Bach, Christoph: Einfluß von Atrionatriuretischen Peptid auf die Makromolekülpermeabilität aortaler und koronarer Endothelien

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Kapitel 5. Diskussion

5.1 Zentrales Ergebnis

ANP besitzt eine regiospezifische, permeabilitätsmodulierende Wirkung am Endothel. An koronaren Zellen wird die Permeabilität vermindert, an aortalen Zellen erhöht (Abb.4,5,14,15,B). Diese Wirkung wird durch die Signaltransduktionswege der Adenylatzyklase und der Guanylatzyklase vermittelt. Die endothelialen cAMP-Spiegel werden vermindert und die cGMP-Spiegel erhöht (Abb.3,13,B). Beide Nukleotide wirken hierbei synergistisch auf die endotheliale Permeabilität. Dieser Mechanismus ist in den beiden untersuchten Endothelarten identisch.

Der ANP-C-Rezeptor übernimmt eine funktionelle Rolle in der Regulation der Permeabilität (Abb.8ab,18ab). Über ihn wird die Abnahme des zellulären cAMP-Spiegels über eine Pertussistoxin (PT) sensible Hemmung der AC vermittelt (Abb.9a,19a).

Abb.B: ANP-Wirkung in koronaren und aortalen Endothelzellen.

5.2 Regulation der Nukleotide

Der cGMP erhöhende Einfluss von ANP (Abb.3,13) war bisher der einzige Weg, der hinsichtlich der intrazellulären Vermittlung des ANP-Effektes auf die endotheliale Permeabilität beschrieben wurde. Er beruhte auf einer Kopplung der ANP-A- und ANP-B-Rezeptoren mit der partikulären GC und wurde bisher in allen Endothelprovinzen einheitlich nachgewiesen (13-18,21,22,33,34).

Eine Abnahme des cAMP-Spiegel im Endothel (Abb.3,13) jedoch konnte durch den Einsatz von ANP bisher nicht beschrieben werden. Wohl aber in anderen Geweben wie glatten Gefäßmuskelzellen, in Thrombozyten, im Myokard, Hirn (Striatum und Hypophysenvorderlappen) und Nebenniere (29,30,31,40,41), wo Anand-Srivastavas et al. bereits diesen ANP-Effekt mit dem Einsatz von Pertussistoxin zeigen konnte.

Pertussistoxin (35) zeigt als Bakterientoxin Einfluss auf eine bestimmte Untereinheit der AC Einfluss, auf das Gi-Protein. Die G-Proteine (35) wirken als aktivierende (Gs-Protein) bzw. inhibierende (Gi-Protein) Vermittler zwischen dem Hormon-besetzten Rezeptor und der


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katalytischen Untereinheit, die auf ein Signal hin aus ATP cAMP produziert. Pertussistoxin hemmt das inhibierende G-Protein und dessen bremsende Wirkung auf die Aktivität der AC.

Da Pertussistoxin den cAMP-senkenden Effekt von ANP (30,31) aufhob, schloss Anand-Srivastavas, dass die ANP-Wirkung über diese Gi-Protein-abhängige Hemmung der Adenylatzyklase vermittelt wird. Weiterhin zeigte er, dass dieser PT-sensible ANP-Effekt an den ANP-C-Rezeptors gekoppelt war (30,31). Am Endothel konnte Noll (38) die Existenz einer solchen PT-sensiblen Kopplung der AC bisher am Neuropeptid Y-Rezeptor zeigen. Sie führte ebenfalls zu einer Absenkung des cAMP-Gehaltes der Zellen.

Dem endothelialen ANP-C-Rezeptor allerdings, der sowohl im koronaren (26) wie auch im aortalen (25) Endothel exprimiert wird und in bovinen, aortalen Endothelzellen (BAEC) eine Dominanz von > 94% der ANP-Rezeptoren besitzt (25), konnte bisher keine solche Funktion der Signaltransduktion zugewiesen werden.

