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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Primärkulturen mikrovaskulärer Koronarendothelzellen (Ratte)

Männlichen, ca. 250g schweren, narkotisierten Wistar-Ratten wurde das Herz explantiert, die epikardialen Mesothelzellen in 70% Ethanol devitalisiert und das Herz anschließend 20 Minuten mit Kollagenase Typ II in der Langendorf-Anlage bei 95%iger O2-und 5%iger CO2-Inkubation perfundiert (51). Die Ventrikel wurden danach vom Herzen abgetrennt, mechanisch zerkleinert und wiederum Kollagenase und später Trypsin zugesetzt. Durch Zentrifugation bei 360rpm wurden die koronaren Endothelzellen im Überstand von den Kardiomyocyten separiert und in einem Kulturmedium aus Hepes-gepufferter Nährlösung M199 unter Zusatz von 20% Mixed-Serum aus Fetal- und Newborn- Calfserum im Verhältnis 1:1 sowie 250IU/ml Penicillin, 250µg/ml Streptomycin und 40mg/ml Gentamycin aufgenommen. Auf 100mm Gewebekulturschalen (Falcon) wurden die Endothelzellen in einer Dichte von 10⁶ Zellen/cm² ausgesät und 4 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Hierauf folgte ein "Waschgang" durch kräftiges Abspülen letaler oder artfremder Zellen. Unter Mediumwechsel alle 2 Tage erreichten die Endothelzellen nach 5-6 Tagen ein konfluentes Stadium. Der Anteil der Endothelzellen erreicht nach diesem Verfahren >95% (>95% F-VIII-AG- bzw. Ac-LDL-Bindung).

3.2 Primärkulturen makrovaskulärer Aortenendothelzellen (Schwein)

Die Pars descendens der Aorta thoracica von Schlachthof-Schweinen wurde innerhalb von 2 Stunden angeliefert (52). Nach der Eröffnung der Gefäße wurden die Endothelzellen behutsam mechanisch abgetragen, in Falcon-Zentrifugenröhrchen 50ml (Becton Dickenson) mit der oben beschriebenen Hepes-gepufferten Nährlösung M199 aufgenommen und zentrifugiert. Die Endothelzellen im Sediment wurden resuspendiert und in oben beschriebener Weise auf Kulturschalen ausgesät, nach 4h gewaschen und bis zur Konfluenz eines Monolayers nach 5-6 Tagen kultiviert. Die Reinheit des Monolayers nach diesem Verfahren lag bei 97% Endothelzellen (>97% F-III-AG- bzw. Ac-LDL-Bindung).

3.3 Aussaat der Endothelzellen auf Filtermembranen

Nach Erreichen eines konfluenten Monolayers wurde das Endothel mit EDTA-Trypsin-Puffer trypsiniert, resuspendiert und in einer Menge von 300.000 Zellen entweder auf 24mm- Polycarbonatfiltern (Costar Transwell Sixwell, 4 µM Porengröße, Durchmesser 24mm) zur Permeabilitätsmessung oder auf 60mm- Kulturschalen (Falcon) zur Bestimmung des cAMP- und cGMP-Gehaltes ausgesät. Die Experimente erfolgten am 4.Tag, wenn die Endothelzellen erneut ein konfluentes Monolayer ausgebildet hatten. Mit Kontrollschalen wurde gewährleistet, daß das Konfluenzstadium immer am gleichen Tag erreicht wurde.

3.4 Messung der makromolekularen Permeabilität

Das auf der Filtermembran ausgebildete Monolayer wurde in eine Inkubationskammer ( 45mm Durchmesser und 30mm Höhe ) gesetzt (Abb.A) und unterteilte diese in zwei übereinander liegende Kompartimente, die beide mit einer modifizierten Tyrodelösung gefüllt wurden. 2.5ml wurden in das obere und 10.5ml in das untere Kompartiment (in Vorversuchen über 24 Stunden bei einer Temperatur von 37°C ermittelt) gegeben, sodass bei gleichem Flüssigkeitsstand kein hydrostatischer Druckgradient über den Kompartimenten vorlag. (56,57).

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Abb. A: Inkubationskammmer: (1) Endotheliales Monolayer (2) Trypanblau-markiertes Albumin (3) Luminales Kompartment (4) Abluminales Kompartment (5) magnetischer Mikrorührer.

