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1  Einführung

Die Fusion biologischer Membranen ist ein essentieller Schritt vieler zellulärer Prozesse. So sind zum Beispiel Transportvorgänge hochmolekularer Stoffe in einer Zelle (Exo- und Endozytose) mit einer Membranfusion gekoppelt. Sie ermöglicht außerdem die Verschmelzung der Gameten im Rahmen der geschlechtlichen Fortpflanzung oder der Myoblasten während der Myogenese, bei der sich vielkernige Skelettmuskelzellen bilden. Auch für Viren, die von einer Lipiddoppelschicht als Hülle umgeben sind, ist die Fusion von großer Bedeutung. Die für die Vermehrung dieser Viren notwendige Freisetzung des Virusgenoms in die Wirtszelle findet nach einer Verschmelzung der Virushülle mit der Zell- bzw. Endosomenmembran statt. Diese Membranfusion wird von viruskodierten Glykoproteinen, die aus der Virushülle herausragen, vermittelt. Oft werden diese umhüllten Viren zur Untersuchung von proteinvermittelten Fusionsprozessen eingesetzt. Sie lassen sich gut manipulieren und sind leicht in der Handhabung. Außerdem dienen Untersuchungen der Mechanismen der Virusinfektion zur Entwicklung besserer Schutz- und Therapiemöglichkeiten von Viruskrankheiten. Die Erkenntnisse über virale Glykoproteine und proteinvermittelte Fusion führen heutzutage soweit, daß sie als Transfersysteme neue Wege und Technologien in Medizin und Gentherapie zur Behandlung anderer Krankheiten öffnen.

1.1 Aufbau und Vermehrung der Myxoviren

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Hüllviren Sendaivirus, Simianvirus 5 und Influenzavirus A. Das Sendaivirus (hemagglutinating virus of Japan; Murines Parainfluenzavirus Typ I) aus der Familie Paramyxoviridae (Gattung Respirovirus) wurde 1952 erstmalig in Sendai (Japan) isoliert. Es verursacht bei Mäusen eine akute Lungenentzündung. Das Simianvirus 5 (Simian Parainfluenzavirus 5) gehört der Gattung [Seite 9↓] Rubulavirus der Familie Paramyxoviridae an und verursacht bei Hunden Atemwegskrankheiten wie Husten. Das Influenzavirus A aus der Familie Orthomyxoviridae ist bekanntlich für Grippeepidemien und –pandemien beim Menschen verantwortlich. Außerdem ist es auch tierpathogen (Vögel, Säuger). Die Paramyxo- und Orthomyxoviren werden unter dem Begriff Myxoviren zusammengefaßt.

Die Myxoviren besitzen Einzelstrang-RNA in Negativstrangorientierung. Bei Orthomyxoviren liegt die RNA im Gegensatz zu den Paramyxoviren in mehreren Segmenten vor. Die RNA bildet zusammen mit einigen viralen Proteinen (siehe Tab. 1.1, 1.2) das Nukleokapsid, das von einer Lipiddoppelschicht umhüllt wird. Die Virushülle besteht aus Lipiden der Wirtszellmembran und unterschiedlichen viruskodierten Proteinen (siehe Tab. 1.1 und Tab. 1.2). An der intraviralen Seite der Hülle bildet ein Matrixprotein eine elektronendichte Schale und verbindet das Nukleokapsid mit der Lipiddoppelschicht. Das Sendaivirus (SeV) und das Simianvirus 5 (SV5) haben zwei Arten von membranständigen Glykoproteinen: die Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) und das Fusionsprotein (F). Diese Proteine ragen weit aus der Membran und sind im Elektronenmikroskop als „Spikes“ sichtbar, daher werden sie auch Spikeproteine genannt. Das Influenzavirus besitzt drei integrale Membranproteine: das Matrixprotein M2, die Neuraminidase (NA) und das Hämagglutinin (HA). Die letzten beiden sind glykolisierte Spikeproteine. Die viralen Glykoproteine sind Hauptantigene für die Immunantwort und daher von besonderer Bedeutung für Diagnostik, Therapie und Prophylaxe (Vakzinierung) von viralen Infektionen. Es sind auch Nichtstrukturproteine vorhanden, wie NS1 und NS2 bei Influenza, das C-Protein des SeV oder die V- und SH-Proteine des SV5. Das SH-Protein (small hydrophobic protein) besitzen nicht alle Paramyxoviren. Bis jetzt wurden nur bei SV5, Respiratory-Syncytial-Virus und Mumpsvirus das SH, das Merkmale eines membranassoziierten Proteins hat, gefunden ( Hiebert et al., 1988 ; Heminway et al., 1994 ) . Interessanterweise treten nach einer SV5-Infektion von MDBK-Zellen sehr geringe und verzögerte zytophatische Effekte auf, offenbar ist das SH bei der Hemmung der Apoptose in den Zellen beteiligt ( He et al., 2001 ).

Die Hüllviren vermehren sich ausschließlich in lebenden Zellen. Die Infektion der Wirtszelle erfolgt bei Para- und Orthomyxoviren in mehreren Etappen, die sich am Anfang wesentlich voneinander unterscheiden (Abb. 1.1.1). Der erste Schritt ist die Bindung (Attachment) der Viren an die sialinsäurehaltigen Rezeptoren der Targetmembran. Diese Bindung wird bei Influenzaviren durch das HA und bei SeV bzw. SV5 durch das HN
[Seite 10↓] Tab. 1 .1:Charakterisierung der Proteine des Influenzavirus A. Die Molekulargewichte der Proteine wurden aus der Datenbank Swiss-Prot entnommen.

