Ergebnisse

Zunächst habe ich durch Computersimulationen ein Modell der Füllung und Dynamik synaptischer Vesikel aufgestellt und nach Bedingungen gesucht, unter denen die experimentell gemessenen Beziehungen zwischen präsynaptischer Transmitterkonzentration und Transmitterfreisetzung („Amplitudeneffekt“ und „Frequenzeffekt“, s.o.) reproduziert werden können.

Eine erhöhte präsynaptische Transmitterkonzentration erhöht (sofern der vesikuläre Transporter nicht gesättigt ist) die vesikuläre Transmitterkonzentration. Um einen Frequenzeffekt zu reproduzieren, ist es prinzipiell nötig anzunehmen, dass ein Schritt innerhalb des Vesikelkreislaufs vom vesikulären Füllungszustand abhängt. Dabei kann man zwei Fälle unterscheiden: (1) Die Freisetzungsrate aus der Population freisetzbarer Vesikel („RRP“ für „readily releasable pool“) hängt vom Füllungszustand der Vesikel ab; (2) der Nachschub aus dem Reservepool in den RRP hängt vom Füllungszustand der Vesikel ab. (Die Endozytose von mit der Membran fusionierten Vesikeln kann natürlich nicht von deren Füllungszustand abhängen, da sie leer sind.) Für beide Fälle habe ich numerische Simulationen unter der Annahme realistischer Parameter für die Anzahl der Vesikel, die Übergangsraten, die präsynaptische Transmitterkonzentration und deren Füllungsgeschwindigkeit in die Vesikel durchgeführt (siehe Abb. 4 in ((1)).


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Abbildung 2: (modifiziert nach Abb. 5 in ((1)): Eine Abhängigkeit der Freisetzungsrate von der vesikulären Transmitterkonzentration (links) führt zu einer deutlich geringeren Erhöhung der Vesikelfreisetzung, wenn die GABA-Konzentration erhöht wird, als eine Abhängigkeit der Nachschubrate von der vesikulären Transmitterkonzentration (rechts).

Diese Simulationen haben ergeben, dass eine 10-fache Erhöhung der präsynaptischen Transmitterkonzentration (vermutlich mehr, als experimentell erreichbar ist) einen Frequenzeffekt von 20% für den Fall einer Abhängigkeit der Freisetzungrate vom vesikulären Füllungszustand hat (Fall 1; s. Abb. 2 (links) in der Zusammenfassung und Abb. 5b in ((1)), jedoch einen Frequenzeffekt von 100%, falls der Nachschub in den RRP vom vesikulären Füllungszustand abhängt (Fall 2; s. Abb. 2 (rechts) in der Zusammenfassung und Abb. 5d in ((1)). Diese Ergebnisse konnten durch analytische Näherungen bestätigt werden. Sie erklären sich daraus, dass im Vesikelzyklus im Gleichgewicht (d.h. wenn die Größe der einzelnen Populationen über die Zeit konstant bleibt) der Fluss (Populationsgröße multipliziert mit Abflussrate aus der betreffenden Population) von jeder Population in die nächste gleich ist. Da die Reservepopulation sehr viel größer ist als die beiden anderen Populationen, ist die Abflussrate aus ihr entsprechend kleiner. Daher hat eine Erhöhung dieser Rate einen stärkeren Einfluss als eine Erhöhung der ohnehin höheren Abflussrate aus dem RRP. Da in Vorarbeiten (in kultivierten Hirnschnitten) ein Frequenzeffekt von ungefähr 100% gemessen worden war ((6), schliesse ich, dass vermutlich der Vesikelnachschub, und nicht nur die Vesikelfreisetzung selbst, durch den vesikulären Füllungszustand beeinflusst wird.

