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4  Ergebnisse

4.1 Isolierung des Sendaivirus-F-Proteins
und Aufklärung seiner 3D-Struktur

4.1.1 Isolierung und Charakterisierung des SeV-F-Proteins

Die Isolierung des SeV-F erfolgte nach der Methode von Tomasi und Loyter (1981) mit Veränderungen nach Bagai et al. (1993) . Das F-Protein wurde aus der Detergenz-Extraktion von Sendaiviren aufgereinigt. Die Detergenz-Extraktion von nativen Sendaiviren enthält gewöhnlich die beiden membranständigen Glykoproteine HN und F, aber nach der Behandlung der Viren mit DTT und einer anschließenden mehrstündigen Dialyse ist HN nicht mehr in Detergenzien solubilisierbar. Somit kann man nach einer Solubilisierung der Virushülle mit Detergenz das Nukleokapsid, das M- und das HN-Protein abzentrifugieren und das F-Protein in der Detergenzphase erhalten. In der Abbildung 4.1.1 ist das SDS-PAGE-Bild von Sendaivirus (Bahn SeV) und der in Detergenz solubilisierten Virushüllproteine (Bahn Env) nach einer Coomassieblau-Färbung gezeigt. Nach der Behandlung der Viren mit DTT enthält die Detergenzphase nur das F-Protein (Abb. 4.1.1 A und B, Bahn F). Unter nicht reduzierenden Bedingungen existieren zwei F-Protein-Banden (Abb. 4.1.1 A). Die intensive Bande bei ca. 60 kDa entspricht dem F-Protein, das aus den durch eine Disulfidbrücke verbundene Untereinheiten F1 und F2 besteht. Es ist die fusionskompetente Form des SeV-F, die durch das Spalten des Vorläuferproteins F0 entsteht. Die schwächere Bande bei ca. 48 kDa entspricht der Untereinheit F1. Unter reduzierenden Bedingungen wird die Disulfidbrücke zwischen F1 und F2 gespalten, und auf dem Gel erscheint nur die F1-Bande (Abb. 4.1.1 B). Die F2-Bande, die ca. 10 kDa groß ist, ist durch eine Coomassieblau-Färbung nicht detektierbar, wie schon bereits in früheren Arbeiten berichtet wurde (Hsu et al. 1979; [Seite 50↓] Nakanishi et al. 1982; Bagai et al. 1993). Die Elektrophorese-Bilder zeigen auch, daß in den Proteinpräparationen kein ungespaltenes Vorläuferprotein F0 (ca. 62 kDa) vorhanden war.

Abb. 4.1.1SDS-PAGE-Bilder des Sendaivirus (SeV) und der Triton-Extraktion der Virushülle ohne (Env) bzw. mit Vorbehandlung der Viren mit DTT (F) unter nicht reduzierenden (A) und reduzierenden (B) Bedingungen (siehe "Material und Methoden" und Text). Die 1. Bahn der Gele sind Markerproteine (MM) mit bekanntem Molekulargewicht (MW). Die Proteinbanden wurden anhand des Molekulargewichts identifiziert und mit den jeweiligen Proteinnamen gekennzeichnet. Das 10%ige Acrylamid-Gel wurde mittels Coomassieblau gefärbt.

Zusätzlich wurde die Oligomerisierung des isolierten SeV-F untersucht. Dazu wurden die rekonstituierten F-Virosomen (mehr dazu siehe Abschnitt 4.1.3) mit dem bifunktionalen Crosslinker Dithiobis-(succinimidylpropionate) (DSP) unterschiedlich lange bei 4°C inkubiert und mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen (1 % SDS) analysiert. Die visualisierten Banden wurden anhand der Markerproteinbanden berechnet. Wie in der Abbildung 4.2.2 A dargestellt, wurden Banden bei ca. 48, 60, 120 und 160 kDa detektiert. Eine Berechnung des Molekulargewichts des (F1+F2)-Monomers, -Dimers und –Trimers, basierend auf der F-Proteinsequenz, ergab 58.9 kDa, 117.8 kDa bzw. 177.7 kDa, und 49 kDa für das F1-Monomer. Daher entsprechen die Banden im Gel dem (F1+F2)- Monomer, -Dimer bzw. -Trimer sowie dem F1-Monomer. Nach 5 min Inkubation mit DSP verschwindet die F1-Bande (Bahn 5‘) und die (F1+F2)-Monomer-Bande wird schwächer bzw. verschwindet vollständig nach einer DSP-Inkubation für 30 min (Bahn 30‘). Mit der Abschwächung der Monomer-Bande wird die Trimer-Bande intensiver. Die Dimer-Bande hat in allen Bahnen [Seite 51↓] eine schwächere Intensität im Vergleich zu den anderen F1+F2-Banden. Entscheidend für unsere Ergebnisse war, daß keine Tetramer-Komplexe beobachtet wurden. Die größeren Oligomere, die durch den Crosslinker entstanden sind, liegen in höheren Bereichen. Manche dieser Oligomere konnten nicht in das Gel eindringen. Die höheren F-Banden waren unter nicht reduzierenden Bedingungen auch ohne Zugabe von DSP detektierbar. Anscheinend reicht eine SDS-Konzentration von 1 % nicht aus, um die nichtkovalente Oligomerisation von F1+F2-Proteinen zu unterbrechen. Um dies zu überprüfen, wurde die Proteinsuspension mit unterschiedlichen SDS-Mengen versetzt (Abb. 4.1.2 B). Bei höheren SDS-Konzentrationen waren alle Banden oberhalb der 67 kDa-Marke nur schwach bzw. nicht mehr detektierbar, und die (F1+F2)-Monomer-Bande wurde intensiver.