Die ihm bisher zugeschriebene Aufgabe bestand in einer Clearance-Funktion, die durch Bindung an den Rezeptor und Internalisierung des Komplexes zur Absenkung des ANP-Plasmaspiegels führte (27,28).

Durch den Einsatz von C-ANP, einem verkürzten ANP-Analogon, das ausschließlich an den ANP-C-Rezeptor bindet (29), konnte in dieser Untersuchung gezeigt werden, dass C-ANP in beiden untersuchten Zelltypen die cAMP-Spiegel (Abb.6,16) absenkte, die Permeabilität veränderte (Abb.5,7, 15,17) und durch PT (Abb.9b,10b,19b,20b) hinsichtlich des Nukleotidspiegels und der Permeabilitätsänderung komplett antagonisierbar war.

Eine Funktion des ANP-C-Rezeptors in der Signaltransduktion der Permeabilität konnte somit im Endothel nachgewiesen werden.

Auch der Einsatz des Vollpeptids ANP führte in beiden untersuchten Zellsystemen zu einer Absenkung des cAMP-Spiegels; allerdings erfolgte die Absenkung auf eine andere Weise. Einerseits war die cAMP-absenkende Intensität von ANP (Abb.3,13) fast doppelt so stark wie die von C-ANP (Abb.6,16), andererseits konnte PT die cAMP-Absenkung nicht komplett, sondern nur partiell um etwa 2/3 (Abb.9a,19a) antagonisieren. Diese gefundenen Daten ließen mindestens zwei zelluläre Mechanismen zur cAMP-Absenkung annehmen.

2/3 der Absenkung des cAMPs stellte sich auch hier als PT- sensibel dar und ließ sich wie oben über die Kopplung der PT-sensiblen AC am ANP-C-Rezeptor erklären.

Ein zweiter, kleinerer Teil der cAMP-Absenkung war jedoch nicht PT-sensibel. Eine Erklärung könnte in einer unterschiedlichen Affinität von ANP und C-ANP zum ANP-C-Rezeptor vermutet werden, wobei die AC-Aktivität durch verschieden starke Bindung unterschiedlich inhibiert würde. Gegen diese Überlegung sprachen die Daten aus der Arbeitsgruppe von Maak (27,28), demnach C-ANP mit >90% der ANP-Affinität an den ANP-C-Rezeptoren band.

Naheliegender erscheint uns jedoch, dass eine gesteigerte Aktivität von Phosphodiesterasen (PDE) zu einem vermehrten Abbau von cAMP führt. So konnte bereits in Glomerulosazellen boviner Nebennieren (42) gezeigt werden, dass ANP über zwei cAMP-reduzierende Wege auf die Aldosteronsekretion einwirkte. Die Senkung der cAMP-Spiegel war abhängig einerseits von der uns bereits bekannten PT-sensiblen Inhibierung der AC, andererseits von einer cGMP-abhängigen PDE, der Phosphodiesterase II (PDE II), deren Existenz auch im Endothel nachgewiesen wurde (43,44). Der PDE II-Effekt konnte aber in vorliegender Arbeit wegen Fehlens spezifischer PDE II - Hemmstoffe nicht erfasst werden.


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Mit dieser These wäre die schwächere cAMP-absenkende Wirkung von C-ANP gut erklärbar, da C-ANP im Gegensatz zu ANP nicht auf die GC wirkt und so auch nicht die cGMP-abhängige PDE II zusätzlich aktivieren kann.

Zusammenfassend lässt sich darstellen, dass ANP unabhängig vom endothelialen Ursprung einerseits über eine Aktivierung der GC zur Erhöhung der cGMP-Spiegel als auch andererseits über eine Inhibition der AC und vermutlich über die PDE II zur Absenkung der cAMP-Spiegel führt (Abb.B).