Protein

Molekular-

gewicht (kDa)

Eigenschaft

Funktion

HA

75-80

glykolisiertes

Membranprotein Typ I;

Trimer

Bindung an Neuraminsäure,

Hämagglutination;

Fusions- und Hämolyseaktivität

NA

55-70

glykolisiertes

Membranprotein Typ II;

Tetramer

Neuraminidaseaktivität

(Abspaltung endständiger

Neuraminsäurereste

und Ablösung

neugebildeter Virionen)

M1

25

Matrixprotein

Verbindung zwischen Nukleokapsid

und Virushülle;

Stabilisierung der Virushülle;

Morphogenese

M2

15

integrales Membranprotein

pH-regulierender Ionenkanal

PB1

96

Nukleokapsiduntereinheit

RNA-abhängige RNA-Polymerase

PB2

87

Nukleokapsiduntereinheit

RNA-Polymerase;

Bindung an 5‘-Cap-Strukturen

PA

85

Nukleokapsiduntereinheit;

sauer

Komponente der RNA-Polymerasecomplexes

NP

50-60

Hauptkomponente des

Nukleokapsids; basisch

Kerntransportsignal

NS1

25

Nichtstrukturprotein im

Nukleokapsid

Cofaktor beim RNA-Spleißen,

reguliert Export der gespleißten RNA

NS2

12

Nichtstrukturprotein im

Nukleokapsid

regulatorisches Protein

vermittelt. Die Influenzaviren werden nach der Bindung von der Wirtszelle endozytiert. Die Freisetzung des Virusgenoms in das Zellplasma erfolgt durch die HA-vermittelte Verschmelzung der Virushülle mit der endosomalen Membran nach Ansäuerung des endosomalen Lumens ( Doms et al., 1985 ; Hoekstra, 1989 ) . Bei SeV und SV5 fusioniert die Virushülle direkt mit der Plasmamembran in neutralem Milieu (pH~7.4), wobei die Membranfusion vom F-Protein vermittelt wird. Die weiteren Schritte der Replikation sind bei

Tab. 1. 2 :Charakterisierung der Proteine des Sendaivirus, Stamm Z (SeV) und Simianvirus 5, Stamm W3 (SV5). Die Angaben zum Molekulargewicht wurden aus der Datenbank Swiss-Prot entnommen. (-) - das Protein ist beim entsprechen Virus nicht vorhanden.

Protein

Molekulargewicht

(kDa)

Eigenschaften

Funktion

SeV

SV 5

F

59

55

glykolisiertes

Membranprotein Typ I;

Trimer

Fusions- und Hämolyseaktivität

HN

63

62

glykolisiertes

Membranprotein Typ II;

Tetramer

Adsorption, Hämagglutination;

Neuraminidaseaktivität

M

38.6

42

Matrixprotein

Verbindung zwischen

Nukleokapsid und Virushülle;

Stabilisierung der Virushülle

NP

56.8

56.5

Nukleokapsidprotein;

Wechselwirkung mit M

verantwortlich für die korrekte

Faltung und Verpackung

des Nukleokapsids

L

253

256

Nukleokapsiduntereinheit

RNA-abhängige RNA-Polymerase; Proteinkinase

P

62

42

Nukleokapsiduntereinheit,

phosphoryliert

RNA-abhängige RNA-Polymerase

C

24

-

Nichtstrukturprotein

Hemmung der Genomtranskription

V

-

24

Nichtstrukturprotein

Insertion von G-Resten durch

RNA-Editing

SH

-

5

Nichtstrukturprotein

(small hydrophobic

protein)

Hemmung der Apoptose

der Wirtszellen

den Myxoviren sehr ähnlich. Da sie eine Negativstrang-RNA haben, muß das Genom zunächst in einen komplementären Plusstrang transkribiert werden. Alle drei mit der Nukleinsäure komplexierten Proteine (bei Influenza: PA, PB1, PB2; bei SeV bzw. SV 5: L, P, NP) sind für den Ablauf der Transkription notwendig. Die RNA-Replikation findet im Zellkern statt, wogegen die gleichzeitige Proteinsynthese im Zytoplasma abläuft. Die membranständigen Proteine werden anschließend im Golgi-Apparat modifiziert und zur Zelloberfläche transportiert. Die Nukleokapsidproteine werden in den Zellkern transportiert. Dort wird der Ribonukleoprotein-Komplex verpackt und an der Plasmamembran der [Seite 12↓] Wirtszelle angelagert. Dieser Teil der Membran mit den eingelagerten Membranproteinen schnürt sich ab (Budding) und bildet ein neues Virion ( Hoekstra, 1990 ; Stegmann und Helenius, 1993 ; Levine, 1993 ) .

Abb. 1 .1.1:Schematische Darstellung des Vermehrungszyklus von Ortho- und Paramyxoviren. Weitere Details siehe Text. Mit freundlicher Genehmigung von K.Ludwig.

1.2 Spikeproteine des Influenzavirus

Das Influenzavirus A besitzt zwei Spikeproteine: die Neuraminidase (NA) und das Hämagglutinin (HA). Die tetramerische Neuraminidase kann Sialinsäuremoleküle von der Oberfläche der Zellen oder Viruspartikeln abspalten. Diese Spaltungsreaktion ermöglicht die Trennung neugebildeter Viruspartikeln von der Wirtszelle. Die NA entfernt auch die [Seite 13↓] Sialinsäure vom HA-Protein selbst und verhindert so die Zusammenlagerung der Viren aneinander ( Levine, 1993 ). Die dreidimensionale Struktur der NA wurde 1983 mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt ( Varghese et al., 1983 ).