Diese Untersuchungen zeigen, daß das SeV-F aus nativen Viren aufgereinigt werden konnte und in der Virushülle als Trimer organisiert ist.

Abb. 4.1.2Analyse des isolierten F-Proteins mittels 7.5 %igen Acrylamidgels unter nicht reduzierenden Bedingungen. (A) Zur Untersuchung der Oligomerisation wurde das SeV-F unterschiedlich lange mit 0.3 mM bifunktionalen Crosslinker DSP bei 4°C inkubiert. Die Monomer-, Dimer- und Trimer-Banden des F sind jeweils mit (*), (**) bzw. (***) gekennzeichnet. Die Endkonzentration von SDS in den Proben betrug 1 %. (B) Die F-Proteinbanden nach Zugabe von unterschiedlichen SDS-Mengen. Die Gele wurden mit Coomassieblau gefärbt. An der linken Seite der Gele sind die Molekulargewichtsmarker dargestellt.


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4.1.2  Überprüfung der Fusionsaktivität des isolierten SeV-F-Proteins

Nach der Isolierung des SeV und einer Rekonstitution in Liposomen wurde die Fusions- und Hämolyseaktivität des SeV-F untersucht, um zu überprüfen, ob die Funktion des Proteins erhalten blieb. Normalerweise ist die Anwesenheit des HN-Proteins zur Induktion der F-proteinvermittelten Fusion notwendig. Es ist jedoch bekannt, daß das SeV-F eine Fusion mit HepG2-Zellen auch in Abwesenheit von HN vermitteln kann (Markwell et al., 1985; Bagai et al., 1993) . Daher wurden zur Untersuchung der Fusionsaktivität des isolierten F-Proteins HepG2-Zellen als Target verwendet. Die Virosomen-Zell-Fusion wurde mittels Fluoreszenzdequenching-(FDQ)-Assays gemessen (siehe "Material und Methoden"). Nach der Bindung von F-Virosomen, die mit Rh-PE in selbstlöschender Konzentration markiert waren, an unmarkierte HepG2-Zellen bei 4°C wurde die Fusion durch eine Inkubation bei 37°C ausgelöst. Wie in der Abbildung 4.1.3 (SeV-F) dargestellt, wurde ein Anstieg der Fluoreszenzintensität beobachtet.

Dies beruht auf der Aufhebung des Selbstquenchings der Markermoleküle aufgrund der Verdünnung der Markerkonzentration, die durch die Verschmelzung der markierten mit der nichtmarkierten Membran verursacht wird. Die Fusionsaktivität des Sendaivirus-F-Proteins wird bei einer Vorinkubation der Viren ohne Targetmembran über 55°C inaktiviert (Wharton et al., 2000; Ohlwein, Baljinnyam und Herrmann, unveröffentlichte Resultate) . Es wurde keine Änderung der Fluoreszenzintensität nach einer Vorinkubation der F-Virosomen ohne Target für 20 min bei 56°C beobachtet, deshalb beruht das beobachtete Fluoreszenzdequenching nicht auf einem unspezifischen Markerübergang (Abb. 4.1.3 SeV-F, Kontrolle). Daher ist die beobachtete Erhöhung der Fluoreszenzintensität ein direktes Maß für die Fusion. Die Fusionsaktivität des isolierten F-Proteins ist vergleichbar mit der von nativen Viren. Der Anstieg der Meßkurve der SeV-Zell-Fusion ist steiler, und das Fusionsausmaß ist etwas höher als der von SeV-F-Virosomen (Abb. 4.1.3, SeV). Dies ist jedoch durch die Anwesenheit von HN erklärbar. Frühere Untersuchungen zeigten, daß die Fusion von Sendaivirosomen mit HepG2-Zellen in Anwesenheit von HN schneller verlaufen als in Abwesenheit von HN (Bagai et al., 1993).