5.3 Antagonistische Wirkung der Nukleotide auf die Permeabilität

Die Vorversuche mit den membrangängigen Nukleotiden 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP demonstrierten das antagonistische Wirken der beiden Nukleotide auf die Permeabilität in den verschiedenen Zelltypen (Abb.1,2,11,12).

So bestätigten die vorliegenden Daten aus koronaren Endothelien (Abb.1,2) die Ergebnisse von Watanabe (37), Noll (38) und Hempel (20). cAMP- steigernde Substanzen und 8-Br-cAMP erhöhten die Permeabilität in koronaren Endothelzellen. cGMP-steigernde Substanzen und 8-Br-cGMP (20) erniedrigten diese. Hempel (20) leitete hieraus den funktionellen Antagonismus der Nukleotide in der Feinmodulation koronarer Permeabilität ab.

Für aortale Endothelzellen (Abb.11,12) gelten analog die gleichen antagonistischen Mechanismen, die später diskutiert werden (Kapitel 5.6).

5.4 Synergistische Wirkung der Nukleotide auf die Permeabilität

Der funktionelle Antagonismus der Nukleotide entspricht der Arbeitsweise einer Waage. Bei gleichseitiger Synthese beider „ second messenger “ gleichen sich die permeabilitätserhöhenden und -senkenden Kräfte aus. Kommt das Gleichgewicht aber aus dem Lot durch einseitige Synthese oder Abbau eines Nukleotids, resultiert daraus ein Überwiegen der stärkeren, permeabilitätsverändernden Kraft. Beide Seiten der Waage können sogar bei gleichzeitiger einseitiger Synthese und gegenseitiger Absenkung synergistisch die permeabilitätsverändernde Kraft verstärken.

Ein solches synergistisches Modell der Nukleotide fand Levin (39) in den Glomerulosazellen der Nebennierenrinde. Dort inhibierte ANP die Aldosteronsekretion synergistisch durch eine cGMP-Spiegelerhöhung und eine gleichzeitige cAMP-Spiegelverminderung.

Analog zeigte sich auch in den untersuchten koronaren und aortalen Endothelzellen, dass die cGMP-steigernden und die cAMP-senkenden Effekte von ANP synergistisch auf die Permeabilität wirkten. Die beiden Messengersysteme wurden jeweils mit PT (Abb. 9a,19a) oder mit KT 5823, dem Inhibitor der PK G, gehemmt, woraufhin ANP jeweils nur noch die Hälfte seiner ursprünglichen, permeabilitätsverändernden Wirkung entfalten konnte (Abb. 8ab,18ab).

Beide Nukleotide besitzen demnach eine eigene, unabhängige Wirkung auf die Permeabilität. Bei gleichzeitigem Einsatz beider Hemmsubstanzen konnte demgegenüber der ANP-Effekt komplett verhindert werden (Abb.8ab,18ab). Kein weiterer Transduktionsmechanismus scheint demnach an der ANP-Wirkung auf die Permeabilität beteiligt zu sein.

Durch die synergistische Wirkung der Nukleotide lässt sich ebenfalls nachvollziehen, warum C-ANP, das einzig und alleine über das cAMP-Messengersystem auf die Permeabilität wirkt (Abb.9b,19b), die halbe permeabilitätsverändernde Wirkung des Vollpeptids (Abb.5,15) entfaltet. Diese Wirkung war vollständig durch PT antagonisierbar (Abb.9b,10ab,19b,20ab) und erfuhr erwartungsgemäß durch KT 5823 keine zusätzliche Veränderung.


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Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beiden Nukleotide in Gegenwart von ANP synergistisch auf die Permeabilität wirken.