Das Hämagglutinin vermittelt sowohl die Bindung der Viren an sialinsäurehaltige, zelluläre Rezeptoren als auch die Fusion der Virushülle mit der Targetmembran ( Wiley und Skehel, 1987 ; White, 1992 ) . Es wird zunächst als fusionsinaktives Vorläuferprotein HA0 synthetisiert, das glykolisiert und trimerisiert vorliegt. Die fusionskompetente Form des HA-Trimers entsteht nach der Spaltung des HA0 durch zelleigene Proteasen im trans -Golgi-Netzwerk. Jedes Monomer des membranständigen HA-Trimers besteht dann aus zwei Untereinheiten HA1 und HA2, die durch eine Disulfidbrücke kovalent aneinander gebunden sind. HA1 trägt die Rezeptorbindungsstelle und bildet den globulären Kopf und einen Teil des fibrinogenen Stammes der HA-Ektodomäne, den Stamm bildet HA2. Außerdem beinhaltet HA2 die transmembranale Domäne aus 24-28 ungeladenen, hydrophoben Aminosäuren und die C-terminale intravirale Domäne. Am N-Terminus des HA2 befindet sich das sogenannte Fusionspeptid, das innerhalb der Virusfamilie hochkonserviert ist. Es besteht aus ca. 24 hydrophoben Aminosäuren und spielt eine essentielle Rolle bei der Fusionsvermittlung durch das HA ( White, 1990 ). Punktmutationen in dieser Sequenz führen zu einer drastischen Reduktion der Fusionsaktivität des HA ( Daniels et al., 1985 ; Gething et al., 1986 ; Steinhauer et al., 1995 ). Das Fusionspeptid befindet sich in einem Abstand von ca. 30 Å über der Virushülle und ist zum hydrophoben Kern des HA-Trimers orientiert (Wilson et al., 1981).

Die gesamte Ektodomäne ragt etwa 135 Å aus der Membran und kann durch eine Bromelainbehandlung abgespalten werden. Die so isolierte HA-Ektodomäne (BHA, „bromelain-cleaved“ HA) konnte auskristallisiert werden, und die Röntgenkristallstruktur des BHA mit einer Auflösung von 3 Å bei neutralem Milieu bestimmt werden ( Wilson et al., 1981 ). Allerdings ist diese Struktur des HA nicht fusiogen. Bei niedrigen pH-Werten (5-6) findet eine irreversible Konformationsumwandlung des HA statt. Nur nach dieser Strukturänderung ist das HA in der Lage eine Membranfusion zu induzieren (mehr dazu siehe Abschnitt 1.4.1).


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1.3  Spikeproteine des Sendaivirus und Simianvirus 5

SeV und SV5 haben jeweils zwei Spikeproteine. Die Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) besitzt sowohl eine Hämagglutinin- als auch eine Neuraminidaseaktivität. Sie vermittelt die Bindung der Viren an sialinsäurehaltige, zelluläre Rezeptoren sowie die Ablösung und Freisetzung neugebildeter Viruspartikeln ( Huberman et al., 1995 ) . Die HN-Moleküle liegen in der Virushülle oligomerisiert vor, wobei die Untereinheiten der Dimere über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die Ausbildung von Tetrameren hingegen erfolgt durch nichtkovalente Bindung zwischen den Dimeren (Markwell und Fox, 1980 ; Parks und Lamb, 1990 ) . Die Struktur des globulären Kopfs der HN-Ektodomäne eines Paramyxovirus, des Newcastle-Disease-Virus (NDV), konnte mittels Röntgenkristallographie mit einer Auflösung von 2.5 Å aufgeklärt werden ( Crennell et al., 2000 ) . Man nimmt an, daß an der gleichen Stelle des HN-Moleküls sowohl die Bindung als auch die Hydrolyse der Sialinsäuren stattfindet und die Funktion durch den Zustand der HN-Struktur bestimmt wird ( Crennell et al., 2000 ; Connaris et al., 2002 ) .

Das zweite Spikeprotein des SeV und SV5 ist das Fusionsprotein (F-Protein). Es vermittelt die Verschmelzung der Virushülle mit der Membran der Wirtszelle und ist ebenfalls für die Hämolyse sowie Zell-Zell-Fusion verantwortlich (Scheid und Choppin, 1974 ) . Die Fusionsproteine des SeV und SV5 sind glykolisiert, und die Kohlenhydrateinheiten haben endständige Galaktose ( Yoshima et al., 1981 ; Prehm et al., 1979 ) . Das SeV-F bzw. SV5-F hat viele Gemeinsamkeiten mit dem Influenza-HA. Es wird ebenfalls als nichtfusiogenes Vorläuferprotein F0 (~60 kDa) synthetisiert, das im trans -Golgi-Netzwerk durch trypsin-ähnliche zelluläre Proteasen in die fusionskompetente Form F1+F2 gespalten wird ( Yoshima et al., 1981 ; Prehm et al., 1979 ) . Dabei findet eine signifikante Strukturänderung des F-Proteins statt ( Hsu et al., 1981 ; Scheid und Choppin, 1974 ; Dutch et al., 2001 ) . Die entstandenen Untereinheiten F1 und F2 sind miteinander durch eine Disulfidbrücke verbunden (Abb. 1.3.1). Die F2-Untereinheit befindet sich außerhalb der Virushülle. Über das C-terminale Ende der F1-Untereinheit ist das F-Protein in der viralen Membran verankert. Die transmembranale Domäne besteht aus 23 meist hydrophoben Aminosäuren. Die darauffolgende intravirale Domäne der Paramyxoviren ist unterschiedlich lang. Am neu gebildeten N-Terminus der F1-Untereinheit befindet sich das Fusionspeptid aus [Seite 15↓] 25 hydrophoben Aminosäuren ( Homma und Ohuchi, 1973; Gething et al., 1978 ; Scheid und Choppin, 1977 ) . Ähnlich wie bei Influenza-HA ist das Fusionspeptid hochkonserviert und Punktmutationen des Fusionspeptids beeinflussen die Fusionsaktivität des F-Proteins ( Bagai und Lamb, 1997 ) . Außerdem sind zwei "heptad repeat" Sequenzen (HR) vorhanden, wobei die eine Sequenz unmittelbar nach dem Fusionspeptid folgt (HRN, N-terminal F1) und die andere Sequenz vor der transmembranalen Domäne lokalisiert ist (HRC, C-terminal F1). Das Fusionspeptid, die HRN und die HRC spielen eine entscheidende Rolle bei der Membranfusion (siehe Abschnitt 1.4).