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Abb. 4.1.3Fusion der rekonstituierten SeV-F-Virosomen (SeV-F) oder des Sendaivirus (SeV) mit HepG2-Zellen bei 37°C und pH 7.4. Rh-PE markierte Virosomen oder R18 markierte Viren wurden an HepG2-Zellen bei 4°C für 30 min gebunden. Die Fusion wurde durch Überführung der jeweiligen Suspension in vorgewärmten PBS+ (37°C) induziert. Es wurde keine Fusion beobachtet, wenn Viren (Daten nicht gezeigt) oder Virosomen (SeV-F, Kontrolle) 20 min bei 56°C vorinkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensität der Marker in Anwesenheit von 0.5 % Triton wurde als 100 % Dequenching gesetzt. Für weitere Details und zur Berechnung der FDQ siehe „Material und Methoden“.

Die SeV-F-Virosomen wiesen auch Hämolyseaktivität auf, wenn Weizenkeimagglutinin (WGA; wheat germ agglutinin) als Bindungsagens vorhanden war (Abb. 4.1.4). WGA ersetzt im diesem Fall die Funktion des fehlenden HN. In Abwesenheit von WGA wurde keine Hämolyse induziert (Daten wurden nicht gezeigt). Die Hämolyseaktivität von F-Virosomen war im Vergleich zu nativen Viren niedriger, was wahrscheinlich auf die Abwesenheit von HN zurückzuführen ist. Unsere Daten stimmen mit früheren Untersuchungen überein (Tomasi und Loyter, 1981; Bagai et al. 1993) . Um zu überprüfen, ob WGA Hämolyse induziert, wurden Erythrozyten mit nur WGA oder mit hitzeinaktivierten F-Virosomen inkubiert. In beiden Fällen wurde keine Hämolyse festgestellt (Daten nicht gezeigt).


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Abb. 4.1.4Hämolyseaktivität von Sendaiviren (●) und SeV-F-Virosomen (○). Die Viren bzw. Virosomen wurden an Erythrozyten bei 4°C gebunden und unterschiedlich lange bei 37°C inkubiert (siehe „Material und Methoden“). Die dargestellten Werte sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Messungen. Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung.

4.1.3 Optimierung der SeV-F-Virosomen für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur

Da das Ziel der Isolierung des Fusionsproteins die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse war, mußte überprüft werden, ob die Präparate dazu geeignet waren. Die SeV-F-Virosomen, die ohne Zugabe von Lipiden hergestellt wurden, enthielten noch virale Lipide. Basierend auf der ermittelten Protein- und Phospholipidmenge wurde das molare Verhältnis vom F-Protein zu Phospholipiden berechnet, und es betrug 1:100. Elektronenmikroskopische Aufnahmen dieser Virosomen zeigten fadenförmige Strukturen (Filamente), an denen die F-Proteine perlenkettenartig angeordnet waren. Die Proteinspikes ragten aus dem Lipidbilayer heraus und hatten einen globulären Kopf mit einem dünnen Stiel. Die F-Proteine wiesen starke Wechselwirkungen in der Kopfregion auf, so daß sie an beiden Längsseiten der Filamente eng aneinander aufgereiht waren. An den Enden der Filamente, wo die Membrankrümmung [Seite 55↓] besonders stark ist, befanden sich keine Proteine. Außerdem nahmen die Proteine nur einige wenige Orientierungen im Raum ein.