Wie kann diese Hypothese geprüft werden? Weder die Rate des Vesikelnachschubs noch die Freisetzungsrate können direkt gemessen werden, sondern nur der Fluss von einer Population in die nächste. Eine Erhöhung des Vesikelnachschubs führt zu einem größeren RRP, eine Erhöhung der Vesikelfreisetzung zu einem kleineren (siehe Abb. 5a und c in ((1)). Die Größe des RRP wiederum bestimmt das Maß der Kurzzeit-Depression einer Synapse: Je größer der RRP ist, desto resistenter ist die Synapse gegenüber hochfrequenter Stimulation. Ein Vergleich der Kurzzeit-Depression vor und nach Erhöhung der präsynaptischen Transmitterkonzentration kann also zeigen, ob es zu einer Erhöhung des Vesikelnachschubs oder der Freisetzungsrate gekommen ist (siehe Tafel 1 in ((1)).

Auch wenn die Simulationen im wesentlichen den Fall einer positiven Beziehung zwischen präynaptischer Transmitterkonzentration und Vesikelfreisetzung betreffen, ist das Modell auch für den entgegengesetzten Fall anwendbar, d.h. für eine verringerte Freisetzung von volleren Vesikeln. Dies ist auch tatsächlich gemessen worden, wenn die GABA-Konzentration nicht in kultivierten, sondern in frischen Hirnschnitten erhöht wurde ((16, Abb. 5 in ((3)). Simulationen zu diesem Fall zeigen, dass weiterhin ein Effekt auf den Vesikelnachschub deutlich stärker ausgeprägt ist als auf die Freisetzungrate, allerdings ist der Unterschied geringer.

Die zweite zentrale Fragestellung an das Modell betraf nicht den Ort, sondern den Mechanismus eines Effekts des vesikulären Füllungszustandes auf die Dynamik des Vesikelzyklus. Auch hier sind wiederum zwei Möglichkeiten denkbar: Entweder beeinflusst eine erhöhte Füllung eines Vesikels direkt den Transport dieses Vesikels (etwa durch veränderte pH-Gradienten über der Vesikelmembran oder durch eine vergrößerte Oberfläche des Vesikels), oder aber der vesikuläre Transmittergehalt wird erst freigesetzt und modifiziert dann (z.B. durch Stimulation präsynaptischer Autorezeptoren) die Dynamik nachfolgender Vesikel (siehe Abb. 8 in ((1)). Numerische Simulationen dieser beiden Fälle führten auch hier zu unterschiedlichen, [Seite 8↓]experimentell prüfbaren Vorhersagen: Da ein Effekt über präsynaptische Autorezeptoren von der vorhergehenden Freisetzung von Vesikeln abhängt, sollte er deutlich vermindert sein, wenn diese Freisetzung z.B. durch vorhergehende hochfrequente Stimulation ausfällt. Ein „direkter“ Mechanismus dagegen ist unabhängig von einer vorhergehenden Freisetzung, da er nicht von der Stimulation von Rezeptoren abhängt (siehe Tafel 1 in ((1)).

Die Aktivierung präsynaptischer GABA-Rezeptoren durch freigesetztes GABA kann experimentell dadurch nachgeahmt werden, dass man diese Rezeptoren pharmakologisch stimuliert. Da der Frequenzeffekt unter Bedingungen gemessen worden war, bei denen metabotrope GABAB Rezeptoren blockiert waren, kommen nur ionotrope (GABAA) Rezeptoren in Frage.

Um Veränderungen der Freisetzungswahrscheinlichkeit synaptischer Vesikel durch Aktivierung von GABAA Rezeptoren zu messen, habe ich zunächst durch extrazelluläre Stimulation Vesikelfusionen hervorgerufen und den Effekt des freigesetzten GABA durch whole-cell patch-clamp Messungen der Somata von CA3 Pyramidenzellen gemessen. Unter Kontrollbedingungen habe ich nach Stimulation eine Antwortwahrscheinlichkeit von ca. 75% gemessen (n = 9 Zellen). Nach Aktivierung von GABAA Rezeptoren durch Applikation von Muscimol (1 μmol, 1 min) kam es zu einer signifikanten (p < 0.01) Verringerung der Antworthäufigkeit (siehe Abb. 1 in ((3)). Dieser Effekt kann prinzipiell durch mehrere Mechanismen erklärt werden: (1) Verringerung der Freisetzungswahrscheinlichkeit an synaptischen Terminalen, (2) Shunt der axonalen Weiterleitung von Aktionspotentialen, (3) Desensitisierung postsynaptischer GABAA Rezeptoren.

Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, habe ich Aktionspotentiale durch TTX blockiert und unter diesen Bedingungen die Frequenz spontaner Transmitterfreisetzungen durch Messung von mIPSCs vor und nach Applikation von Muscimol bestimmt. Es zeigte sich, dass die Applikation von Muscimol zu einer deutlichen Abnahme der Frequenz der mIPSCs von 70.9 ± 14.1/min auf 30.7 ± 5.2/min führt (n = 12; p < 0.01; siehe Abb. 3 in der Zusammenfassung und Abb. 2a, b und d in ((3)). Dadurch ist ausgeschlossen, dass der Effekt von Muscimol auf die Freisetzungswahrscheinlichkeit synaptischer Vesikel ausschliesslich durch eine Blockade der axonalen Fortleitung von Aktionspotentialen zustande kommt.

Abbildung 3: (modifiziert nach Abb. 2d aus ((3)): Verringerung der mIPSC Frequenz nach Applikation von Muscimol (1µmol, 1 min).

Allerdings bewirkt die Applikation von Muscimol auch eine tonische Aktivierung von postsynaptischen GABAA Rezeptoren. Diese Aktivierung führt unmittelbar nach Applikation zu einem um 47 ± 15% erhöhten Rauschen, das sensitiv auf den GABAA Rezeptor-Antagonisten Bicucullin reagiert und nach 5 min. wieder auf Kontrollwerte zurückgekehrt ist (siehe Abb. 2f in ((3)). Zu diesem Zeitpunkt ist die Frequenz der mIPSCs jedoch weiterhin reduziert, so dass die Frequenzabnahme nicht durch eine erschwerte Detektion der mIPSCs bei erhöhtem Rauschen erklärt werden kann (siehe Abb. 3 in der Zusammenfassung und Abb. 2d in ((3)). Tonische [Seite 9↓]Aktivierung von GABAA Rezeptoren kann prinzipiell zu Desensitisierung führen; auch dies kann eine scheinbar verringerte Freisetzung vortäuschen. Desensitisierung der postsynaptischen Rezeptoren würde zu einer Verringerung der mIPSC-Amplituden führen; diese waren unter meinen experimentellen Bedingungen jedoch stabil (n = 12, p > 0.2; siehe Abb. 2e, g in ((3)). Ein weiterer Test bezüglich einer möglichen Desensitisierung sind Experimente, bei denen eine definierte Konzentration von GABA (100µmol) lokal durch Druckluft appliziert wird; eine konstante Amplitude der Antwort spricht für eine gleichbleibende Anzahl an aktivierbaren (nicht desensitisierten) GABA-Rezeptoren. Tatsächlich habe ich festgestellt, dass vor und nach der Applikation von Muscimol die Amplitude der Antwort auf Applikationen von GABA konstant ist (n = 5, p > 0.05; siehe Abb. 3 in ((3)).

In einer abschliessenden Reihe von Experimenten habe ich substanzspezifische Effekte von Muscimol durch Applikation eines anderen GABAA Rezeptor-Agonisten, Isoguvacine, ausgeschlossen. Applikation von 10 µmol Isoguvacine für 10 min bewirkt ebenfalls eine signifikante Verringerung der mIPSC-Frequenz um 69% (n = 5, p < 0.05; siehe Abbildung 4 in ((3)).

