1. Summary

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This thesis is a contribution to the field of stress ecology specifically of behavioural ecotoxicology which focuses on the behaviour of animals under the influence of environmental pollutants. For analysing potential species-specific reactions to chemical stressors, two fish species were chosen: the tropical species Danio rerio (zebrafish) that is often used in toxicological research and the temperate species Leucaspius delineatus (sunbleak). Using the spontaneous locomotor behaviour of fish as a toxicological parameter, sublethal effects to the naturally occurring cyanotoxin microcystin-LR (MC-LR) and a characteristic man-made chemical 2.4.4`-trichlorobiphenyl (PCB 28) were investigated under laboratory conditions. Swimming activity of fish (motility and number of turns) was monitored continuously by using an automated video-monitoring and object-tracing system. For analysing cyclic aspects the basic behavioural analyses were combined with chronobiological procedures such as time series analysis and power spectral analysis.

Using the above methods it was shown that dissolved MC-LR concentrations between 0.5 and 50 µg l-1 and PCB 28 concentrations at 100 and 150 µg l-1 acted as stressors and caused significant changes in the behaviour and circadian activity rhythms of Danio rerio as well as Leucaspius delineatus. For both species elevated concentrations of the stressors led to a reduction of their activity.

Some dose-responses correspond to the hormesis theory, since there was an increase of daytime activity level at lower MC-LR concentrations and a decrease of these effects at elevated concentrations of MC-LR for both Danio rerio and Le u caspius delineatus. Furthermore for Danio rerio the synchronisation between activity rhythms and their zeitgeber was stronger at lower MC-LR concentrations and weaker at higher MC-LR concentrations compared to the control as indicated by the power spectral analysis.

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The regression analysis between number of turns and motility was indicative for stressor-induced effects on swimming mode of fish. For Danio rerio the significantly decreased slope of the regression at the highest MC-LR concentration of 50 µg l-1 indicated that the fish decreased the number of turns at a given motility and swam more smoothly. However PCB 28 did not affect the swimming mode of Danio rerio. For Leucaspius delineatus the slope of regression increased under the influence of MC-LR as well as PCB 28, indicating the fish swam more jerkily under exposure.

The data show the importance of evaluating the activity levels differentiated according to daylight and nighttime activity. So decreases of daytime activity under exposure of MC-LR and PCB 28 are, at least partly, compensated for by increases in nighttime activities for Leucaspius delineatus. The same partly applies to the increase in daytime motility of Danio rerio at the lower MC-LR exposures that corresponded with decreases in the dark.

A degree of desynchronisation of activity to the zeitgeber light was caused by MC-LR in both fish species. For Danio rerio a phase delay occurred, whereby at all concentrations the changes could only be registered during the light phase. Therefore, Danio rerio remained diurnally active. In contrast, the phase of Le u caspius delineatus advanced, whereby this shift was so drastic that a phase reverse occurred, and this species became significantly nocturnal.

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Influenced by PCB 28 a degree of desynchronisation to the light/dark change which led to a phase advance, was only found for Leucaspius delineatus. Both speciesremained diurnally active, whereby the values of the effects of zeitgeber were significantly reduced for Danio rerio as well as Leucaspius d e lineatus.

A single cosinor model using a non-linear regression procedure determined the circadian rhythms of locomotor activity. In both Danio rerio and Leucaspius d e lineatus cosinor analysis revealed MC-LR- and PCB 28-induced, dose-dependent alterations of the mean of oscillation (MESOR), amplitude, acrophase and period length to a different extent.

The power spectral analysis with their amplitude coefficients which gives a measure of how well the activity rhythms of fish fit infradian, circadian and ultradian sinusoidal frequencies, showed that the dominance of the circadian rhythmic peak (of 24 h) was reduced under the influence of elevated concentrations of MC-LR and PCB 28 for both species. For Leucaspius delineatus simultaneously the proportion of a harmonic oscillation with a 12 h rhythm peak increased at all MC-LR concentrations.

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Since the observed differences in the reactions of Danio rerio and Leucaspius d e lineatus to MC-LR and PCB 28 were rather small, the results of the species Danio rerio which is widely used for environmental risk assessment tests, are comparable to those of the native European species Leucaspius delineatus.

The findings of this study proved that the basic behavioural analyses combined with chronobiological procedures such as time series analysis could be valuable tools for the study of stressful or even harmful environmental factors in the field of ecotoxicology as well as for biomonitoring.

1.1 Zusammenfassung

Diese Dissertation ist ein Beitrag zu dem Forschungsfeld der Stressökologie, im Speziellen der Verhaltensökotoxikologie, in der das Verhalten von Tieren unter dem Einfluss von Schadstoffen untersucht wird. Für die Analyse potentieller artspezifischer Reaktionen auf chemische Stressoren wurden zwei verschiedene Fischarten untersucht: die häufig in toxikologischen Tests verwendete tropische Art Danio rerio (Zebrabärbling) und die euroasiatische Art Leucaspius delineatus (Moderlieschen). Das Verhalten wurde als Parameter zur Indikation subletaler Effekte des natürlich vorkommenden Cyanotoxins Microcystin-LR und des Xenobiotikums 2.4.4`-Trichlorobiphenyl (PCB 28) ausgewählt. Die Schwimmaktivität der Fische (Motilität und Anzahl der Wendungen) wurde kontinuierlich mit Hilfe eines automatischen Video-Monitoring- und Objektverarbeitungssystems unter Laborbedingungen aufgezeichnet. In Hinblick auf zyklische Aspekte wurden die Verhaltensanalysen mit chronobiologischen Methoden der Zeitreihenanalyse kombiniert.