5.5 Inverse Wirkung der Nukleotide auf die Permeabilität

Im Vergleich der beiden untersuchten Endothelzellsysteme fiel hinsichtlich der Daten zu 8-Br-cGMP und 8-Br-cAMP auf (Abb.1,2,11,12), daß sich die oben beschriebene, antagonistische Wirkung der Nukleotide auf die Permeabilität in Abhängigkeit vom Endothelursprung invers verhielt. Obwohl die benutzten Konzentrationen von 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP in beiden Zellsystemen dieselben waren, erzielte 8-Br-cAMP im koronaren Monolayern einen erhöhenden (Abb.1,2) und im aortalen einen erniedrigenden Effekt (Abb.11,12), während der Gegenspieler 8-Br-cGMP genau entgegengesetzte Effekte bewirkte.

Eine solche Inversität der Permeabilität im mikro- und makrovaskulären Zellen zeigte Watanabe (37) bereits für den cAMP-Transduktionsweg. cAMP-erhöhende Substanzen führten in koronaren Endothelzellen zu einer Zunahme der Permeabilität dagegen in aortalen Zellen zu einer Abnahme. Die zahlreichen Daten über die Einzelwirkung von cAMP in koronarem (20,37,38) und aortalen Zellen (16,17,18,37,45,46) bestätigten die oben gewonnen Daten.

Durch die vorliegende Untersuchung kann die regiospezifische, inverse Wirkung ebenfalls für das cGMP-System erweitert werden.

Allerdings liegen in der Literatur unterschiedliche Daten über die Wirkungsweise von 8-Br-cGMP im aortalen Endothel vor und werden im folgenden Kapitel diskutiert.

5.6 Inverse Wirkung von ANP auf die Permeabilität

Die Permeabilität der Endothelzellverbände ist demnach im arteriellen Gefäßbaum des Körpers nicht an jeder Stelle gleich, sondern zeigt regiospezifische Unterschiede.

Nach den vorliegenden Daten führte ANP im koronarem Endothel zu einer Abnahme der Permeabilität (Abb.4,5) und in aortalen Zellen zu einer Zunahme (Abb.14,15). Die C-ANP-Wirkung war entsprechend (Abb.5,7,15,17).

Während die permeabilitätssenkende Wirkung von ANP in koronarem Endothel (Abb.4,5) eine neue Beobachtung war (20), lagen über die Wirkungsweise von ANP und 8-Br-cGMP im aortalen Endothel (Abb.14,15) in der Literatur unterschiedliche Daten vor:

Unsere Beobachtung der ANP- bzw. 8-Br-cGMP-abhängigen Zunahme der Permeabilität (Abb.14,15) beobachteten ebenfalls Yonemaru (19) und in Versuchen über Wasserpermeabilität Battle (47). Allen drei Arbeiten war die Verwendung von „ruhenden“, nicht vorbehandelten, makrovaskulären Endothelverbänden gemeinsam.

Andere Arbeitsgruppen (13-18) beobachteten nur unter dem Einsatz vorstimulierender Substanzen wie Thrombin und Oxidantien ( z.B. Glukoseoxidase ), die in Situationen wie z.B. einer Entzündung freigesetzt werden, ANP- oder 8-Br-cGMP-abhängige Permeabilitäts-veränderungen. Sie hielten den durch die Vorstimulation induzierten Einstrom von Ca-Ionen für den wesentlichen Faktor der endothelialen Kontraktion und des Anstieges der Permeabilität. Der anschließende Einsatz von ANP bzw. von 8-Br-cGMP verstärkte den Ca-Rücktransport in die zytoplasmatischen Ca-Speicher, senkte den intrazellulären Ca-Gehalt und führte zur Abnahme der Permeabilität. Diese Permeabilitätsbewegungen waren allerdings unserer Beobachtung an ruhenden Zellen genau entgegengesetzt.

Hempel et al. (20) konnten zeigen, daß in „ruhenden“ Endothelmonolayern die Regulation der Permeabilität Ca-unabhängig funktioniert. cAMP- und cGMP-Erhöhungen an ruhenden


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Endothelien besaßen hierbei keinen Einfluss auf den Ca-Spiegel in den Zellen. Ebenfalls blieben unter extrazellulären Ca-freien Bedingungen die Permeabilitätseffekte von ANP unverändert nachweisbar. Demnach unterscheiden sich ruhende und stimulierte Endothelzellen hinsichtlich der überwiegenden, intrazellulären Signalübertragung und der resultierenden Permeabilitäts-bewegung.

