Trotz der großen Anzahl bekannter Alkoholismusmarker im Blut besteht weiterhin großes Interesse an Alkoholmarkern, die entweder eine verbesserte Sensitivität/Spezifität zeigen oder aber ein neues diagnostisches Zeitfenster besitzen. In der vorliegenden Arbeit sollten Fettsäureethylester (FSEE) im Haar und in Hautoberflächenlipiden analytisch erfasst und hinsichtlich ihrer Eignung als Marker für exzessiven Alkoholkonsum evaluiert werden.

Aus einem Literaturüberblick über mögliche Alkoholmarker im Haar und über den aktuellen Stand der Forschung zu diesen Substanzen bzw. Substanzgruppen geht hervor, dass zurzeit nur Ethylglucuronid (EtG) und FSEE hierfür von Bedeutung sind. Die bisherigen analytischen Untersuchungen an FSEE als Alkoholmarker beschränkten sich auf die Bestimmung in Blut, Körpergewebe und Meconium, wobei methodisch in der Regel Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) nach Festphasenextraktion (SPE) zum Einsatz kam.

Haar als Probenmaterial ist für die Prüfung auf einen chronischen Alkoholmissbrauch besonders geeignet, da es durch die dauerhafte Einlagerung der Marker ein sehr breites diagnostisches Zeitfenster besitzt und wegen des gleichmäßigen Wachstums prinzipiell auch eine retrospektive, zeitaufgelöste Untersuchung ermöglicht. Eine nähere Betrachtung der morphologischen und physiologischen Grundlagen des Haarwachstums und der Einlagerungswege von Substanzen ins Haar zeigt allerdings, dass vereinfachte Vorstellungen über das Haar als Zeitschreiber des Substanzmissbrauchs nur beschränkt gültig sind. Bei lipophilen Substanzen wie den FSEE spielt das Sebum bei der Einlagerung eine bedeutende Rolle, auf dessen Bildung in den Talgdrüsen daher ein besonderes Augenmerk gerichtet wurde.

Als Analysenmethoden wurden die Headspace-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) in Kombination mit der GC-MS und die Hochleistungs-Flüssigchromatographie mit Photodiodenarray-Detektor (HPLC-DAD) gewählt. Das Prinzip der HS-SPME beruht auf der Anreicherung der Analyten an einer polymerbeschichteten Quarzfaser aus dem Dampfraum über der Probe und der anschließenden Desorption im Injektorblock des Gaschromatographen. Dieses Verfahren ist besonders für die Analyse mittelflüchtiger Substanzen geeignet.

Als Referenzverbindungen wurden 36 Ethylester von Fettsäuren mit 14 bis 20 C-Atomen unter Einbeziehung verzweigter (Iso- und Anteiso-Verbindungen) und ungesättigter Säuren synthetisiert und durch die Massenspektren charakterisiert. Zur Verwendung als innere Standards wurden analog die deuterierten Ethylester (R-COO-C₂D₅) durch Veresterung mit C₂D₅OD hergestellt.

Es wurde ein auf HS-SPME und anschließender GC-MS basierendes analytisches Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe die 36 FSEE zusammen mit den deuterierten Analoga dieser Verbindungen in einem Analysengang bei hoher Empfindlichkeit und Selektivität gemessen werden können. Die direkte HS-SPME der Haarproben erwies sich für die Bestimmung der FSEE als ungeeignet. Daher wurden verschiedene der HS-SPME vorgeschaltete Extraktionsverfahren untersucht. Dabei ergab die 15-stündige Extraktion mit einem zweiphasigen, aus 2 ml n-Heptan und 0,5 ml DMSO bestehenden Gemisch bei 25°C nach Zusatz der deuterierten Standards die beste absolute Extraktionsausbeute bei guter Reproduzierbarkeit. Die Heptanphase wurde eingedampft und der Extrakt mit der optimierten HS-SPME-Methode gemessen.

