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Methodik

In der vorliegenden Arbeit wurden drei wesentliche Methoden angewandt: Zunächst wurden Computersimulationen benutzt, um hypothetische Zusammenhänge zwischen der Füllung und der Dynamik synaptischer Vesikel zu modellieren und experimentell prüfbare Vorhersagen zur Unterscheidung verschiedener Fälle zu machen. Anschliessend wurden einige dieser Vorhersagen durch patch-clamp Untersuchungen am akuten Hirnschnitt junger Ratten geprüft. Und schliesslich wurde eine neue Methode entwickelt, um spontane Vesikelfreisetzungen (und deren Modulation über Autorezeptoren) direkt durch funktionelle Bildgebung mittels Zwei-Photonen Mikroskopie zu untersuchen.

Im Computermodell wird vereinfachend angenommen, dass synaptische Vesikel sich in drei grosse Gruppen unterscheiden lassen: Zunächst eine Population von an der präsynaptischen Membran „gedockten“ Vesikeln, von denen eines oder mehrere nach Eintreffen eines Aktionspotentials (und mit einer sehr geringen Rate auch spontan) mit der Membran verschmilzt und seinen Inhalt freisetzt. Diese Population wird auch als „RRP“ („readily releasable pool“) bezeichnet ((19). Die Freisetzungshäufigkeit von Vesikeln hängt von der Größe des RRP ab. Der RRP erhält Nachschub aus einer zweiten, deutlich größeren Population von Reserve-Vesikeln. Diese Reservepopulation wiederum speist sich aus einer Population von leeren Vesikel, die zuvor fusioniert haben und mit einer bestimmten Rate „recycelt“ werden. In diesem Kreislauf können sowohl die Reserve-Vesikel als auch Vesikel im RRP mit Transmitter gefüllt werden; diese Füllung hängt ab von der synaptischen Transmitterkonzentration.

Ein Zusammenhang zwischen Transmitterkonzentration und vesikulärer Freisetzungsrate setzt nun voraus, dass entweder die Freisetzungsrate selbst oder der Nachschub aus der Reservepopulation in den RRP von der Transmitterkonzentration abhängt. Das Modell besteht aus einem System von drei gekoppelten partiellen Differentialgleichungen (eine für jede Population), die soweit möglich analytisch gelöst und ansonsten numerisch durch Monte-Carlo Simulationen mit MATLAB berechnet wurden. Abbildung 1 (modifiziert nach Abb. 8 in ((1)) zeigt schematisch das Modell des präsynaptischen Vesikelzyklus sowie die Rückwirkung von GABA auf präsynaptische Autorezeptoren.

Abbildung 1: (modifiziert nach Abb. 8 in ((1)): Vesikelzyklus und Rückwirkung von GABA auf präsynaptische Autorezeptoren.

In den Patch-Clamp Messungen wurden horizontale Schnitte (200 µm) des Gehirns junger (9-14 Tage) Ratten angefertigt. Diese wurden für 30 min. in eiskalter Sucroselösung und anschliessend in Ringerlösung aufbewahrt. Messungen wurden mit einem EPC-7 Verstärker unter visueller Kontrolle mit einem aufrechten Mikroskop unter Verwendung von DIC durchgeführt. Durch die Öffnung von GABA-Rezeptoren ausgelöste Chloridströme (IPSCs, inhibitory postsynaptic currents) wurden in der whole-cell Konfiguration am Soma von Pyramidenzellen in der CA3-Region des Hippocampus gemessen. Eingangs- und Serienwiderstand wurden regelmässig [Seite 6↓]kontrolliert. Zur Auslösung von aktionspotentialabhängigen IPSCs wurde zusätzlich eine extrazelluläre Stimulationselektrode in der Nähe des Soma der gemessenen Zelle platziert. In Experimenten zur Messung einer möglichen Desensitisierung postsynaptischer Rezeptoren wurde GABA durch hohen Druck lokal in der Nähe des Soma der gemessenen Zelle appliziert. Während der Messung von spontanen (miniature) mIPSCs wurden Aktionspotentiale durch 1 µmol Tetrodotoxin blockiert. MIPSCs wurden durch eine automatische Schwellendetektion mit Hilfe der Strathclyde Software (J. Dempster, Universität von Glasgow, Schottland) ausgewertet und anschliessend visuell nachkontrolliert. In allen Experimenten wurden glutamaterge Synapsen durch 30 µmol CNQX und 30 µmol ±APV und GABAB Rezeptoren durch 2 µmol CGP 55845A blockiert. Für statistische Tests wurde SPSS verwendet.

Für Fluoreszenzuntersuchungen wurde durch eine hochosmolare (800 mosmol) Sucroselösung eine Fusion aller Vesikel des RRP bewirkt. Dadurch sind die Vesikelmembranen zugänglich zum Extrazellulärraum und binden an FM 1-43, das über eine Dauer von 7 min. eingewaschen wird. Anschliessend werden die Vesikel spontan re-endozytiert, so dass der Farbstoff in den vesikulären Membranen erhalten bleibt, da diese keinen Kontakt zum Extrazellulärraum mehr haben; aus allen anderen Membranen wird er anschliessend über eine Dauer von 35 min. ausgewaschen (ein Schema des Protokolls ist in Abb. 1 in ((2) gegeben). Danach habe ich während einer Dauer von 40 min. die spontane Fluoreszenzabnahme in synaptischen Terminalen gemessen. Diese Fluoreszenzabnahme kommt durch die spontane Fusion von Vesikeln mit der synaptischen Membran und nachfolgende Diffusion des Fluoreszenzfarbstoffs in den Extrazellulärraum zustande. Diese Fluoreszenzabnahme in den „regions of interest“, den synaptischen Boutons, wurde in bezug auf das allgemeine Ausbleichen der Fluoreszenz in Kontrollregionen (durchschnittlich 0.2% / min.) normiert.


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08.06.2005