Zur Strukturaufklärung mit der Einzelpartikelmethode sind jedoch Aufnahmen von einzelnen, sich nicht überlappenden Molekülen, die sich in möglichst vielen unterschiedlichen Raumwinkeln befinden, notwendig. Bei der Bildverarbeitung werden Bilder von einzelnen Molekülen in starker Vergrößerung selektiert und mit einer Kreismaske (dadurch wird der Hintergrund, der keine Bildinformation enthält, entfernt) versehen. Die Informationen innerhalb der Kreismaske bilden den Datensatz eines Moleküls. Falls sich in dieser Maske Fragmente eines benachbarten Moleküls befinden würden, würde dies die Information zum selektierten Molekül verfälschen. Eine zu kleine Maske kann jedoch zum Informationsverlust führen. Außerdem ist eine zufällige Verteilung der Moleküle in unterschiedlichen Raumwinkeln erforderlich, um Informationen über die räumliche Struktur des Proteins zu erhalten und sie mit isotroper Auflösung zu berechnen. (Eine ausführliche Erklärung der Grundlagen der Einzelpartikelmethode und Beschreibung der einzelnen Schritte zur Rekonstruktion der 3D-Struktur eines Proteins am Beispiel von Influenzavirus HA ist in der Promotionsschrift von K. Ludwig, 2000, nachzulesen).

Die Inkorporation der Proteine in die Membran von sehr kleinen Lipidvesikeln würde eine Lösung des Problems bieten. Aufgrund der starken Membrankrümmung könnte der Abstand zwischen der Kopfregion der Proteine mit der Entfernung vom Membran vergrößert werden. Als ideal erwiesen sich bei der Strukturaufklärung von Influenza HA rosettenförmige Assoziate (Rosetten) von 3 bis 10 HA-Trimeren. Da sich die Methoden der Proteinisolierung stark unterscheiden, kann man jedoch nicht auf die Erfahrungen aus der HA-Präparation zurückgreifen. Daher wurde versucht, die Form der SeV-F-Virosomen durch externe Lipide zu beeinflussen. Zunächst wurden unterschiedliche Mengen von Phosphatidylcholin aus dem Eigelb (Ei-PC) oder ein Gemisch von Ei-PC und einem anderen Lipid zur detergenzhaltigen Protein-Suspension zugegeben. Nach der Entfernung des Detergenz und Aufkonzentrierung wurden die SeV-F-Virosomen mittels Elektronenmikroskopie beobachtet. In der Tabelle 4.1 sind die am häufigsten aufgetretenen Formen der Virosomen abhängig vom Lipidzusatz zusammengefaßt.

Tab. 4.1Beeinflussung der Virosomenform durch Zusatz von Lipiden

 

 

 

 

 

 

Lipidzusatz

131 µM

262 µM

65.5 µM

131 µM

131 µM

zur Herstellung

Ei-PC

Ei-PC

Ei-PC/

Ei-PC/

Ei-PC/

von SeV-F-

 

 

238 µM

111.2 µM

55.6 µM

Virosomen

 

 

Cholesterol

Rh-PE

Rh-PE

 

     

Virosomen-

form

Filamente und

Vesikel,

Ø 200 nm

große Vesikel,

Ø 300 nm, und

Filamente

Filamente,

200-500 nm

lang

Filamente,

ca. 200 nm

lang

kurze

Filamente,

z.T. Rosetten

und einzelne

Proteine

Der Abstand zwischen den F-Proteinen wurde durch Zugabe von 131 µM Ei-PC etwas vergrößert, aber die entstandenen Vesikel waren zu groß. Eine Erhöhung der Ei-PC-Menge oder Zusatz von Cholesterol brachte keine befriedigende Änderung. Nur bei Zugabe von 131 µM Ei-PC und 55.6 µM Rh-PE wurden kurze Filamente, z.T. auch Rosetten gebildet. In der Abbildung 4.1.5 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von F-Virosomen mit obengenannter Lipidzugabe dargestellt. Die Proteine hatten in der Kopfregion nicht nur genügend Abstand, sondern waren auch in unterschiedlichen Raumwinkeln vorhanden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden F-Virosomen mit Zugabe von 131 µM Ei-PC und 55.6 µM Rh-PE zur Aufklärung der 3D-Struktur des SeV-F-Proteins verwendet.

Abb. 4.1.5Elektronenmikroskopische Aufnahme des isolierten SeV-F nach der Rekonstitution mit 131 µM Ei-PC/55.6 µM Rh-PE. Der Balken entspricht 50 nm.


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4.1.4  Aufklärung der 3D-Struktur des SeV-F-Proteins

Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen und die 3D-Strukturaufklärung wurden von Christoph Böttcher und Kai Ludwig (beide Freie Universität Berlin) durchgeführt.