Die Optimierung der HS-SPME-Methode ergab die folgenden experimentellen Parameter: Zusatz von 1 ml Phosphatpuffer pH 7,6 und 0,5 g NaCl zum Extraktionsrückstand, SPME-Temperatur 90°C, SPME-Dauer 30 min, Desorptionsdauer 5 min, Verwendung einer mit Polydimethylsiloxan (PDMS) und Partikeln aus Divinylbenzol (DVB) beschichteten SPME-Faser.

Weiterhin wurde ein HPLC-DAD-Verfahren zur Bestimmung des Squalengehaltes der Proben entwickelt, das sich durch eine hohe Empfindlichkeit bei großer Robustheit der Methode auszeichnet. Squalen wurde als natürliche Bezugssubstanz für die FSEE gewählt. Die analytischen Methoden wurden kalibriert und nach den Richtlinien der GTFCh validiert.

Die Untersuchung von 13 Alkoholikerhaarproben auf alle 36 FSEE ergab die Anwesenheit von 15 dieser Verbindungen, darunter neben sieben unverzweigten gesättigten Estern mit geradzahliger und ungeradzahliger Kohlenstoffanzahl auch zwei in Anteiso- und vier in Iso-Position verzweigte sowie ein einfach ungesättigter und ein doppelt ungesättigter Ester. Für die weiteren Untersuchungen wurden die vier in der höchsten Konzentration vorkommenden Ester Ethylmyristat (C14-Et), Ethylpalmitat (C16-Et), Ethyloleat (C18Δ⁹-Et) und Ethylstearat (C18-Et) ausgewählt und zunächst deren Konzentrationssumme c_i-FSEE als Grundlage für die Zuordnung zu den Konsumentengruppen herangezogen. Für diese vier Ester ergaben sich Nachweisgrenzen zwischen 6 und 35 pg/mg und für Squalen eine Nachweisgrenze von 3 ng/mg. Für alle Analyten wurden im relevanten Konzentrationsbereich Kalibrationsfunktionen mit exzellenter Linearität erhalten.

Mit dem Verfahren wurden insgesamt 163 Haarproben von Abstinenzlern, Normaltrinkern, Patienten in der Alkoholentzugsbehandlung und Todesfällen mit bekanntem Alkoholmissbrauch zu Lebzeiten untersucht. Dabei wurden in allen Fällen FSEE festgestellt, wobei die Konzentration der aus dem Haar extrahierten FSEE (c_i-FSEE) bei Abstinenzlern 0,02 bis 1,21 ng/mg (n = 18, Mittelwert 0,27 ng/mg), bei Normaltrinkern 0,08 bis 1,96 (n = 33, Mittelwert 0,47 ng/mg), bei den Patienten in Entzugsbehandlung 0,20 bis 20,48 ng/mg (n = 47, Mittelwert 2,65 ng/mg) und bei den Todesfällen mit bekanntem Alkoholmissbrauch zu Lebzeiten 0,22 bis 30,60 ng/mg (n = 65, Mittelwert 4,98 ng/mg) betrug. Aus den Untersuchungen geht hervor, dass für c_i-FSEE ein Cut-off von 1 ng/mg geeignet ist, um zwischen Normaltrinkern auf der einen und exzessiven Alkoholkonsumenten auf der anderen Seite zu unterscheiden. Ein Wert von 0,4 ng/mg kann als obere Grenze für Abstinenzler gelten. Es zeigte sich, dass die FSEE-Konzentrationen im Haar neben dem Trinkverhalten auch durch haarkosmetische Behandlungen beeinflusst werden und dass auch Scham-, Achsel-, Bart-, oder Körperhaare zur Analyse herangezogen werden können, falls kein Kopfhaar zur Verfügung steht.

