Molecular and immunological characterisation of
Acanthocheilonema viteae chitinase

Dissertation

zur Erlangerung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von Babila Julius Tachu
(M.Sc. Biochemistry)
geboren am 14.02.74 in Limbe (Victoria), Kamerun

Prof. Dr. Hans Jürgen Prömel
Präsident in Vertretung der Humboldt-Universität zu Berlin

Dekan: Prof. Thomas Buckhout, PhD
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Gutachter:
1. Prof. Dr. Richard Lucius
2. Prof. Dr. Wolfgang Höhne
3. Prof. Dr. Rainer Borriss

Tag der Einreichung: 29.11.2005

Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2006

Dedication

This work is dedicated to:

Elizabeth Abimwoe and the one born after she transisted

Feh Susanna

Jeremiah Tchinda and Tanyi-Mbombo

Summary

Chitinases are enzymes that break down chitin, a homopolymer of N-acetylglucosamine (GlcNAc) to its monomers. They are important molecules in the life cycle of parasitic nematodes representing important drug and vaccine targets. In this thesis, three genomic chitinase sequences (I, II and III) were obtained by characterising nine clones from a genomic library of Acanthocheilonema viteae. Southern blots independently confirmed the existence of three chitinase genes in A. viteae. The organisation of all three genomic sequences is similar, with the greatest difference occurring in exons encoding the serine-threonine rich domain of chitinases: this domain is about ten times larger in sequence III compared to I, but is absent in sequence II. Sequence I and III had features of regularly transcribed genes: start ATG, followed by an open reading frame, stop codon and polyadenylation signal. Sequence II lacked the first exon with start ATG. Screening of cDNA libraries from adult female A. viteae worms and L3 (third-stage larvae), respectively, as well as reverse transcriptase PCR (RT-PCR) showed transcripts in uterine microfilariae, L3 and L4 (fourth-stage larvae) for gene I only.

The N-terminal fragment of A. viteae chitinase was cloned into an expression vector and expressed in Escherichia coli. About 80% of the expressed chitinase were found in inclusion bodies and were purified under denaturing conditions. The soluble fraction was about 20% and could be purified under native conditions. Chitinase purified from inclusion bodies was 13-fold less active compared to soluble chitinase.

Synthetic peptides (P1 and P2) were designed from the active site of A. viteae chitinase, and used in parallel with chitinase from inclusion bodies in vaccination experiments using the A. viteae / Meriones unguiculatus filariasis model. Vaccination with recombinant protein led to a 29 % significant reduction in adult worm burden in a single experiment. Vaccination with P1 and P2 led to an overall non significant reduction in adult worm burden in two independent experiments. In the P1 group, there was a consistent reduction (39%, p>0.05 and 45%, p<0.05) in mf load that attained significance only in the second experiment. In the P2 group, there was no reduction in mf burden in the first experiment, but a significant reduction (75%, p<0.05) in the second.

These results suggest that filarial chitinases are potential targets for transmission blocking drugs and vaccines.

Keywords: Acanthocheilonema viteae, Chitinase genes, Immunisation, Filariasis

Zusammenfassung

Chitinasen sind Enzyme, die Chitin, ein Homopolymer des N-Acetylglucosamin (GlcNAc) in seine Monomere spalten. Diese sind wichtige Moleküle im Lebenszyklus der parasitischen Fadenwürmer, welche bedeutende Medikamenten- und Impfstoffziele darstellen. In der vorliegenden Arbeit wurden durch die Charakterisierung von 9 Klonen aus einer Genbank von Acanthocheilonema viteae drei genomische Chitinasesequenzen (I, II und III) gefunden. Diese Anzahl an Chitinasegenen wurde durch Southern-Blots bestätigt. Der Aufbau aller drei Sequenzen ist sehr ähnlich. Die größten Unterschiede sind in den Exons zu finden, welche die Serin-Threonin-reiche Domäne der Chitinasen codieren. Diese Domäne ist in Sequenz III ca. 10fach länger als in Sequenz I. In Sequenz II ist sie nicht vorhanden. Sequenz I und III hatten Eigenschaften eines regulär transkribierten Genes: eine Startcodon, gefolgt von einem offener Leserahmen, einem Stopcodon und einem Polyadenylierungssignal. Sequenz II fehlt das erste Exon mit dem Startcodon. Bei Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek adulter A. viteae Würmer bzw. L3 Stadien, sowie durch Reverser Transkriptase-PCR (RT-PCR) wurden in den Mikrofilarien, L3 und L4 Transkripte für Gen I gefunden, jedoch nicht für Gen III.

Das N-terminale Fragment der A. viteae-Chitinase wurde in ein Expressionsplasmid ligiert und in E. coli exprimiert. Ungefähr 80 % der exprimierten Chitinase lagen in Einschluss-Körpern vor. Dieser Anteil konnte unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt werden. Der lösliche Anteil konnte unter nativen Bedigungen aufgereinigt werden. Die aus den Einschluss-Körpern aufgereinigte Chitinase zeigte im Vergleich zur löslichen Chitinase eine 13fach verminderte Aktivität.

Vom aktiven Zentrum der Chitinase wurden Peptide synthetisiert. Diese wurden parallel mit Chitinase aus den Einschluss-Körpern für Vakzinierungsexperimente im A. viteae / Meriones unguiculatus-Filarien-Modell genutzt. Die Reduzierung der Wurmlast um 29 % nach einer Immunisierung mit rekombinantem Protein zeigte eine tendenziell schützende Kapazität des verwendeten Proteins. In zwei unabhängigen Experimenten konnte nach Immunisierung mit zwei synthetischen Peptiden (P1 und P2) eine bedeutende Reduktion der Wurmlast beobachtet werden. In der P1-Gruppe gab es eine gleichmäßige Reduktion der Mf-Last, die nur im zweiten Experiment signifikant war (39 %, p > 0,05 und 45 %, p < 0,05). In der P2-Gruppe konnte in einem von zwei Experimenten eine signifikante Reduktion der Mf-Last erzielt werden (75 %, p < 0,05).

Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß Filarien-Chitinasen potenzielle Ziele für Medikamente und Impfstoffe sind.

Eigene Schlagworte: Acanthocheilonema viteae, Chitinase Gene, Immunisierung, Filariose

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22.08.2006