Für die Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie wurden die Proben mit einem Schwermetall kontrastiert und dann in amorphes Eis eingebettet. Die Negative der elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden digitalisiert und die Bilder rechnergestützt verarbeitet. Basierend auf Daten von 3500 einzelnen Molekülbildern wurde die 3D-Struktur des SeV-F mit einer Auflösung von ca. 16 Å rekonstruiert. Die ersten Schritte der

Abb. 4.1.63D-Struktur des Sendaivirus-F. (A) Ansicht von oben. (B) Ansicht von der Seite. Die zur Virushülle proximale Seite ist das untere Ende des Stiels. (C) Ansicht von oben auf einen horizontalen Schnitt (die Schnittebene ist durch die rote horizontale Linie im Bild B gekennzeichnet.) (D) Ansicht auf das axial angeschnittene Protein aus dem Bild B (die Schnittebene ist durch die roten vertikalen Linien markiert (45°)). Die verschiedenen Strukturdetails sind angegeben, weitere Details sind im Text erläutert. Mit freundlicher Genehmigung von K. Ludwig.


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Strukturaufklärung wurden ohne Vorgabe von einer Symmetrie durchgeführt. Nach einigen iterativen Prozessen der Strukturaufklärung wurde deutlich, daß die Proteinstruktur eine dreifache Symmetrie aufweist, was auch mit den Ergebnissen der Crosslinking Experimente übereinstimmt (siehe Abschnitt 4.1.1).

Die 3D-Struktur der SeV-F-Ektodomäne ist in der Abbildung 4.1.6. dargestellt. Die Gesamtlänge der F-Ektodomäne beträgt 173 Å. Der distale Kopf der Ektodomäne hat eine Länge und eine Breite von jeweils ~ 65 Å. Dem Kopf folgt eine Halsregion, die sich zur Membran hin verjüngt und, bevor er zum Stiel übergeht, eine kugelförmige Verdickung bildet. Die Ansicht von oben zeigt flügelähnliche Ausbuchtungen im unteren Bereich des Kopfs. Außerdem weist der Kopf einen axialen Kanal, der durch eine massive Dreiarm-Brücke von radialen Kanälen getrennt wird, auf. Die radialen Kanäle verlaufen in der Mitte des Halses in eine zentrale Höhlung. Der Stiel hat eine Länge von 70 Å und einen Durchmesser von ~ 27 Å.

Es ist die erste 3D-Struktur des Sendaivirus-F-Proteins in der gespaltenen und fusionskompetenten F1+F2-Form.

4.2 Isolierung und Identifizierung des Fusionsproteins des Simianvirus 5

Das F-Protein des Simianvirus 5 (SV5) wurde aus nativen Viren, die auf MDBK-Zellen gezüchtet wurden, isoliert. Die Viren waren ohne jegliche Behandlung in der Lage, mit Ghosts zu fusionieren (siehe Abschnitt 4.3). Dies bedeutet, daß das SV5-F-Protein von den zellulären Proteasen in die fusionskompetetive Form F1+F2 gespalten worden war. Um zu überprüfen, ob sich alle F-Proteine im gleichen Zustand F1+F2 befanden, wurden die Viren mit Trypsin behandelt. Es ist bekannt, daß Trypsin den ungespaltenen Vorläufer des SV5-F in F1+F2 spaltet (Paterson et al., 1989) . Die Fusionsaktivität der behandelten Viren wurde mittels R18-Assay untersucht. Nach der Trypsinbehandlung wurde keine Erhöhung der Fusionsaktivität festgestellt (Daten nicht gezeigt). Auch eine Analyse der Viren vor und nach der Trypsinbehandlung mittels SDS-PAGE zeigte keine Unterschiede im Proteinbandenbild (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das gesamte SV5-F bereits [Seite 59↓] tatsächlich durch die zelleigenen Proteasen gespalten wurde.

Zur Isolierung des SV5-F-Proteins war zunächst die Solubilisierung der Virushülle notwendig, um das Nukleokapsid und das M-Protein von den Spikeproteinen F und HN abzutrennen. Dazu wurden unterschiedliche Detergenzien in unterschiedlichen Konzentrationen getestet (Tab. 4.2.). Die verwendeten Detergenzien Triton X-100, CHAPSO und Genapol C-100 eignen sich alle für die Isolierung integraler Membranproteine unter Beibehaltung ihrer nativen Struktur und biologischen Eigenschaften. Nach Zugabe der Tenside zu SV5 und einer Inkubation von 30 min bei RT wurden die Proben zentrifugiert, um das Nukleokapsid zu trennen. Die Proteine, die sich im Überstand bzw. im Pellet befanden wurden mittels SDS-PAGE visualisiert (Daten nicht gezeigt). Es konnte festgestellt werden, daß in allen Proben keine vollständige Trennung der Spikeproteine vom Nukleokapsid und dem Matrixprotein (M-Protein) gelungen war. Nach einer Dialyse der Detergenz-Extrakte und einer weiteren Zentrifugation, wurden nur in den Proben mit Zugabe von Triton X-100 das M-Protein und die Reste des Nukleopkapsides ausgefällt (Abb. 4.2.1, Bahn P1 und P2). Für die Solubilisierung der Virushülle und die Isolierung der Spikeproteine des SV5 wurde daher Triton X-100 mit einer Endkonzentration von 2 % verwendet.

