Bach, Christoph: Einfluß von Atrionatriuretischen Peptid auf die Makromolekülpermeabilität aortaler und koronarer Endothelien

Aus der Franz-Volhard-Klinik
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Einfluß von Atrionatriuretischen Peptid auf die Makromolekülpermeabilität aortaler und koronarer Endothelien

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

Vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Von Christoph Bach,
aus Bobingen

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. H. Haller
Prof. Dr. H.-W. Reinhardt
Prof. Dr. T. Lenz

Datum der Promotion: 18.11.2002

Einfluß von Atrionatriuretischen Peptid auf die Makromolekülpermeabilität aortaler und koronarer Endothelien.

Atrionatriuretisches Peptid (ANP) moduliert die Barrierenfunktion in endothelialen Monolayers; jedoch sind die Mechanismen noch unklar.

Wir überprüften die Hypothese, inwiefern die ANP-Wirkung auf die Permeabilität (P) abhängig ist von einem veränderlichen Gleichgewicht der Nukleotide cyclic GMP (cGMP) und cyclic AMP (cAMP), und hierbei der C-ANP-Rezeptor ein funktionelle Bedeutung aufweist. Die ANP-Wirkung wurde hierbei in koronaren (CEC) and aortalen Endothelzellen (AEC) im Vergleich untersucht.

Die endotheliale Makromolekülpermeabilität (P) wurde aus dem Übertritt von Trypanblaugelabelten Albumin über das Monolayer ermittelt. Wir erfassten neben der Permeabilität den zellulären Gehalt von cGMP und cAMP, mit und ohne Pertussitoxin (PT), mit dem Proteinkinase G -Inhibitor KT 5823 und mit beiden Substanzen in Kombination. Dann wiederholten wir die gesamte Versuchsserie mit dem ANP-Derivat C-ANP, das selektiv nur an den C-ANP-Rezeptor bindet.

Ergebnisse: In CEC verursachte ANP (100nM) eine Abnahme der P (48%+/-7%, mean +/- SD, N=6, p<0.05) und des cAMP-Gehaltes (55+/-8%) sowie einen Anstieg des cGMP-Gehaltes (+62+/-%). Vorbehandlung der CEC mit KT 5823 (1µM) für 30 min, oder mit PT (1mg/ml) für 60 min reduzierte den Effekt von ANP auf die P (26+/-5%) und auf den cAMP-Gehalt (23+/-6%). Der Einsatz beider Hemmsubstanzen KT 5823 plus PT verhinderte den ANP-Effekt auf die P komplett.

C-ANP hatte einen geringeren Einfluß auf die P: C-ANP (100nM) verminderte die P (28+/-6%), hatte jedoch keinen Effekt auf den cGMP-Gehalt, jedoch erhöhte es ebenfalls den cAMP-Gehalt (28+/-7%). Dieser Effekt wurde durch KT 5823 nicht beeinflußt, jedoch komplett durch PT verhindert.

Im Kontrast dazu zeigt ANP in AEC eine Zunahme der P (59+/-8%), wobei jedoch die Veränderungen der Nukleotide dieselben sind wie in CEC: Erhöhung des cGMP-Gehaltes (44+/-6%) und Verminderung des cAMP-Gehaltes (58%+/-8%).

Zusammenfassung: (1) ANP moduliert die endotheliale Barrierenfunktion über zwei unterschiedliche Wirkmechanismen: über die Steigerung des cGMP-Gehaltes via A-/B-ANP-Rezeptor und über die Reduktion des cAMP-Gehaltes via des C-ANP-Rezeptors.

(2) Während die ANP-Wirkung über dieselben intrazellulären Wirkmechanismen vermittelt wird, zeigt es hinsichtlich der Permeabilität einen inverse Effekt in den beiden unersuchten Endothelzellsystemen: Es verminderte die P in CEC und steigert diese AEC.

Schlagwörter:
ANP, Permeabilität, ANP-C-Rezeptor, Endothel

Influence of Atrial Natriuretic Peptid (ANP) in Modulating Endothelial Permeability of Coronary and Aortic Monolayers.

Atrial natriuretic peptide (ANP) improves the barrier function in primary cultures of endothelial monolayers; however, the mechanism is unclear.

