandlung), aber auch bei der Klärung der Frage, ob bei Todesfällen zu Lebzeiten chronisch exzessiver Alkoholmissbrauch vorlag (vgl. Tabelle 18 in Abschnitt 4.4), kann die Analytik auf FSEE im Haar wertvolle Hinweise liefern.

Da die Einlagerung über das Sebum den Haupteinlagerungsweg der FSEE ins Haar darstellt (vgl. Abschnitt 4.2), wurde untersucht, ob auch in den Oberflächenlipiden der Haut, die in erster Linie aus Sebum bestehen, FSEE nachzuweisen sind und ob diese ebenfalls als Alkoholmarker herangezogen werden können. Die Physiologie der Sebumproduktion wurde bereits in Abschnitt 2.2.3 beschrieben. Aus den Keratinozyten der Epidermis freigesetzte Lipide, die sich in ihrer Zusammensetzung vom Sebum unterscheiden, haben nur in Körperregionen mit geringer Sebumdrüsendichte einen signifikanten Einfluss auf die Gesamtzusammensetzung der Hautoberflächenlipide. Daher wurden zur Probennahme ausschließlich Körperregionen mit hoher Sebumdrüsendichte wie Stirn, Gesichtshaut, Schulter- bzw. Rückenpartie oder die Hautflächen der äußeren Oberarme ausgewählt.

Für die Probennahme wurden zwei Möglichkeiten in Betracht gezogen: das Abwischen der Hautoberfläche mit einem geeigneten, zuvor mit einem Lösungsmittel benetzten Wattestäbchen (Wischtest) und das Anbringen eines Pflasters auf der Haut, das für eine bestimmte Dauer getragen wird (Pflastertest).

Da bei einer solchen Art der Probennahme die Absolutmenge der abgewischten bzw. vom Pflaster aufgenommenen Lipide von Fall zu Fall stark differieren kann und einer Wägung schlecht zugänglich ist, wurde als interne Bezugssubstanz zusätzlich Squalen bestimmt. Durch Teilen der Absolutmenge der im abgewischten bzw. vom Pflaster aufgenommenen FSEE (m_FSEE in ng) durch die Absolutmenge des enthaltenen Squalens (m_SQ in µg) erhält man die relative FSEE-Konzentration m_FSEE/m_SQ (in ng/µg). Diese Größe stellt eine gute Vergleichsbasis dar, weil der Squalengehalt von Sebum unter gleichen Probennahme- und Messbedingungen nur innerhalb einer geringen Bandbreite schwankt (vgl. Abschnitt 4.4).

Zunächst wurden 29 Freiwillige in einem Fragebogen zu ihrem Trinkverhalten in den 7 Tagen vor der Probennahme und zu ihrem durchschnittlichen wöchentlichen Alkoholkonsum in den letzten Monaten befragt. Am Tag vor der Probennahme wurden die Probanden aufgefordert, an der Stirn keine Cremes, Make-up oder andere Kosmetika aufzubringen. Nach dem in Abschnitt 3.3.2 beschriebenen Verfahren wurde dann jeweils an der rechten und an der linken Seite der Stirn der Wischtest durchgeführt, separat nach der in Abschnitt 3.4.2 beschriebenen Methode aufgearbeitet und mittels HS-SPME/GC-MS auf FSEE (Ethylmyristat, Ethylpalmitat, Ethylstearat und Ethyloleat) und mit HPLC-DAD auf Squalen untersucht. Weiterhin wurden von 15 Todesfällen, die im Institut für Rechtsmedizin der Charité obduziert wurden, auf dieselbe Weise Wischproben abgenommen. Zehn dieser Fälle waren als Alkoholiker bekannt und wiesen bei der Obduktion typische alkoholbedingte Organschädigungen auf. Für sechs dieser Fälle wurde zusätzlich eine Haaranalyse auf FSEE durchgeführt, die in allen Fällen den starken Alkoholabusus bestätigte. Fünf weitere Todesfälle, die keine klaren Anzeichen eines Alkoholmissbrauchs zeigten, wurden zu Vergleichszwecken untersucht. In Abb. 43 ist jeweils ein typisches Chromatogramm für die Bestimmung der FSEE (a) und des Squalens (b) in einer Wischprobe des Alkoholikers mit der Fall-Nr. 383/03 dargestellt.