Tab. 4.2:Solubilisierung der Virushülle und Isolierung der Spikeproteine des SV5 mittels unterschiedlichen Detergenzien in unterschiedlicher Konzentration. Die erste Zentrifugation wurde nach Zugabe der Detergenzien zu den Viren und nach einer 30minütigen Inkubation bei RT durchgeführt. Die zweite Zentrifugation wurde durchgeführt, nachdem der Überstand aus der ersten Zentrifugation gegen ein Puffer mit niedriger Salzkonzentration dialysiert wurde. (- - nicht erfolgreich; + - erfolgreich)

Detergenz

Triton X-100

CHAPSO

Genapol C-100

Endkonzentration (v/v)

2 %

5 %

0.5 %

1 %

1 %

2 %

Isolierung der Spikeproteine

nach der 1. Zentrifugation

-

-

-

-

-

-

Isolierung der Spikeproteine

nach der 2. Zentrifugation

+

+

-

-

-

-


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Abb. 4.2.1SDS-PAGE des SV5 und der einzelnen Produkte während der Isolierung des F-Proteins unter reduzierenden Bedingungen: (P1) Pellet nach der ersten Zentrifugation, (P2) Pellet nach der zweiten Zentrifugation, (HN) isoliertes SV5-HN-Protein nach der Elution der Affinitätssäule, (F) isoliertes und aufkonzentriertes SV5-F-Protein. Das 10%ige Acrylamidgel wurde mit Coomassieblau gefärbt. Die Bahnen HN und F wurden zusätzlich einer Silberfärbung unterzogen. Links vom Gel sind die Molekulargewichtsmarker (MM) dargestellt.

Das F-Protein (Abb. 4.2.1, Bahn F) wurde vom HN-Protein (Abb. 4.2.1, Bahn HN) mittels Affinitätssäulenchromatographie getrennt (siehe "Material und Methoden"). Es wurde eine Fetuin-Agarose-Säule verwendet, wobei das HN an die N-Acetylneuraminidasesäure (NANA) des Fetuins bindet. Weil die Neuraminidaseaktivität des HN bei einem pH-Wert von 4.5 am höchsten ist (Scheid et al., 1972) , wurde durch die Dialyse auch der pH-Wert des Detergenz-Extrakts auf 4.5 erniedrigt und alle Arbeitsschritte der Säulenchromatographie bei diesem pH-Wert durchgeführt. In der Abbildung 4.2.1, Bahn F ist zu sehen, daß das SV5-F-Protein erfolgreich isoliert wurde. Unter reduzierenden Bedingungen erscheint im Gel die (F1+F2)-Bande. Unter gleichen Bedingungen wurde die Bindung zwischen den Untereinheiten des SeV-F unterbrochen, und im Gel waren zwei Proteinbanden, die der F1- und der F2-Untereinheit entsprachen, zu identifizieren. Anscheinend reichte die verwendete Menge an ß-Mercaptoethanol (5 % Endkonzentration) nicht aus, um die Disulfidbrücke zwischen F1 und F2 des SV5-F zu spalten.

Da die letzten Schritte der Proteinisolierung bei saurem pH stattfinden (siehe oben), mußte überprüft werden, ob die Behandlung des SV5-F mit einem niedrigen pH über einen [Seite 61↓] längeren Zeitraum einen Einfluß auf die Fusionsaktivität hat. Zu diesem Zweck wurden die Simianviren 5 mit R18 markiert und bis zu 6 h in einem NaAc-Puffer bei pH 4.5 und 4°C (die Dialyse und die Säulenchromatographie finden bei dieser Temperatur statt, siehe auch "Material und Methoden") vorinkubiert. Die Fusion von SV5 mit Ghosts wurde mittels R18-Assay bei 37°C, pH 7.4 gemessen. Es konnte kein Verlust der Fusionsaktivität des SV5-F nach der Vorinkubation des SV5 beim niedrigen pH-Wert festgestellt werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 4.2.2Hämolyseaktivität des SV5 (●) oder des isolierten SV5-F (○). Nach dem Binden der Viren bzw. F-Virosomen (durch Zugabe von WGA) an Erythrozyten wurden die Proben bei 37°C inkubiert. Nach unterschiedlicher Zeit wurden Alliquots entnommen und die Hämolyse gemessen. Zur Berechnung des prozentualen Anteils der Hämolyse siehe „Material und Methoden“.