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Hiermit wurde gezeigt, dass MC-LR Konzentrationen zwischen 0,5 und 50 µg l-1 und PCB 28 Konzentrationen von 100 und 150 µg l-1 zu signifikanten Effekten auf das Verhalten und die Aktivitätsrhythmik beider Fischartenführten. Höhere Konzentrationen beider Untersuchungssubstanzen verursachten eine deutliche Aktivitätsreduzierung bei Danio rerio und Leucaspius delineatus.

Einige der festgestellten Dosis-Wirkungsbeziehungen entsprechen der Hormesistheorie, da bei geringeren MC-LR Konzentrationen ein Aktivitätsanstieg und bei höheren MC-LR Konzentrationen ein Aktivitätsabfall beider Fischarten zu verzeichnen war. Darüber hinaus war bei Danio rerio die Synchronisation zwischen Aktivitätsrhythmus und Zeitgebern bei geringeren MC-LR Konzentrationen stärker und bei höheren MC-LR-Konzentrationen schwächer im Vergleich zur Kontrolle, indiziert mit Hilfe der Power Spektral Analyse.

Die Regressionsanalyse zwischen der Anzahl an Wendungen und der Motilität eignete sich zur Analyse der Schwimmmuster. Bei Danio rerio wurde unter dem Einfluss der höchsten Konzentration von MC-LR ein signifikant geringerer Anstieg der Regressionsgeraden registriert, der anzeigte, dass die Fische die Anzahl der Wendungen bei gegebener Schwimmgeschwindigkeit reduzierten und somit expositionsbedingt eine ruhigere Schwimmweise zeigten. PCB 28 beeinflusste das Schwimmmuster von Danio rerio jedoch nicht. Bei Leucaspius delineatus führten höhere Konzentrationen von MC-LR und PCB 28 zu einem Anstieg der Regressionsgeraden und indizierten eine unruhigere Schwimmweise.

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Die Daten zeigen die Bedeutung der Auswertung der Aktivitätslevel unterschieden nach Tag- und Nachtaktivität. So wurde der Abfall der Aktivität während der Hellphase bei Exposition mit MC-LR und PCB 28 teilweise kompensiert durch einen Anstieg in der Aktivität während der Dunkelphase. In vergleichbarer Weise wurde der Anstieg der Aktivität während der Hellphase bei geringer MC-LR Exposition teilweise ausgeglichen mit einem Aktivitätsabfall in der Dunkelphase. Die MC-LR Exposition verringerte bei beiden Testfischarten die Synchronisation der Aktivität mit dem Zeitgeber Licht-Dunkel-Wechsel. Dies führte bei beiden Fischarten zu einer Phasenverschiebung. Bei Danio rerio wurden die Aktivtätspeaks zu einem späteren Zeitpunkt registriert, wobei die Tagaktivität der Fische erhalten blieb. Bei Leucaspius delineatus verschoben sich die Peaks unter dem Einfluss von MC-LR zu einem früheren Zeitpunkt hin, wobei eine Phasenumkehr zu verzeichnen war und die Fische von Tag- zu Nachtaktivität wechselten.Die PCB 28 Exposition führte nur bei Leucaspius delineatus zu einer Verringerung der Synchronisation mit dem Licht-Dunkel-Wechsel, der von einer Phasenverschiebung begleitet war. Beide Fischarten blieben tagaktiv, wobei der berechnete Wert für die Zeitgeberwirkung unter dem Einfluss von PCB 28 signifikant reduziert war.

Die circadianen Rhythmen der Schwimmaktivität wurden durch ein Cosinor-Modell unter Verwendung einer nichtlinearen Regression bestimmt. Die Cosinor-analyse zeigte Dosis abhängige Veränderungen von MESOR (durchschnittlicher Wert der Oszillation), Amplitude, Akrophase und Periodenlänge von Danio rerio und Leucaspius delineatus unter dem Einfluss von MC-LR und PCB 28 an.

Die Power Spektral Analyse, deren Amplitudenkoeffizienten den Anteil infradianer, circadianer und ultradianer Frequenzen am Gesamtspektrum anzeigen, indizierte für beide Fischarten unter der Einwirkung höherer MC-LR and PCB 28 Konzentrationen eine reduzierte Dominanz des circadianen Rhythmuspeaks. Bei Leucaspius delineatus war gleichzeitig ein Anstieg einer Oszillation mit einem 12 Stunden Rhythmus zu verzeichnen.

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Da die registrierten Unterschiede in der Reaktion von Danio rerio and Leucaspius delineatus auf MC-LR und PCB 28 eher gering waren, sind die Ergebnisse der Fischart Danio rerio,die häufigin Toxizitätstestsverwendet wird, mit denen der einheimischen Art Leucaspius delineatus vergleichbar.

Die Ergebnisse dieser Studie belegen, dass Verhaltensuntersuchungen in Kombination mit chronobiologischen Auswertemethoden eine sensitive und zuverlässige Abschätzung des Gefährdungspotentials von Substanzen sowohl auf dem Gebiet der Ökotoxikologie als auch für Biomonitoring ermöglichen.


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01.08.2006