Characterization of the specificity of human neutrophil elastase for Shigella flexneri virulence factors

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin
Petra Averhoff
geb. 19.09.1972 in Hamburg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan: der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. R. Lucius
2. Prof. A. Zychlinsky.
3. Y. Weinrauch, PhD

Tag der mündlichen Prüfung: 24. Mai 2006

Zusammenfassung

Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A).

Der Grund für die spezifische Aktivität von NE gegenüber diesen Faktoren ist bisher nicht bekannt. Unsere Analyse impliziert, dass die Primärstruktur von IpaB keine Rolle für die Spezifität von NE spielt. Eine Reihe von IpaB Mutanten, welche Deletionen u.a. in der coiled-coil Region sowie der möglichen Transmembrandomänen enthielten, wurden von NE genauso abgebaut wie wildtyp IpaB. Des Weiteren scheint auch die Sekundär- und Tertiärstruktur des Substrats nicht ausschlaggebend für die Erkennung durch NE zu sein, da denaturiertes IpaB ebenfalls von NE abgebaut wurde.

NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt.

Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren.

Eigene Schlagworte: Neutrophile Elastase, Shigella flexneri , Spezifität, Virulenzfaktoren

Abstract

Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella.

The structural basis of the exquisite sensitivity of virulence proteins to NE is not known. Our analysis suggests that the primary structure of IpaB is not important for NE specificity. Using a series of IpaB mutants that contained deletions in the coiled-coil region, as well as in the putative transmembrane domains of the hydrophobic region, we observed that the susceptibility of the IpaB mutants to NE was similar to that of the wildtype IpaB. Secondary or tertiary structures of the substrate are also unlikely to play a role in the recognition of virulence factors by NE since heat-denatured and native IpaB were equally well targeted by NE.

NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

Keywords: neutrophil elastase, Shigella flexneri , Specificity, virulence factors

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