Dem oberen, "luminalen" Kompartiment wurde trypanblau-markiertes Albumin (60µM) zugegeben. Dem unteren "abluminalen" Kompartiment wurde unmarkiertes Albumin beigefügt, sodass in beiden Kompartimenten die gleiche Albuminkonzentration herrschte und ein onkotisches Gleichgewicht hergestellt war.

Der Transport des trypanblau-markierten Albumins vom oberen in das untere Kompartimenten erfolgte somit durch diffusive Kräfte. Es wurde im unteren größeren Kompartiment mit einem magnetischen Mikrorührer durchmischt und kontinuierlich über einen geschlossenen Pumpkreislauf einem Zwei- Wellenlängen- Photometer (Modell Specord S-10, Carl- Zeiss- Jena) mit einer Verzögerung von weniger als 15 Sekunden zugeleitet. Dort wurde die Konzentration des Trypanblaus als Absorption bei einer Wellenlänge von 580nm alle 10 Minuten erfaßt, während die Messung der Absorption bei 720nm als Kontrolle diente.

Die Förderrate der pulsarmen Pumpe wurde in Vorversuchen kontrolliert verändert und hatte bei niedrigen Flussraten keinen signifikanten Einfluß auf die Permeabilität über das endotheliale Monolayer, so dass eine entsprechend niedrige Pumpgeschwindigkeit gewählt wurde.

Die Geschwindigkeit des magnetischen Mikrorührers (6mm x 1mm) wurde ebenfalls zuvor in verschiedenen Rührgeschwindigkeiten hinsichtlich seines Permeabilitätseffektes überprüft und nicht signifikante Veränderungen mit steigender Geschwindigkeit gefunden, weswegen mit einer niedrigen Rührgeschwindigkeit mit 60 Umdrehungen pro Minute wie in der Literatur beschrieben (13,15) gearbeitet wurde.

Der Albuminfluß (F) über das Monolayer mit der Oberfläche (S) - auch als Flussdichte in der Physik bezeichnet - berechnet sich dann aus der Änderung der Albuminkonzentration (A2) über die Zeit (dt) im Volumen des unteren Kompartmentes (V): F (mol/ s^-1 x cm^-2) = d(A2)/dt x V/S.

Um diese Daten mit denen von anderen Veröffentlichungen vergleichen zu können, wurde noch ein Permeabilitätskoeffizient P ( cm/s) eingeführt, der die Durchlässigkeit des kombinierten Systems bestehend aus dem endothelialen Monolayer und dem Polycarbonatfilter erfaßt und nach

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Der basale Albuminfluß im koronaren Endothel entsprach 4.2 +/- 0.4 x 10^-13 (mol x s^-1 x cm^-2 ) und korrespondierte mit einer basalen Permeabilität über das koronare Monolayer und dem Filter von 5.37 +/- 0.5 x 10^-6 (cm/s) (siehe Ergebnisse 4.1.1.1.). Die Ergebnisse wurden als prozentuale Änderungen der Permeabilität gegenüber der basalen Kontrollsituation von 100% angegeben.

Der basale aortale Albuminfluß entsprach dagegen 3.91 +/- 0.38 x 10^-13 (mol x s^-1 x cm^-2) und einer Permeabilität von von 5.0 +/- 0.47 x 10^-6 (cm / s) über das System (siehe 4.2.1.1.).

3.5 Versuchsprotokoll der Permeabilitätsmessung

Die Messung der Makromolekülpermeabilität erfolgte nach einer Äquilibrierungsphase von 30 Minuten. Die basale Permeabilität wurde über weitere 30 Minuten ermittelt. Die jeweilige Versuchssubstanz wurden in angegebener Konzentration dem luminalen und abluminalen Kompartiment 30 bzw. 60 Minuten nach Protokoll zugefügt und im Intervall von 10 Minuten die Permeabilitätsänderungen ermittelt.

Bei der Verwendung von Pertussistoxin (1µg/ml) wurden die Endothelmonolayer 2 Stunden vor der Messung mit dieser Substanz inkubiert und vor Beginn der Messung dreimal mit Basalmedium gewaschen.

Bei Einsatz von 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP wurde wegen Lichtempfindlichkeit verdunkelt gearbeitet.