Die Fusionsaktivität des isolierten SV5-F wurde mittels Hämolysetests untersucht. Dazu wurde die F-Proteinsuspension zu RBC gegeben und in Anwesenheit von WGA bei 37°C inkubiert. Das isolierte SV5-F induziert eine Hämolyse von ca. 15 % nach einer 1stündigen Inkubation bei 37°C (Abb. 4.2.2). Die Hämolyseaktivität des SV5-F ist geringer als die des SV5. Das könnte wahrscheinlich durch die Abwesenheit des SV5-HN erklärt werden. Zu beachten ist, daß das SV5 im Gegensatz zu SeV selbst nach 1 h keine 100 %ige Hämolyse induzieren kann. Dies ist jedoch in Übereinstimmung mit den geringen Fusionsaktivitäten des [Seite 62↓] SV5 bei den physiologischen Fusionsbedingungen pH 7.4 und 37°C (siehe auch Abschnitt 4.3). Wenn RBC entweder nur mit WGA oder nur mit SV5-F inkubiert wurden, konnte keine Hämolyse festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Aus diesen Ergebnissen kann man schlußfolgern, daß die Hämolyse durch SV5-F, die mittels WGA an die RBC gebunden waren, ausgelöst wurde. Damit konnte erstmals gezeigt werden, daß das isolierte SV5-F in Abwesenheit von HN Hämolyse induzieren kann.

Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der isolierten F-Proteine zeigten kurze filamentöse und rosettenförmige Assoziate des SV5-F (Abb. 4.2.3). Die Proteine hatten genügend Abstand voneinander und waren in unterschiedlichen Raumwinkeln vorhanden. Daher eignen sich die Proben mit den SV5-F-Proteinen, die nach der vorgestellten Methode isoliert wurde, für die Aufklärung der 3D-Struktur des SV5-F mittels Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse (siehe Abschnitt 4.1.3).

Die ersten elektronenmikroskopischen Aufnahmen deuten darauf hin, daß SV5-F eine ähnliche Form wie SeV-F hat. Es besteht aus einem globulären Kopf und einem dünnen Stiel. Die Arbeiten zur Aufklärung der 3D-Struktur des SV5-F werden demnächst begonnen.

Abb. 4.2.3Elektronenmikroskopische Aufnahme des isolierten SV5-F. Der Balken entspricht 25 nm.


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4.3  Charakterisierung der Fusionsaktivität von Sendaivirus und Simianvirus 5

Um die 3D-Struktur des SeV-F bzw. des SV5-F im fusionsaktiven Zustand aufzuklären, muß man zunächst eine Konformationsumwandlung des F-Proteins vom fusionskompetenten zum fusionsaktiven Zustand induzieren. Der Auslöser der Konformationsänderung des Paramyxovirus-Fusionsproteins ist jedoch noch nicht bekannt. Daher wurde das Fusionsverhalten von Sendaivirus und Simianvirus 5 bei unterschiedlichen pH-Werten und Temperaturen untersucht, um physikochemische Bedingungen herauszufinden, bei denen eine Strukturänderung des isolierten F-Proteins induziert werden kann.

Die Fusionsaktivität der Viren wurde mittels R18-Fluoreszenzdequenching-(FDQ)-Assays gemessen (siehe „Material und Methoden“). Die Viren wurden mit dem Fluorophor R18 in selbstlöschender Konzentration markiert und als Target Erythrozytenghosts verwendet. Bei 4°C wurden die Viren an Ghosts gebunden, und die Fusion wurde durch den Transfer der Virus-Ghost-Suspension in PBS bei 37°C ausgelöst. In der Abbildung 4.3.1 sind typische Fusionskinetiken von SeV bzw. SV5 bei unterschiedlichen pH-Werten und 37°C dargestellt. Bei pH 7.4 beträgt das Ausmaß der SeV-Ghost-Fusion ca. 50 %. Obwohl das Fusionsausmaß des SeV bei pH 5.5 um ca. 10 % höher ist als bei pH 7.4, ist die Anfangsgeschwindigkeit der Fusion geringer. Es weist auch eine „lag“-Zeit (Zeitdauer zwischen dem Start der Fusionsmessung und der ersten meßbaren Erhöhung des FDQ) auf.