Abb. 1.3.1:Schematische Darstellung der Monomere des SeV-F und des SV5-F. FP: Fusionspeptid, HRN: "heptad repeat" N-terminal, HRC: "heptad repeat" C-terminal, TM: transmembranale Domäne, -S-S-: Disulfidbrücke zwischen F1 und F2. Die Numerierung entspricht der Aminosäuresequenz der Vorläuferproteine.

Die Oligomerstruktur des SeV-F wurde mittels homobifunktionaler Crosslinker bestimmt ( Sechoy et al., 1987 ). Nach dem Crosslinking wurden neben Monomeren mit einem Molekulargewicht von ~60 kDa Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von ~120 kDa identifiziert. Folglich wurde angenommen, daß SeV-F ein Homotetramer aus zwei Dimeren ist. Aber spätere Untersuchungen an F-Proteinen anderer Paramyxoviren, wie des SV5, des NDV und des Human-Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3) mit Hilfe homobifunktionaler Crosslinker und Saccharosegradienten ergaben, daß das F-Protein der untersuchten Viren als Homotrimer organisiert ist ( Russel et al., 1994 ) . Wahrscheinlicher ist daher die Annahme, daß das SeV-F ebenfalls ein Homotrimer ist (siehe auch "Ergebnisse" und "Diskussion").

Die dreidimensionalen (3D) Strukturen des SeV-F und SV5-F sind nicht bekannt. Die [Seite 16↓] 3D-Struktur des NDV-F-Proteins wurde 2001 mittels Röntgenkristallographie mit einer Auflösung von 3.3 Å aufgeklärt (Chen et al., 2001) . Dabei handelt es sich um einen Teil der trimeren F-Ektodomäne oberhalb der HRC. Das NDV-F besteht aus einem zur Virushülle distalen Kopf, einer mittleren Hals- und einer zur Virushülle proximalen Stielregion. Obwohl für die Kristallisation das NDV-F in der F0-Form exprimiert wurde, konnte mittels SDS-PAGE festgestellt werden, daß F0 proteolysisch gespalten war. Da nach der Umwandlung des F0 in die F1+F2-Form eine Konformationsänderung des F-Proteins stattfindet, ist noch unklar inwieweit diese Spaltung die Kristallstruktur beeinflußt hat und welchem Zustand des F-Proteins die Kristallstruktur entspricht. Daher gibt es bislang keine eindeutigen Informationen über die 3D-Struktur des F-Proteins eines Paramyxovirus.

1.4 Die Membranfusion

Die Fusion biologischer Membranen ist ein komplexer Vorgang, der mehrere Schritte umfaßt. Der genaue Mechanismus der Membranverschmelzung ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Es existieren eine Reihe von Modellen für die proteinvermittelte Membranfusion (siehe Übersichtsartikel Jahn und Grubmüller, 2002 ). Einigen dieser Modelle lagen Untersuchungen an Hüllviren, insbesondere Influenzaviren, zugrunde. Daher soll im folgenden Abschnitt auf die wesentlichen Schritte der HA-vermittelten Fusion näher eingegangen werden.

1.4.1 Die HA-vermittelte Fusion

Damit das HA eine Fusion vermitteln kann, bedarf es zwingend einer Konformationsänderung. Diese Strukturumwandlung wird durch eine pH-Erniedrigung induziert (White et al., 1982) . Wie oben beschrieben, werden Influenzaviren in vivo nach der Bindung an Wirtszellen endozytiert. Während der Reifung der Endosomen wird das Endosomenlumen durch Protonenpumpen angesäuert, was die nötige pH-Erniedrigung für die Induktion der Konformationsumwandlung des HA-Proteins. In vitro kann man den [Seite 17↓] Endozytoseweg umgehen, und die Influenzaviren nach der Bindung an eine geeignete Targetmembran durch die Erniedrigung des pH-Wertes des umgebenden Mediums zur Fusion veranlassen. Die Energie für die Umstrukturierung des HA wird aber nicht ausschließlich durch die pH-Wert-Erniedrigung geliefert. Ein Hauptteil der nötigen Energie wird wahrscheinlich schon bei der Faltung des HA analog einer gespannten Falle gespeichert (Stuart, 1994) . Die pH-neutrale, fusionsinaktive Konformation des HA entspricht einem metastabilen Zustand. Die pH-Erniedrigung stellt lediglich den Schalter für die Konformationsumwandlung dar. Man nimmt an, daß die Protonierung die Wechselwirkung zwischen den HA1-Untereinheiten des HA-Trimers schwächt (Huang et al., 2002). Dadurch wird eine Reorganization der HA1-Domänen erreicht, die essentiell für die weitere HA-Strukturänderung ist (Godley et al., 1992; Kemble et al., 1992; Böttcher et al., 1999; Ludwig, 2000; Huang et al., 2002) .