3.6 Messung des zellulären Gehaltes an zyklischen Nukleotiden

Nach Inkubation der konfluenten Endothelmonolayer mit den jeweiligen Versuchssubstanzen wurde das Inkubationsmedium aspiriert und eisgekühltes Ethanol hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Die Petrischalen wurden bei -80°C eingefroren und zwischengelagert. Um die intrazellulären, zyklischen Nukleotide zu messen, wurde das Ethanol bei 60°C verdampft, die Zellaufschlüsse in tridestilliertem Wasser suspendiert und in Eppendorf-Gefäße für 5 Minuten bei 14.000G zentrifugiert. Im Überstand wurde mit einem Radioimmunassay (Amersham; Braunschweig, Deutschland ) die Konzentrationen der zyklischen Nukleotide bestimmt. Im Sediment wurde der Proteingehalt bestimmt. Der zelluläre Gehalt wurde als Konzentration des Nukleotids pro 1mg Protein dargestellt.

3.7 Versuchssubstanzen:

r-ANP (1-28), C-ANP	Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden,
Pertussistoxin, KT 5823	Deutschland.
8-Br-cAMP, 8-Br-cGMP	Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland

Chemikalien/Enzyme/Pharmaka

Medium M-199 mit Earle's Salzen	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
Modifizierte Tyrodelösung (150 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.7 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 30 mM HEPES (pH 7.4, 37°C) mit 10% Newborn Calf Serum und 10% Fetal Calf Serum)

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Elektrolyte: NaCl, CaCl, Kcl, KH2PO4,	Roth, Karlsruhe, Deutschland
MgSo4, Hepes, EDTA-Na2, NaHCO3.	Merck, Darmstadt, Deutschland
Newborn Calf Serum	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
Fetal Calf Serum	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
Hepes-Lösung	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
EDTA-Trypsin	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
Penicillin G 100 IU/ml	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
Gentamycin 40mg/ml	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
Streptomycin 100µg/ml	Life-Technology, Eggenstein, Deutschland
Collagenase Typ II 266U/mg	Worth. Biochem. Corp., New Yersey, USA
Trypsin 1:250	Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Albumin, bovine	Sigma, St. Louis, USA.
Trypanblau	Seromed, Berlin, Deutschland
Glukose	Sigma, St. Louis, USA.
Ethylalkohol	Franz-Volhard-Klinik, Berlin, Deutschland

3.8 Verbrauchsmaterialien

Pipettenspitzen	Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Falcon- Tube ( 10, 50ml)	Becton Dickenson, Heidelberg, Deutschland
Zellkulturschalen ( 24, 60, 100mm)	Becton Dickenson, Heidelberg, Deutschland
Polycarbonat -Filtermembran-Einsätze	Costar, Bodenheim, 24mm Diameter, 0,4 µM
Radioimmunassay KIT R509	Amersham, Braunschweig, Deutschland

3.9 Geräte

Photometer, Modell Specord S-10	Carl-Zeiss, Jena, Deutschland
Pumpe	ISMATEC, Zürich, Schweiz
Computer	486/133 Mhz, Betriebssystem MS-DOS 6.2
Mikroskop, Modell TMSF	Nikon, Japan
pH- Meter	Fullerton, USA
Vortex, REAX 2000	Heidolph, Deutschland
Zentrifuge	Beckmann, München, Deutschland
Tischzentrifuge, Biofuge 13	Heraeus, Hanau, Deutschland
Laminar-Flow, Lamin Air HB 2448	Heraeus, Hanau, Deutschland
Absaugpumpe, Hochvakuumpumpe	Edwards, England
Rührer	Janke-Kunkel, Deutschland
Chopper	Bachhofer, Rutlingen, Deutschland

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Langendorf-Anlage	Max-Delbrück-Zentrum, Berlin, Deutschland
Pipetten	Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Feinwaage, Kern 410	A+M Corpor., USA
Steri Cult Inkubator	Heraeus, Hanau, Deutschland

Alle weiteren hier nicht aufgeführten Chemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden von den Firmen Merck (Darmstadt), Serva (Heidelberg) oder Sigma (Deisenhofen) in der jeweils höchsten kommerziell verfügbaren Qualität bezogen.

3.10 Statistik

Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte +/- SD bei n=6 unabhängiger Versuche. In der Signifikanzanalyse wurde der T-Test nach Student eingesetzt. Als Signifikanzniveau für die

Trennung zweier Werte wurde p < 0,05 angesetzt.

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