Durch segmentweise Untersuchungen der Haarproben und Vergleich mit dem zeitlichen Verlauf des Trinkverhaltens sowie durch Einbeziehung der Squalenkonzentrationen konnte gezeigt werden, dass unter den verschiedenen grundsätzlich möglichen Einlagerungsmechanismen für die Einlagerung der FSEE ins Haar der Route über das Sebum die mit Abstand größte Bedeutung zukommt. Die Ergebnisse der Untersuchungen von Sebum, das mit n-Heptan von der Haaroberfläche abgewaschen wurde (externe FSEE, kurz e-FSEE) oder durch Pflaster- und Wischtests von der Haut in Form von Hautoberflächenlipiden gewonnen wurde, bestätigten dies.

Durch Einbeziehung der Squalen-Haarkonzentration c_SQ in die Bewertung durch Bildung relativer FSEE-Konzentrationen c_i-FSEE/c_SQ wurde erreicht, dass Fälle, in denen es aufgrund von Stoffwechselstörungen oder veränderter Lipid-Aufnahmekapazität des Haares zu erhöhten bzw. erniedrigten FSEE-Werten kam, richtig zugeordnet werden konnten. Für diese auf den Squalengehalt des Haars bezogenen relativen FSEE-Konzentrationen wurde ein Grenzwert von 2 ng/µg vorgeschlagen. Bei Werten, die oberhalb dieses Wertes liegen, kann mit relativ hoher Sicherheit von exzessivem Alkoholkonsum ausgegangen werden.

Aus der Untersuchung von 28 Haarproben auf FSEE und Ethylglucuronid (EtG) ging hervor, dass beide Parameter grundsätzlich als Alkoholmarker im Haar geeignet sind, aber aufgrund der unterschiedlichen Einlagerungswege der Substanzen nicht quantitativ korrelieren. Durch Messung beider Parameter kann die Aussagesicherheit hinsichtlich der Diagnose von chronischem Alkoholmissbrauch verbessert werden.

Im Vergleich mit gängigen Blutmarkern wie Leberenzymaktivitäten, dem Carbohydrate-Deficient Transferrin (CDT), dem mittleren korpuskularen Erythrozytenvolumen (MCV) oder Phosphatidylethanol ergab sich, dass FSEE im Haar als Alkoholmarker eine zumindest vergleichbar hohe Sensitivität und Spezifität aufweisen, sich aber durch ein verbreitertes diagnostisches Zeitfenster auszeichnen. Allerdings ist die Gefahr falsch positiver Ergebnisse bei häufigem Kontakt der Haare oder der Kopfhaut mit ethanolhaltigen Flüssigkeiten zu berücksichtigen. Die Erprobung der Methode in der forensischen Praxis, z. B. in der Fahreignungsprüfung, zeigte, dass die Methode bei Fällen, bei denen andere Marker zweifelhafte oder widersprüchliche Ergebnisse liefern, eine wertvolle Hilfe sein kann. Eine weitere wichtige Anwendung besteht in der postmortalen Untersuchung von Haarproben, da bei Todesfällen die gängigen Alkoholmarker im Blut aufgrund von Hämolyse in der Regel nicht mehr messbar sind. Einer breiten Anwendung steht bislang der hohe experimentelle Aufwand und damit der relativ hohe Preis entgegen.

Erste Versuche zur Bestimmung von relativen FSEE-Konzentrationen in Hautoberflächenlipiden, bei denen neben mit Wattestäbchen durchgeführten Wischtests auch Pflastertests zum Einsatz kamen, zeigten, dass diese ebenfalls grundsätzlich zum Nachweis von Alkoholmissbrauch geeignet sind. Die m_FSEE/m_SQ-Werte fallen für die verschiedenen Konsumentengruppen in ähnliche Bereiche wie die c_i-FSEE/c_SQ-Werte im Haar. An insgesamt drei Fällen wurden mit Hilfe der Wischtests nach einer einmaligen, größeren Alkoholdosis, die nach einer längeren Abstinenzphase aufgenommen wurde, Untersuchungen zur Kinetik der Ausscheidung von FSEE durch die Haut durchgeführt. Danach sollte ein chronischer Alkoholmissbrauch durch Wischtests bis ca. 14 Tage nach Abstinenzbeginn erkennbar sein.