In einer Zusammenarbeit unserer Arbeitsgruppe und dem Forschungszentrum für Elektronenmikroskopie, FU Berlin, konnte die 3D-Struktur des HA sowohl im fusionsinaktiven als auch fusionsaktiven Zustand mittels Einzelpartikelanalyse kryo-elektronenmikroskopischer Aufnahmen mit einer Auflösung von 10 Å bzw. 14 Å rekonstruiert werden (Böttcher et al., 1999; Ludwig, 2000) . Obwohl nach pH-Erniedrigung die typische Oberflächenstruktur des trimeren HA erhalten blieb, unterscheidet sich die fusionsaktive Struktur von der inaktiven durch die Abflachung der Kopfenden der HA1-Domänen und die Bildung eines Kanals durch das gesamte Trimer. Man nimmt an, daß die Reorganisation der HA1-Domänen und die Bildung eines zentralen Kanals genügend Raum für die Bildung der "coiled-coil"-Struktur bietet (Böttcher et al., 1999; Ludwig, 2000; Huang et al., 2002) . Diese trimere "coiled-coil"-Struktur entsteht nach dem "spring-loaded" Mechanismus durch einen Loop-zu-Helix-Übergang im HA2 (Carr und Kim, 1993) . Dabei geht der Loop im HA2 zu einem α-Helix über und das neu entstandene durchgehende Helix wird zum Bestandteil einer sogenannten "extended coiled-coil"-Struktur (Abb. 1.4.1 A, B der Loop ist durch eine schwarze Schleife bzw. durch ein schwarzes Stäbchen dargestellt). Das Fusionspeptid wird durch diese Umfaltung der HA2-Untereinheit aus dem Inneren des HA-Trimers Richtung des zur Virushülle distalen Ende exponiert. Anschließend tauchen die Fusionspeptide in die Targetmembran ein (Abb. 1.4.1 B). Durch FTIP-Messungen mit dem isolierten Fusionspeptid konnte gezeigt werden, daß das Fusionspeptid mit der Targetmembran nicht nur in Kontakt tritt (Harter et al., 1989; Stegmann et al., 1991) , sondern [Seite 18↓] auch in einem definierten Winkel schräg in die Membran eintaucht (Lüneberg et al., 1995) .

Im nächsten Schritt der Konfomationsänderung beugt sich das Fusionsprotein um eine "Scharnierregion" durch einen Helix-zu-Loop-Übergang im HA2. Dabei binden sich α-Helices am N-terminalen Ende des HA-Trimers an α-Helices am C-terminalen Ende und

Abb. 1.4.1: Schritte der HA-vermittelten Membranfusion. Zur besseren Übersicht wurden nur zwei Monomere gezeigt. Weitere Details siehe Text. Mit freundlicher Genehmigung von A. Herrmann.


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bilden ein Sechs-Helix-Bündel aus antiparallelen "coiled-coil" (Abb. 1.4.1 C) (Bullough et al., 1994; Chen et al., 1999). Das antiparallele Helix-Bündel wurde nicht nur bei HA gefunden, sondern auch bei Fusionsproteinen unterschiedlicher Hüllviren wie des Retrovirus HIV-1 (Humanes-Immundefizienz-Virus), des Filovirus Ebolavirus und des Paramyxovirus SV5 (Chan et al., 1997; Weissenhorn et al., 1997; Weissenhorn et al., 1998; Baker et al., 1999) . Man nimmt an, daß durch dies Biegung des Fusionsproteins die nötige Annäherung der zu fusionierenden Membranen gewährleistet wird (Abb. 1.4.1 C). In neueren Studien wurde aber auch die Rolle der „extended coiled-coil“-Struktur, die in dem vorangegangenen Schritt gebildet wurde, für die Annäherung der Membranen diskutiert (Qiao et al., 1998; Gruenke et al., 2002) . Eine HA-Mutante, die aufgrund einer Punktmutation im HA2 keine korrekte "extended coiled-coil"-Struktur ausbilden konnte, war nicht in der Lage eine Membranfusion zu induzieren, obwohl nach der Strukturumwandlung das Fusionspeptid exponiert wurde und in die Targetmembran eintaucht. Daher geht man davon aus, daß das Umknicken der gesamten "extended coiled-coil" zum Zusammenbringen der zu fusionierenden Membranen notwendig ist (Gruenke et al., 2002) .

Das nächste identifizierte Fusionsintermediat ist die Hemifusion (Abb. 1.4.1 D). Mit einer HA-Mutante (GPI-HA), bei der die HA-Ektodomäne an Glycosylphosphatidylinositol (GPI) als Lipidanker gebunden ist, läßt sich die Hemifusion beobachten (Kemble et al., 1994; Melikyan et al., 1995; Nüßler et al., 1997) . Dabei verschmelzen die jeweils äußeren Lipidmonolayer der beiden Membranen miteinander und bilden ein sogenanntes Stalk, eine halsähnliche Struktur mit einer negativen Krümmung. Die noch nicht fusionierten inneren Lipidlayer formen eine "Diaphragma". Die Hemifusion ist ein metastabiler Zustand und sehr kurzlebig. Anschließend folgt die Bildung einer frühen Fusionspore mit einer Porengröße von 1-2 nm (Abb. 1.4.1 E) (Spruce et al., 1991) . Es ist jedoch noch nicht geklärt, ob diese Pore eine reine Proteinpore ist, die aus mehreren zusammengelagerten HA-Molekülen gebildet wird (Almers, 1990; Tse et al., 1993) , oder ob die Pore von Beginn an lipidisch ist (White, 1995; Chernomordik et al., 1995; Chernomordik et al., 1999) . Die frühen Poren können sich wiederholt öffnen und schließen ("flickering"). Schließlich findet eine irreversible Erweiterung der Fusionsporen statt (Abb. 1.4.1 F), wobei auch mehrere kleine Poren zu einer größeren Pore verschmelzen können. Der genaue Mechanismus der Porenerweiterung ist jedoch unklar.