We tested the hypothesis that the ANP-induced alteration in endothelial permeability is related to an altered balance between cyclic GMP (cGMP) and cyclic AMP (cAMP) via functional involvement of the C-ANP-receptor in coronary endothelial (CEC) and aortic endothelial (AEC) cells.

Endothelial macromolecule permeability (P) was determined by passage of trypan-blue-labeled albumin across rat coronary and porc aortic endothelial monolayers. We measured permeability, as well as cGMP and cAMP, with or without pertussis toxin (PT), the protein kinase G inhibitor KT 5823, and both in combination. Next, we repeated this entire series, giving the truncated ANP-derivate C-ANP, which binds only to the C-ANP-receptor.

We found: In CEC ANP (100nM) caused a decrease in P (48%+/-7%, mean +/- SD, N=6, p<0.05) and cAMP (55+/-8%) and a increase in cGMP (+62+/-%). Pretreatment of CEC with KT 5823 (1µM) for 30 min, or with PT (1mg/ml) for 60 min reduced the effect of ANP on P (26+/-5%) and on cAMP (23+/-6%), respectively. Pretreatment of CEC with both KT 5823 plus PT abolished the effect of ANP on P completely.

C-ANP had less effect on P: C-ANP (100nM) decreased P (28+/-6%), had no effect on cGMP, but decreased cAMP (28+/-7%). This effect was not influenced by KT 5823, but was completely abolished by PT.

In contrast ANP showed in AEC an increase in P (59+/-8%), but the same alterations of cGMP (44+/-6%) increase and cAMP decrease (58%+/-8%).

Conclusion: (1) ANP modulates endothelial barrier function by two cooperative mechanisms: enhancing the cellular cGMP content via A-/B-ANP-receptor receptor coupled cGMP-formation, and by reduction of cAMP content via C-ANP-receptor.

(2) While using the same intracellular messenger systems in AEC and CEC, ANP effects inverse alterations in P: decreases in CEC and increases in AEC.