Ein weiterer methodischer Unterschied zu den Vergleichsarbeiten lag darin, daß jene Endothelmonolayer in Zellinien 10-ter bis 20-ter Passage verwandten, wogegen Draijer (48) eine kontinuierliche Abnahme der GC-Aktivität in steigender Passagezahl bis zum Verschwinden der Aktivität in der achten Passage nachwies. Die von uns benutzten Endothelverbände wurden nicht als Zellinien sondern als Primärkulturen in erster Passage zur Messung verwandt.

Zusammenfassend verhält sich die Wirkung von ANP und C-ANP in koronaren und aortalen Endothelmonolayern regiospezifisch und invers (Abb.B).

5.7 Gefäßspezifische Differenzierung der Endothelzellen

Das Endothel differenziert sich im Laufe der embryonalen Entwicklung aus den gemeinsamen Endothelvorläuferzellen - den Angioblasten - gemäß den organsspezifischen Anforderungen (59). Eine der wichtigsten Determinanten ist das lokale Umfeld. Besonders die Interaktionen mit den umgebenden Zellen durch lösliche Zytokine, Zell- Zellkontakte und den Aufbau und Bestand der Matrix, auf der die Endothelzellen wachsen, beeinflussen die Differenzierung der komplexen organspezifischen Anforderungen der Endothelzellen (59).

In den postkapillären Lymphknoten und den Peyer‘schen Plaques ermöglichen die Endothelzellen kontinuierlich das Zirkulieren und Rezirkulieren von Lymphozyten aus der Blutbahn in das Gewebe und zurück. Über Oberflächenrezeptoren dienen die Endothelzellen über das „Rolling“ den Lymphozyten als „Anlegestelle“, um in das Gewebe zu immigrieren.

Im Knochenmark sind die Endothelzellen zusammen mit Fibroblasten, Osteoblasten, Retikulozyten und Monozyten verantwortlich für die Proliferation, Differenzierung und Reifung von hämopoetischen Zellen. Die Endothelzellen produzieren Zytokine, synthetisieren Matrixproteine und regulieren den Transit von Vorläufer und reifen Blutzellen in den Blutkreislauf.

In der Bluthirnschranke repräsentiert das Endothel das Bindeglied zwischen Blut und dem zentralen Nervensystems. Hier hat es besonders protektive Aufgaben. Über spezielle „tight-junctions“ regulieren die Endothelzellen die Infiltration von Plasmakomponenten und Immunzellen, über spezielle Transportsysteme transportieren sie gewünschte Stoffe wie Glukose und Aminosäuren und schützen gleichzeitig das Gehirn vor unerwünschten toxischen Substanzen, indem sie z.B. über ein „multidrug-resistance“ Proteine eine Vielzahl von niedermolekularen Molekülen aus dem Hirn heraustransportieren (59).

Trotz vieler gemeinsamer funktioneller und morphologischer Eigenschaften und Vorraussetzungen erlangen die Endothelzellen durch Differenzierung eine ausgesprochen große Heterogenität.

In diese endotheliale Heterogenität reiht sich die gefäßspezifischen Differenzierung des aortalmakrovaskulären und dem coronaren-mikrovaskulären Endothels ebenfalls ein.

In der komplex organisierten Herzmuskulatur kommt dem Endothel neben dem Stofftransport aus dem Blut zur Versorgung des Myokards besonders die Aufgabe zu, paracrine Substanzen zu synthetisieren und bedarfsgerecht zu sezernieren (61,62). Es produziert NO, Endothelin I, ANP,


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Angiotensin-Converting-Enzym und Angiotensin II, die maßgeblich für die Modulation der Herz-Kreislauffunktion verantwortlich sind.