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1.4.2  Die F-proteinvermittelte Fusion

Bei Paramyxoviren ist der Auslöser für die Fusion unbekannt. Es gibt Hinweise, daß das HN-Protein in diesen Prozeß involviert ist. Man nimmt an, daß nach der Bindung des HN an Rezeptoren eine Strukturänderung des HN stattfindet, und erst dadurch eine Wechselwirkung mit dem F-Protein eingeht. Diese Wechselwirkung ruft wiederum eine Konformationsänderung des F-Proteins hervor (Hu et al., 1992; Sergel et al., 1993; Lamb, 1993; Dallocchio et al., 1995; Bousse et al., 1994, Deng et al., 1995; Takimoto et al., 2002) . Allerdings kann die Konformationsumwandlung des F-Proteins und somit die Fusion, auch in Abwesenheit von HN ausgelöst werden. Es konnte gezeigt werden, daß isoliertes und in Lipidvesikel eingebautes SeV-F (SeV-F-Virosomen) und SeV-Mutanten, die kein HN besitzen, mit HepG2-Zellen fusionieren können (Markwell et al., 1985; Bagai et al., 1993; Leyrer et al., 1998) . Es scheint in diesem Falle ein spezifischer Rezeptor der HepG2-Zellen, der Asialoglykoproteinrezeptor (ASGP-R), der Glykoproteine mit endständiger Galaktose oder N-Acetylgalaktosamine erkennt (Ashwell und Harford, 1982) , für die Auslösung der Konformationsumwandlung ausreichend zu sein. Man nimmt an, daß das SeV-F an das ASGP-R bindet und nach einer rezeptorvermittelten Strukturumwandlung die Fusion mit der Zellmembran induziert (Markwell et al., 1985; Bagai et al., 1993; Bitzer et al., 1997; Leyrer et al., 1998) .

Die einzelnen Schritte der Strukturveränderungen des F-Proteins bzw. der F-vermittelten Fusion sind unbekannt. Untersuchungen mittels einer Fluoreszenzmarkierung der N-terminalen Sequenz des SeV-F oder einer Membranmarkierung mit photoaktiven Lipiden ergaben, daß das Fusionspeptid des F-Proteins ebenfalls in die Targetmembran eintaucht (Rapaport und Shai, 1994; Asano und Asano, 1985; Novick und Hoekstra, 1988) . Das Fusionspeptid kann stabil mit einer Membran wechselwirken und als Anker für andere Membranproteine dienen (Paterson und Lamb, 1987) .

Desweiteren konnte gezeigt werden, daß zwei gentechnisch hergestellte „heptad repeat“ Sequenzen, die der HRN und der HRC des SV5-F entsprechen, in Lösung ein stabiles stäbchenförmiges Sechs-Helix-Bündel bilden. Dieses Helix-Bündel besteht aus einem trimeren HRN-"coiled-coil", das von drei HRC-Helices in antiparalleler Richtung umgeben wird (Joshi et al., 1998; Dutch et al., 1999) . Auch bei zwei weiteren Paramyxoviren, dem Human-Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV) und dem NDV, bilden die "heptad repeat" [Seite 21↓] Sequenzen des F-Proteins ein Sechs-Helix-Bündel (Zhao et al., 2000; Yu et al., 2002). Dieser Helix-Komplex ist extrem stabil gegenüber hohen Temperaturen, Detergenzien und Proteasen (Lamb et al., 1999; Joshi et al., 1998; Zhao et al., 2000) . Die 3D-Struktur des Sechs-Helix-Bündels des SV5-F bzw. des HRSV-F wurde röntgenkristallographisch aufgeklärt und in Anlehnung an Strukturdaten anderer Fusionsproteine, wie das Influenzavirus-HA und das gp41 des HIV-1, geschlußfolgert, daß dieser Komplex einer Konformation des F-Proteins im fusionsaktiven Zustand entspricht (Baker et al., 1999; Zhao et al., 2000) . Auch die Tatsache, daß HRC die F-vermittelte Membranfusion vollständig hemmt, unterstützt diese Hypothese (Rapaport et al., 1995; Lambert et al., 1996; Joshi et al., 1998; Young et al., 1999) . Man nimmt an, daß HRC an HRN bindet und damit die Bildung des Sechs-Helix-Bündels verhindert. Dies wiederum inhibiert die Membranfusion, weil durch die Bildung der antiparallelen "coiled-coil"-Struktur die Lipidbilayer angenähert werden (siehe oben) (Ben-Efraim et al., 1999; Baker et al., 1999; Zhao et al., 2000; Melikyan et al., 2000) . Weiterführende Untersuchungen der "heptad repeat" Sequenzen deuten darauf hin, daß durch die hohe Affinität der HRN und der HRC zur Membran die Sechs-Helix-Bündel-Struktur sich öffnet und so die Lipidbilayer zusammen bringt (Abb. 1.4.2, a-c) (Ben-Efraim et al., 1999) . Die folgenden Fusionsschritte entsprechen wahrscheinlich der der HA-vermittelten Fusion.

