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2  Zielstellung

Um sich zu vermehren, müssen Para- und Orthomyxoviren ihr genetisches Material in Wirtszellen einschleusen. Dies wird durch eine Fusion der Virushülle mit der Plasma- bzw. Endosomenmembran der Wirtszelle gewährleistet, die durch ein virales membranständiges Glykoprotein ausgelöst wird. Bei Influenzaviren, einem Orthomyxovirus, übernimmt das Hämagglutinin (HA) diese Funktion. Durch eine pH-Erniedrigung der Umgebung wird eine Konformationsänderung des HA von einem metastabilen in einen stabilen Zustand ausgelöst. Die dabei freigesetzte freie Energie wird für die Vermischung der Membranen verwendet. Paramyxoviren fusionieren im Gegensatz zu den Orthomyxoviren mit ihren Wirtszellen bei neutralem pH-Wert, wobei diese Fusion durch das Fusionsprotein (F) vermittelt wird. Ähnlich wie bei HA findet dabei eine Strukturänderung des F-Proteins statt, der Trigger für diese Konformationsumwandlung ist jedoch bisher unbekannt. Untersuchungen zeigen, daß das zweite membranständige Glykoprotein der Paramyxoviren Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) bei der Auslösung der Strukturumwandlung des F-Proteins beteiligt ist. Das Fusionsprotein ist jedoch unter bestimmten Bedingungen, wie Anwesenheit von Bindungsagenzien oder spezieller Rezeptoren, in der Lage, auch in Abwesenheit des HN eine Membranverschmelzung zu induzieren. Der Mechanismus der F-vermittelten Fusion ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Zum Verständnis der F-HN-Wechselwirkung und des Fusionsprozesses wird die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des F-Proteins dringend benötigt. Bisher konnte die 3D-Struktur der Ektodomäne eines proteolytisch gespaltenen F-Proteins eines Paramyxovirus, des Newcastle-Disease-Virus, röntgenkristallographisch aufgeklärt werden. Es ist gibt aber keine eindeutigen Hinweise, welchem Zustand des F-Proteins diese Struktur entspricht.

Die vorliegende Arbeit soll erstmals die 3D-Struktur des Fusionsproteins eines Paramyxovirus im fusionskompetenten Zustand mittels Einzelpartikelanalyse und Kryoelektronenmikroskopie aufklären. Zu diesem Zweck sollen Fusionsproteine des Sendaivirus (SeV) und des Simianvirus 5 (SV5) schonend isoliert (d.h. ohne Verlust der Fusionsaktivität des F-Proteins) und rekonstituiert werden. Das Sendaivirus ist ein typischer Vertreter der Paramyxoviren. Jedoch gibt es widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der [Seite 27↓] Oligomerisationsstruktur des Sendaivirus-F. Frühere Untersuchungen ergaben, daß es ein Tetramer ist. Dies widerspricht jedoch Untersuchungen an anderen Paramyxoviren, wie Simianvirus 5 und Newcastle-Disease-Virus, wo eine trimere Form des F-Proteins gefunden wurde. Um diese Widersprüche zu klären, soll auch die Oligomerisation des SeV-F nach der Isolierung mittels chemischem Crosslinking untersucht werden. Das Simianvirus 5 unterscheidet sich von den anderen Paramyxoviren darin, daß das F-Protein, wenn es in Zellen exprimiert wird, auch in Abwesenheit des homotypischen HN-Proteins eine Zell-Zell-Fusion induzieren kann. Daher könnte der Vergleich der 3D-Strukturen der beiden F-Proteine noch mehr Hinweise zur Wechselwirkung zwischen F- und HN-Proteinen geben.

Im Gegensatz zur Röntgenkristallographie kann man unter Verwendung der Einzelpartikelanalyse kryoelektronenmikroskopischer Aufnahmen die 3D-Struktur eines Fusionsproteins auch im fusionsaktiven Zustand aufklären. Im Rahmen der Arbeit sollen Möglichkeiten zur Induktion der Konformationsumwandlung des F-Proteins und zum "Einfangen" von Fusionsintermediaten erforscht werden. Die Ergebnisse sollen als Grundlage für zukünftige Studien zur Strukturaufklärung des F-Proteins in unterschiedlichen Zuständen der Konformationsänderung während der Fusion dienen.

Desweiteren soll die Rolle der transmembranalen und der intraviralen Domäne des F-Proteins für die Membranfusion und die Wechselwirkung mit dem HN-Protein untersucht werden. Dazu werden Chimären des Sendaivirus-F, dessen transmembranale und/oder zytoplasmatische Domänen durch entsprechende Domänen des Influenzavirus-HA bzw. des nicht fusiogenen Membranproteins CD4 substituiert sind, in geeignete Zellen zusammen mit dem homotypischen HN-Protein exprimiert. Die F-proteinvermittelte Zell-Zell-Fusion soll fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden, wobei durch Anwendung unterschiedlicher Fluorophoren einzelne Fusionsschritte aufgelöst werden soll.


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08.12.2003