Die Squalenmengen, die in den Proben gefunden wurden, variierten stark im Bereich zwischen 6 und 295 µg. Die niedrigsten Mengen wurden in den Proben zweier Kinder gefunden (6 und 13 µg), die generell weniger Sebum produzieren als Erwachsene [220]. Die durchschnittliche Squalenmenge für die Proben der Todesfälle lag mit 130 µg deutlich über der Durchschnittsmenge, die bei den Normaltrinkern (70 µg) und den Abstinenzlern (42 µg) gefunden wurde. Diese große Variationsbreite verdeutlicht die Notwendigkeit der Einführung eines natürlichen internen Standards wie des Squalens, auf das die FSEE-Werte bezogen wurden.

In Tabelle 24 sind die Werte für m_FSEE/m_SQ mit den über einen Fragebogen erfassten Trinkmengen für die Normaltrinker und die Abstinenzler angegeben. Tabelle 25 zeigt die Ergebnisse für die Todesfälle unter Angabe der Todesursache und der postmortalen Blutalkoholkonzentration. In beiden Tabellen sind auch die auf Squalen bezogenen Haarkonzentrationen c_{i FSEE}/c_SQ angegeben, sofern sie gemessen wurden. Abgesehen von zwei Fällen (N10 und 367/03) ergab sich für die Proben von linker und rechter Stirnseite eine relativ gute Übereinstimmung der Werte (durchschnittliche Standardabweichung 16 %). Die auftretenden Schwankungen sind durch ungleichmäßige Verteilung des Sebums und durch teilweise Entfernung der Hautlipidschicht z. B. während des Schlafs durch Reibung an der Bettwäsche zu erklären. In Abb. 44 sind getrennt nach den Gruppen die Werte für m_FSEE/m_SQ der Abstinenzler (0,16-1,12 ng/µg, Mittelwert 0,34 ng/mg), der Normaltrinker (0,08-0,94 ng/µg, Mittelwert 0,37 ng/µg) und der Alkoholiker (2,4-24,2 ng/µg, Mittelwert 13,1 ng/µg) graphisch dargestellt.

	Abb. 43: Chromatogramme, die bei Messung der Hautoberflächenlipidprobe eines Alkoholikers (Fall-Nr. 383/03) erhalten wurden. (a) zeigt die Ionenspuren der GC-MS-SIM-Analyse auf FSEE. Die Signale für die deuterierten Verbindungen sind mit „(D)“ gekennzeichnet, es sind nur die Massenspuren der Molekülionen dargestellt. (b) zeigt das bei der Squalenbestimmung erhaltene HPLC-DAD-Chromatogramm. Die Probe enthielt 15 ng Ethylmyristat, 74 ng Ethylpalmitat, 43 ng Ethyloleat, 12 ng Ethylstearat und 27 µg Squalen, mFSEE/mSQ = 5,36 ng/µg.

Dass auch in den Hautlipiden von Abstinenzlern geringe FSEE-Konzentrationen zu finden sind, korrespondiert mit den Befunden in Haarproben von Abstinenzlern (vgl. Abschnitt 4.3.1), in denen ebenfalls geringe Konzentrationen an FSEE gefunden wurden. In der Gruppe der Normaltrinker konnte keine Korrelation zwischen den Werten für m_FSEE/m_SQ und der Trinkmenge in der Woche vor Probennahme oder der durchschnittlichen Trink-menge in den letzten Monaten vor der Probennahme gefunden werden. Es ist davon auszugehen, dass der Beitrag zu m_FSEE/m_SQ durch die relativ geringen Mengen konsumierten Alkohols in dieser Gruppe im Vergleich mit der Abstinenzlergruppe nicht zu einer signifi-

Tabelle 24: Relative FSEE-Konzentrationen m_FSEE/m_SQ in Hautoberflächenlipiden mit Squalen als natürlicher Bezugssubstanz, die mittels Wischtest bei Abstinenzlern und Normaltrinkern erhalten wurden im Vergleich mit den Haarkonzentrationen c_i-FSEE/c_SQ.

^a) Durchschnittlicher wöchentlicher Alkoholkonsum in den Monaten vor der Probennahme (Angabe der Probanden).

^b) Verwendung ethanolhaltiger Haarlotion.

Tabelle 25: Relative FSEE-Konzentrationen m_FSEE/m_SQ in Hautoberflächenlipiden, die mittels Wischtest bei einigen Todesfällen erhalten wurden im Vergleich mit den Haarkonzentrationen c_i-FSEE/c_SQ.