Damit habe ich deutliche Hinweise darauf, dass freigesetztes GABA durch Aktivierung von präsynaptischen GABAA Rezeptoren eine negative Rückkopplung auf die weitere Freisetzung GABAerger Vesikel ausübt. Ein prinzipielles Problem der bisherigen Messungen ist jedoch, dass die Freisetzung von Vesikeln nie direkt, sondern stets nur über den Effekt des vesikulären Transmitters auf postsynaptische Zellen gemessen werden konnte. Darüberhinaus ist sogar derselbe Rezeptortyp, nämlich GABAA Rezeptoren, nicht nur für die vermutete negative Rückkopplung an der Präsynapse verantwortlich, sondern dient auch an der postsynaptischen Seite zur Detektion der Transmitter-Freisetzungen (als mIPSCs). Jede Beeinflussung der präsynaptischen GABAA Rezeptoren modifiziert damit zugleich die postsynaptischen GABAA Rezeptoren. Daher habe ich nach einer Methode zur direkten Messung von präsynaptischen Vesikelfusionen gesucht. Es ist bekannt, dass Fluoreszenzfarbstoffe wie FM 1-43 in Verbindung mit konfokaler oder Zwei-Photonen Mikroskopie benutzt werden können, um in Hirnschnitten Vesikelfusionen während extrazellulärer Stimulation zu messen ((13,(18,(22). Bisher wurde jedoch noch nie der Versuch unternommen, spontane Vesikelfreisetzungen in Hirnschnitten zu messen. Unter Verwendung des Protokolls von Stanton et al. 2001 ((22) gelang dies ((2). Zuerst habe ich gezeigt, dass der Effekt von Muscimol auf die vesikuläre GABA-Freisetzung auch unter Bedingungen einer erhöhten extrazellulären K+-Konzentration besteht, was tatsächlich der Fall war (siehe Abb. 2 in ((2)). Eine erhöhte K+-Konzentration bewirkt (bei Blockade von Natriumkanälen durch 1 µmol TTX) eine erhöhte vesikuläre Freisetzung, welche es erleichtert, Effekte auf diese Freisetzung zu detektieren. Unter dieser Bedingung habe ich die Fluoreszenzabnahme von FM 1-43 gemessen, was spontanen Vesikelfreisetzungen entspricht. In ACSF mit einer K+-Konzentration von 3 mM (Kontrolle) betrug die Fluoreszenzabnahme (normiert für unspezifisches Ausbleichen) 2.55 ± 1.8%/10 min, während sie in ACSF mit einer erhöhten K+-Konzentration von 15 mM auf 4.64 ± 1.0%/10 min erhöht war. Über eine Versuchsdauer von 40 min. kam es im ACSF mit erhöhter K+-Konzentration von 15 mM zu einer nahezu linearen Abnahme der Fluoreszenz um insgesamt ca. 20%. Applikation von 1 μmol Muscimol über 10 min. verringerte diese Abnahme signifikant um 58% (jeweils n = 6 Hirnschnitte unter Kontrollbedingungen und in Experimenten mit Muscimol-Applikation, pro Hirnschnitt ca. 13 regions of interest, p < 0.05; siehe Abb. 4 und Abb. 3 in ((2)).


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Abbildung 4: (modifiziert nach Abb. 3 in ((2)): Konstante Fluoreszenzabnahme unter Kontrollbedingungen (links), signifikant verringerte Fluoreszenzabnahme nach Applikation von Muscimol (rechts).

Ein Nachteil der Fluoreszenzmessungen besteht darin, dass FM 1-43 sowohl an GABAerge als auch an glutamaterge Vesikel bindet. Aus früheren Arbeiten ist jedoch bekannt, dass GABAerge Vesikel näher am Soma als glutamaterge Vesikel gelegen sind und dass GABAerge Vesikel mit einer höheren Rate spontan fusionieren ((21). Die oben erwähnten Daten betreffen daher nur perisomatische synaptische Terminale bis zu einer Distanz von ca. 50 μm vom Soma in der Pyramidenzellschicht. Eine Analyse von distaleren synaptischen Terminalen ergab, dass diese eine signifikant geringere Fluoreszenzabnahme von lediglich ca. 10% in 40 min. zeigten (n = 12, p < 0.05; Abb. 4 in ((2)); darüberhinaus wurde ihre Fluoreszenzabnahme nicht durch Applikation von Muscimol beeinflusst (n = 6, p > 0.5). Diese Daten weisen darauf hin, dass präsynaptische GABAA Rezeptoren tatsächlich spezifisch an GABAergen Synapsen lokalisiert sind.


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08.06.2005