Keywords:
ANP, endothelium, permeability, ANP-C-receptor


Seiten: [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteEinfluß von Atrionatriuretischen Peptid auf die Makromolekülpermeabilität aortaler und koronarer Endothelien
1 Einleitung
1.1Endotheliale Barrierenfunktion
1.2Atrionatriuretisches Peptid (ANP)
1.3Wirkung von ANP auf die zyklischen Nukleotide
1.4Wirkung von ANP auf die Permeabilität
2 Aufgabenstellung
3 Material und Methoden
3.1Primärkulturen mikrovaskulärer Koronarendothelzellen (Ratte)
3.2Primärkulturen makrovaskulärer Aortenendothelzellen (Schwein)
3.3Aussaat der Endothelzellen auf Filtermembranen
3.4Messung der makromolekularen Permeabilität
3.5Versuchsprotokoll der Permeabilitätsmessung
3.6Messung des zellulären Gehaltes an zyklischen Nukleotiden
3.7Versuchssubstanzen:
3.8Verbrauchsmaterialien
3.9Geräte
3.10Statistik
4 Ergebnisse
4.1Mikrovaskuläre Endothelzellen
4.1.1Wirkung von 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP auf die Permeabilität
4.1.1.1Konzentrationsreihe mit 8-Br-cAMP
4.1.1.2Konzentrationsreihe mit 8-Br-cGMP
4.1.1.3Zeitverlauf der 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP-Wirkung
4.1.2Wirkung von ANP
4.1.2.1Einfluß von ANP auf die zellulären Nukleotidspiegel
4.1.2.1.1cAMP-Spiegel
4.1.2.1.2cGMP-Spiegel
4.1.2.2Einfluß von ANP auf die Permeabilität
4.1.2.2.1Konzentrationsreihe
4.1.2.2.2Zeitverlauf
4.1.3Wirkung von C-ANP
4.1.3.1Einfluß von C-ANP auf die endothelialen Nukleotidspiegel
4.1.3.1.1cAMP-Spiegel
4.1.3.1.2cGMP-Spiegel
4.1.3.2Einfluß von C-ANP auf die Permeabilität
4.1.3.2.1Konzentrationsreihe
4.1.3.2.2Zeitverlauf
4.1.4Wirkung von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin
4.1.4.1Einfluß von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die Permeabilität
4.1.4.2Einfluß von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf cAMP-Spiegel
4.1.5Wirkung von C-ANP in Gegenwart von Pertussistoxin
4.1.5.1Einfluß von C-ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die Permeabilität
4.1.5.2Einfluß von C-ANP in Gegenwart Pertussistoxin auf die cAMP-Spiegel
4.1.6Wirkung von ANP auf die Permeabilität in Gegenwart von KT 5823
4.1.7Wirkung von C-ANP auf die Permeabilität in Gegenwart von KT 5823
4.1.8Wirkung von ANP auf die Permeabilität in Gegenwart von Pertussistoxin und KT 5823
4.2Makrovaskuläre Endothelzellen
4.2.1Wirkung von 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP auf die Permeabilität
4.2.1.1Konzentrationsreihe mit 8-Br-cAMP
4.2.1.2Konzentrationsreihe mit 8-Br-cGMP
4.2.1.3Zeitverlauf der 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP- Wirkung
4.2.2Wirkung von ANP
4.2.2.1Einfluß von ANP auf die endothelialen Nukleotidspiegel
4.2.2.1.1cAMP-Spiegel
4.2.2.1.2cGMP-Spiegel
4.2.2.2Einfluß von ANP auf die Permeabilität
4.2.2.2.1Konzentrationsreihe
4.2.2.2.2Zeitverlauf
4.2.3Wirkung von C-ANP
4.2.3.1Einfluß von C-ANP auf die endothelialen Nukleotidspiegel
4.2.3.1.1cAMP-Spiegel
4.2.3.1.2cGMP-Spiegel
4.2.3.2Einfluß von C-ANP auf die Permeabilität
4.2.3.2.1Konzentrationsreihe
4.2.3.2.2Zeitverlauf
4.2.4Wirkung von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin
4.2.4.1Einfluß von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die Permeabilität
4.2.4.2Einfluß von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf cAMP-Spiegel
4.2.5Wirkung von C-ANP in Gegenwart von Pertussistoxin
4.2.5.1Einfluß von C-ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die Permeabilität
4.2.5.2Einfluß von C-ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die cAMP-Spiegel
4.2.6Wirkung von ANP in Gegenwart von KT 5823 auf die Permeabilität
4.2.7Wirkung von C-ANP in Gegenwart von KT 5823 auf die Permeabilität
4.2.8Wirkung von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin und KT 5823 auf die Permeabilität
5 Diskussion
5.1Zentrales Ergebnis
5.2Regulation der Nukleotide
5.3Antagonistische Wirkung der Nukleotide auf die Permeabilität
5.4Synergistische Wirkung der Nukleotide auf die Permeabilität
5.5Inverse Wirkung der Nukleotide auf die Permeabilität
5.6Inverse Wirkung von ANP auf die Permeabilität
5.7Gefäßspezifische Differenzierung der Endothelzellen
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literatur
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Danksagung
Lebenslauf
Anhang A Publikationen
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis

Abb. A: Inkubationskammmer: (1) Endotheliales Monolayer (2) Trypanblau-markiertes Albumin (3) Luminales Kompartment (4) Abluminales Kompartment (5) magnetischer Mikrorührer.
Abb.1: Konzentrationsabhängige Einflüsse von 8-Br-cGMP und 8-Br-cAMP auf die koronar-endotheliale Permeabilität. Jeweils 30. Minute nach Zugabe. Die Ausgangspermeabilität betrug 5,45 x 10-6cm/s und wurde als 100% gewählt. Bei 5 x 10-6M ergaben sich jeweils optimale Wirkungskonzentrationen. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.2: 100 Minuten Zeitverlauf der Permeabilität nach Zugabe von 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP (je 5 x 10-6M) in CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.3 a/b: Einfluß von ANP (100nM) auf die zellulären cGMP- (3a) bzw. cAMP- (3b) Spiegel in CEC. Der basale Gehalt der Kontrollen betrug für cAMP 1700 fmol/mg Protein und für cGMP 400 fmol/mg Protein. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.4: Konzentrationsabhängiger Einfluß von ANP (100nM) auf die Albuminpermeabilität. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente,*p<0,05 vs.Kontrolle C.
Abb.5: Zeitabhängiger Einfluß von ANP (100nM) und C-ANP (100nM) auf die Albuminpermeabilität von CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.6a/b: Einfluß von C-ANP (100nM) auf die zellulären cGMP- (6a) und cAMP- (6b) Spiegel in CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.7: Konzentrationsabhängiger Einfluß von C-ANP (100nM) auf die Permeabilität. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.8a/b: Der permeabilitätssenkende Einfluß von ANP wird in Gegenwart des Proteinkinase G - Hemmstoffes KT 5823 (1µM) (8a) teilweise aufgehoben. In Gegenwart von Pertussistoxin - Hemmstoff des Gi-Proteins der Adenylatzyklase (= Negativkontrolle) - ist der permeabilitätssenkende Einfluß von ANP (8b) ebenfalls verringert, bei gleichzeitiger Hemmung der Proteinkinase G (KT 5823 - 1µM) wird die ANP-Wirkung vollständig aufgehoben. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C, # p<0,05 vs. ANP allein.
Abb.9a: Einfluß von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die zellulären Spiegel von cGMP und cAMP. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C, ,# p<0,05 vs. ANP allein.
Abb.10a/b: Der permeabilitätssenkende Einfluß von C-ANP (100nM) wird von KT 5823 (1µM) (10a) nicht beeinflußt. Pertussistoxin (1µM) hebt den permeabilitätssenkenden Einfluß von C-ANP (100nM) auf (10b). KT 5823 (1µM) bleibt ohne Effekt. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.9b: Einfluß von C-ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die zellulären Spiegel von cGMP und cAMP. CEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C, # p<0,05 vs. ANP allein.
Abb.11: Konzentrationsabhängige Einflüsse von 8-Br-cGMP und 8-Br-cAMP auf die aortalendotheliale Permeabilität. 30. Minute nach Zugabe. Die Ausgangspermeabilität betrug 5,5 x 10-6cm/s und wurde gleich 100% gesetzt. Bei 5 x 10-6M ergaben sich jeweils optimale Wirkungskonzentrationen. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.12: 100 Minuten Zeitverlauf der Permeabilität nach Zugabe von 8-Br-cAMP und 8-Br-cGMP (je 5 x 10-6 M) in AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.13 a/b: Einfluß von ANP (100nM) auf die zellulären cGMP- (13a) und cAMP- (13b) Spiegel in AEC. Der basale Gehalt der Kontrollen betrug für cAMP 1550 fmol/mg Protein und für cGMP 370 fmol/mg Protein. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.14: Konzentrationsabhängiger Einfluß von ANP (100nM) auf die Albuminpermeabilität. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.15: Zeitabhängiger Einfluß von ANP (100nM) und C-ANP (100nM) auf die Albuminpermeabilität von Monolayern in AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente,*p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.16a/b: Einfluß von C-ANP (100nM) auf die zellulären cGMP- (16b) und cAMP- (16a) Spiegel in AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.17: Konzentrationsabhängiger Einfluß von C-ANP (100nM) auf die Permeabilität. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.18 a/b: Der permeabilitätssteigernde Einfluß von ANP wird in Gegenwart des Proteinkinase G - Hemmstoffes KT 5823 (1µM) (18a) teilweise aufgehoben. In Gegenwart von Pertussistoxin (= Negativkontrolle) ist der permeabilitätssteigernde Einfluß von ANP verringert (18b), bei gleichzeitiger Hemmung der Proteinkinase G (KT 5823 - 1µM) wird die ANP-Wirkung vollständig aufgehoben. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C, # p<0,05 vs. ANP allein.
Abb.19 a: Einfluß von ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die zellulären Spiegel von cGMP und cAMP. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C, ,# p<0,05 vs. ANP allein.
Abb.20a/b: Der permeabilitätssenkende Einfluß von C-ANP (100nM) wird von KT5823 (1µM) (20b) nicht beeinflußt. Pertussistoxin (1µM) (20a) hebt den permeabilitätssteigernden Einfluß von C-ANP (100nM) auf. KT 5823 (1µM) bleibt ohne weiteren Effekt. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C.
Abb.19 b: Einfluß von C-ANP in Gegenwart von Pertussistoxin auf die zellulären Spiegel von cGMP und cAMP. AEC, Angaben als Mittelwerte +/- SD, n = 6 unabhängige Experimente, *p<0,05 vs. Kontrolle C, # p<0,05 vs. ANP allein.
Abb.B: ANP-Wirkung in koronaren und aortalen Endothelzellen.

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Dec 23 16:52:02 2002