Die Aufgaben des aortalen Endothels beschränken sich dagegen hauptsächlich auf die Aufrechterhaltung der Gefäßwandintegrität.

Hinsichtlich der Barrierenfunktion konnten wie trotz der endothelialen Heterogenität gemeinsame regiounabhängige Wirkmechanismen der intrazellulären Signaltransduktions-mechanismen in den beiden untersuchten mikrovaskulären - und makrovaskulären Endothel-verbänden zeigen, die sowohl quantitativ wie qualitativ nach einem einheitlichen Prinzip ablaufen. ANP beeinflusst hierbei (Abb.B) den Antagonismus der beiden eng miteinander verknüpften Feinregulatoren cAMP und cGMP derartig, daß beide Second Messenger synergistisch die Permeabilität der Endothelbarriere verändern.

Der eigentliche Effekt der Signaltransduktion auf die endotheliale Barriere ist jedoch regiospezifisch an den jeweiligen Ort und dessen Bedürfnisse im Organsystem gebunden. ANP führt in mikrovaskulären Endothelzellen zu einer Absenkung und in makrovaskulären Endothelzellen zu einem Anstieg der Permeabilität.

Die unterschiedlichen Spezies - Ratte und Schwein - halten wir hinsichtlich der inversen Permeabilitätseffekte für nicht entscheidend, da beide Tiermodelle einen vergleichbaren Organismus besitzen und in der Literatur langjährig untersucht und etabliert sind. Vergleichende Untersuchungen stehen jedoch bisher aus.

Gerade weil (48,59,60) bekannt ist, dass Endothelzellen schnell ihre Funktion in Zellkulturen außerhalb ihres Organverbandes verlieren, halten wir die gewonnen Ergebnisse für echt, da die endothelialen Monolayer rasch - d.h. in erster Passage von Primärkulturen - zu den Permeabilitäts- und Nukleotidmessungen verwand wurden, im Gegensatz zu vielen anderen Untersuchungen, deren Zellpassagen von Primärkulturen bis zur 22. Passage reichten (60).

Demnach lassen sich die prinzipiellen Aussagen zur Signaltransduktion und der Regiospezifität der Permeabilität aus dem In-Vitro-Modell wahrscheinlich in ähnlicher Weise auf den lebenden Organismus übertragen. Quantitative und funktionelle Aussagen dagegen sind aus diesem Modell nicht sicher ableitbar.

Das von den koronaren Endothelzellen und dem Myokard synthetisierte ANP besitzt vornehmlich eine kardioprotektive Wirkung. Einerseits beeinflusst es den Organismus durch antiadrenerge Effekte, andererseits reduziert es das intravasale Volumen und die myokardiale Vorlast (4,5).

So vermuteten Fluckinger (53) und Almeida (54), daß die unter dem Einfluss von ANP bei nephrektomierten Ratten beobachtete Blutdruck-, intravasale Volumenabnahme sowie der Hämato-kritanstieg auf einen erhöhten vaskulären Flüssigkeitsaustritt zurückzuführen sei. Die von uns beobachtete Erhöhung der Permeabilität in makrovaskulären Gefäßen könnte diesem entsprechen.

Darüber hinaus zeigt ANP eine protektive Wirkung auf das Endokard und Myokard in pathophysiologischen Situationen. So verhindert ANP (55) nach passagerer Ischämie die reperfusionsbedingte Hyperkontraktion und anschließenden Zelltod von Kardiomyocyten. Parallel schützt der Einsatz von ANP den koronaren Endothelverband bei und nach passagerer Energieverarmung mittels Kaliumcyanid (KCN) und 2-Deoxy-D-Glukose (2-DG) vor Hyperpermeabilität und Zusammenbruch der Barrierenfunktion (63, unveröffenliche Daten). Die von uns gezeigte Absenkung der koronaren Endothelpermeabilität unter ANP könnte diesem Mechanismus zur Erhaltung der Integrität des Herzmuskels dienen.


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