Für die Paramyxovirus-vermittelte Membranfusion existiert jedoch ein weiteres Modell, welches auf der Annahme basiert, daß Paramyxoviren ein zweites internes Fusionspeptid besitzen (Peisajovich et al., 2000; Samuel und Shai, 2001; Peisajovich und Shai, 2002) . Synthetisch hergestellte Peptide, die der Aminosäuresequenz von 197 bis 229 des SeV-F entsprechen, sind in der Lage schon bei geringeren Konzentrationen im Vergleich zum N-terminalen Fusionspeptid eine Fusion zwischen Lipidvesikeln zu induzieren (Peisajovich et al., 2000; Ghosh et al., 2000) . Man postuliert, daß die internen Fusionspeptide mit der Targetmembran interagieren, nachdem die HRN und HRC das Sechs-Helix-Bündel gebildet haben und so die Annäherung der zu fusionierenden Membranen gewährleisten (Abb. 1.4.2).

Für diese Modelle gibt es jedoch keine direkten Hinweise. Die Anordnung der Domänen des F-Proteins, die in der Abbildung 1.4 dargestellt sind, basieren nur auf Vermutungen, weil die dreidimensionale Struktur des Sendaivirus-F noch unbekannt ist. Daher ist die Aufklärung der 3D-Struktur des SeV-F für das Verständnis des Fusionsmechanismus notwendig. Die Kenntnis der F-Protein-Struktur könnte auch Informationen über die fusion-induzierende Wechselwirkung zwischen den F- und HN-[Seite 22↓] Proteinen liefern. Für diese Zwecke wäre die Kenntnis der 3D-Struktur des F-Proteins des Simianvirus 5 besonders bereichernd. Das SV5 (Stamm W3A) unterscheidet sich von anderen Paramyxoviren dadurch, daß dessen in Zellen exprimiertes F-Protein auch in Abwesenheit des homotypischen HN-Proteins eine Zell-Zell-Fusion induzieren kann (Paterson et al., 1985; Ito

Abb. 1.4.2: Modelle für die SeV-F-vermittelte Membranfusion. (a-c) nach Ben-Efraim et al., 1999. Die Wechselwirkung mit der Targetmembran bzw. mit zellulären Rezeptoren induziert eine Strukturänderung des F-Proteins (a). Dabei taucht das N-terminale Fusionspeptid in die Targetmembran ein, und aus HRN und HRC entsteht die antiparallele "coiled-coil"-Struktur (b). Durch die Wechselwirkung mit dem Lipidbilayer öffnet sich die "coiled-coil"-Struktur (c). (a, d-f) basiert auf der Annahme, daß außer dem N-terminalen Fusionspeptid auch ein internes Fusionspeptid existiert. Nach dem Eintauchen des N-terminalen Fusionspeptides in die Targetmembran und der Bildung der "coiled-coil"-Struktur (d) interagiert das interne Fusionspeptid mit der Targetmembran und induziert die Öffnung der "coiled-coil"-Struktur (f). Oder das N-terminale Fusionspeptid taucht in die Virushülle ein, und den ersten Kontakt mit der Targetmembran stellt das interne Fusionspeptid her (e). Die Abbildung wurde aus Peisajovich et al., 2000 entnommen.


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et al., 1997) . Diese Eigenschaft des SV5-F könnte sich auch in der 3D-Struktur des Proteins widerspiegeln. Außerdem ist die Röntgenkristallstruktur des Sechs-Helix-Bündels, das durch HRN und HRC des SV5-F gebildet werden, bekannt. Daher könnte man nach der Aufklärung der 3D-Struktur des SV5-F im fusionsaktiven Zustand ermitteln, ob das Helix-Bündel während der Fusion tatsächlich ausgebildet wird und wenn ja, dann im welchem Intermediat der Fusion es entsteht (siehe nachfolgend).

1.5 Inhibierender Einfluß von Lysolipiden auf die Membranfusion

Zur Aufklärung der dreidimensionalen Struktur eines Fusionsproteins in einem Konformationszustand während der Membranfusion ist das "Einfangen" des Fusionsintermediats notwendig. Solche Möglichkeit bietet die Ausnutzung der fusionshemmenden Eigenschaften von Lysolipiden. Lysolipide sind Phospholipide, die nur eine Fettsäurekette besitzen, wodurch sie sich schnell und stabil in Zellmembranen einbauen können (Fujii et al., 1983) . Arbeiten an unterschiedlichen Fusionssystemen beschreiben den inhibierenden Einfluß von Lysolipiden auf die Membranfusion (Yeagle et al., 1994; Chernomordik et al., 1993; Vogel et al., 1993) . Nicht nur Virus-LUV-Fusion (Yeagle et al., 1994) und Zell-Zell-Fusion (Chernomordik et al., 1993; Vogel et al., 1993) , sondern auch Exozytose, Mikrosom-Mikrosom- (Chernomordik et al., 1993) und Granula-Granula-Fusion (Vogel et al., 1993) wurden durch Lysolipide gehemmt. Es wird vermutet, daß ein für alle Fusionssysteme einheitliches Intermediat, nämlich die Bildung von Stalks (siehe oben und Abb. 1.4.1 D), inhibiert wird. Wenn die Lysolipide im äußeren Monolayer der zu fusionierenden Membranen eingebaut sind, wirken sie gegen die negative Krümmung der Stalks, da die Molekülform der Lysolipide (umgekehrter Kegel) eine Struktur mit positiver Krümmung bevorzugt. Dadurch wird die Ausbildung bzw. Vergrößerung der Stalks verhindert (Chernomordik et al., 1987; Kozlov et al., 1989; Chernomordik et al., 1995; Chernomordik et al., 1997; Chernomordik et al., 1999;) . Nach den derzeitigen Modellen würde damit ein Fusionsintermediat eingefangen, in dem die Sechs-Helix-Bündel-Struktur bereits gebildet wurde: Erst die Bildung des Helix-Bündels soll die zu fusionierenden [Seite 24↓] Membran so nah aneinander bringen, daß die Membranverschmelzung stattfinden kann.

Günther-Ausborn und Mitarbeiter erklären den inhibierenden Effekt der Lysolipide auf die HA-vermittelte Membranfusion jedoch mit einem anderen Modell (Günther-Ausborn et al., 1995) . Sie nehmen an, daß die Lysolipide die Fusion in einem Schritt hemmen, der zeitlich vor der Stalkbildung liegt. Das Modell geht davon aus, daß sich die Lysolipide an das durch die pH-abhängige Konformationsumwandlung zugängliche hydrophobe Fusionspeptid des HA binden, so daß das Eintauchen des Peptides in die Targetmembran und somit die Lipidvermischung behindert wird (Günther-Ausborn et al., 1995) .

Obwohl die überwiegende Anzahl von Untersuchungen auf diesem Gebiet mit der Stalk-Theorie übereinstimmen, fehlen immer noch endgültige experimentelle Bestätigungen für diese Theorie. Ein Ziel dieser Arbeit ist daher aufzuklären, ob die Lysolipide die Fusion durch eine Wechselwirkung mit der Membran inhibieren oder durch eine Bindung an das Fusionspeptid.

1.6 Die Rolle der transmembranalen und intraviralen Domäne des Fusionsproteins bei der Membranfusion

Wenn bei der Initiation und den frühen Schritten der Membranfusion die Ektodomäne des Fusionsproteins bzw. das Fusionspeptid eine essentielle Funktion hat, so nimmt man an, daß die transmembranalen und intraviralen Domänen bei den späten Schritten der Membranfusion, wie der Bildung und Weitung der Fusionsporen, eine wichtige Rolle spielen.

Zur Untersuchung der Funktion der transmembranalen (TM) und intraviralen Domäne werden die viralen Fusionsproteine modifiziert und oft in Zellen exprimiert. Daher wird die intravirale Domäne auch zytoplasmatische (CT) Domäne genannt. Eine HA-Mutante, bei der die TM und CT Domänen fehlen und die HA-Ektodomäne an Glycosylphophatidylinositol (GPI-HA) als Membrananker gebunden ist, kann eine Hemifusion vermitteln (Kemble et al., 1994; Melikyan et al., 1995; Nüßler et al., 1997; Markosyan et al., 2000) . Dabei verschmelzen die äußeren Monolayer der Membran miteinander und können eventuell kleine Fusionsporen ausgebildet werden. Aber eine ausreichende Öffnung wäßriger Poren, die zur Erweiterung der Fusionsporen führen, wird inhibiert (Nüßler et al., 1997; Markosyan et al., [Seite 25↓] 2000) . Um die Öffnung und Weitung der Fusionsporen vermitteln zu können, ist vermutlich eine bestimmte Länge der TM Domäne des HA notwendig (Armstrong et al., 2000). Dies wurde an HA-Mutanten untersucht, bei denen die CT Domäne fehlte und bestimmte Aminosäuren (AS) der TM Domäne entfernt wurden. Die Autoren nehmen an, daß eine TM Domäne aus 17 AS zur Vermittlung einer vollständigen Fusion (d. h. Lipidvermischung und Öffnung wäßriger Fusionsporen) ausreichend ist, und eine TM Domäne mit 15 AS und weniger nur eine Hemifusion vermitteln kann (Armstrong et al., 2000) . Außerdem kann eine Entfernung der CT Domäne des HA die Fusionsgeschwindigkeit und die Virusinfektivität beeinflussen (Simpson und Lamb, 1992; Jin et al., 1994) .

Modifikationen der CT Domäne des F-Proteins von Paramyxoviren beeinflussen ebenfalls die finalen Fusionsintermediate (Bagai und Lamb, 1996; Dutch und Lamb, 2001; Sergel und Morrison, 1995) . Je mehr AS vom C-terminalen Ende des SV5-F entfernt werden, desto mehr wird die Erweiterung der Fusionsporen und die Vermischung der zytoplasmatischen Inhalte gehemmt (Bagai und Lamb, 1996; Dutch und Lamb, 2001). Durch eine Verkürzung der CT Domäne des NDV-F-Proteins wird die Synzytiumbildung inhibiert (Sergel und Morrison, 1995) . Es gibt jedoch kaum Untersuchungen, inwieweit eine Sequenzmodifikation der transmembranalen und zytoplasmatischen Domänen die fusiogene Eigenschaft des F-Proteins der Paramyxoviren beeinflußt. Deshalb soll in der vorliegenden Arbeit die Fusionsaktivität von F-Chimären, deren transmembranale und/oder zytoplasmatische Domäne durch entsprechenden Domänen anderer membranständiger Proteine ersetzt sind, untersucht werden. Diese Studien bieten außerdem Möglichkeiten zusätzliche Informationen zur Wechselwirkung des F-Proteins mit dem HN-Protein und die Funktion des HN-Proteins bei der Fusion zu erhalten.


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08.12.2003