Im Gegensatz dazu ist bei SV5 nicht nur das Ausmaß sondern auch die Anfangsgeschwindigkeit der Fusion bei pH 5.5 viel höher als bei pH 7.4. Das Fusionsausmaß des SV5 steigt von 25 % bei pH 7.4 auf ca. 45 % bei pH 5.0. Bei basischem pH ist das Ausmaß und die Anfangsgeschwindigkeit der Fusion der beiden untersuchten Viren geringer als bei pH 7.4. Die Anfangsgeschwindigkeiten korrelieren mit den Ausmassen der Fusion.

Die pH-Abhängigkeit des Fusionsausmasses von SeV bzw. SV5 mit Ghosts wurde in der Abbildung 4.3.2 dargestellt. Da die Fusion von Paramyxoviren mit Targetzellen unter physiologischen Bedingungen bei neutralem pH-Wert stattfindet, wurde das Fusionsausmaß bei pH 7.4 als Kontrollwert auf 100 % angesetzt, und die anderen Meßwerte entsprechend normiert. Bei SeV beeinflußt die Änderung des pH-Wertes die Fusionsaktivität nur gering. Die Fusionsaktivität des SV5 erhöht sich deutlich bei sauren pH-Werten. Bei pH 5.0 ist das [Seite 64↓] Fusionsausmaß fast zweifach höher als der Kontrollwert. Die Verschiebung des pH-Wertes zum basischen hat nur einen geringen Einfluß auf die Fusionsaktivität des SV5.


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Abb. 4.3.2 pH-Abhängigkeit des Fusionsausmasses von Sendaivirus (schwarze Balken) oder Simianvirus 5 (graue Balken) mit Ghosts. Die Messungen erfolgten über einen Zeitraum von 1h bei 37°C. Das Fusionsausmaß bei pH 7.4 wurde als Kontrollwert auf 100 % angesetzt. Die dargestellten Werte entsprechen dem jeweiligen Mittelwert, und die Fehlerbalken der Standardabweichung (n≥3).

Als nächstes wurde die Temperaturabhängigkeit der Fusionsaktivität des SeV bzw. SV5 mit Erythrozytenghosts untersucht (Abb. 4.3.3). Alle Messungen wurden bei pH 7.4 durchgeführt. Bei beiden Viren steigt die Fusionsaktivität mit der Erhöhung der Temperatur an. Das SeV hat bei den Temperaturen 20°C oder 25°C eine Fusionsaktivität von ca. 12 % bzw. ca. 20 %. Bei 37°C beträgt das Fusionsausmaß ca. 40 %. Wenn die Temperatur auf 60°C erhöht wird, steigt das Fusionsausmaß um 20 %. Auch die Fusionskinetiken bei den gemessenen Temperaturen unterscheiden sich deutlich voneinander. Die Anfangsgeschwindigkeiten der Fusion bei 20°C und 25°C sind sehr niedrig. Die Kurven weisen eine „lag“-Zeit auf. Mit der Erhöhung der Temperatur verringert sich die „lag“-Zeit, und die Anfangsgeschwindigkeit sowie das Ausmaß der Fusion nehmen zu. Ein ähnliches Fusionsverhalten ist auch bei SV5 zu beobachten.


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Abb. 4.3.3Fusionskinetiken von Sendaivirus (SeV) und Simianvirus 5 (SV5) mit Erythrozytenghosts bei unterschiedlichen Temperaturen und pH 7.4. Zum Zeitpunkt t=0 wurde die Virus-Ghost-Suspension in 2 ml PBS mit entsprechender Temperatur zugegeben. Am Ende jeder Messung wurde 0.5 % Triton zugegeben, um ein maximales FDQ zu erreichen. Bei der Normierung der Kurven wurde dieser Wert als 100 % angesetzt. Weitere Details siehe „Material und Methoden“ und Text.


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Abb. 4.3.4Temperaturabhängigkeit der Fusion von Sendaivirus (schwarze Balken) oder Simianvirus 5 (graue Balken) mit Erythrozytenghosts. Alle Messungen wurden bei pH 7.4 durchgeführt. Das Fusionsausmaß bei 37°C wurde als Kontrollwert auf 100 % angesetzt. Gezeigt ist der Mittelwert, und die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung (n≥3) gezeigt. Weitere Einzelheiten der Messungen siehe Text und Legende zur Abb. 4.1.1.

Die Temperaturabhängigkeit des Fusionsausmasses von SeV und SV5 mit Ghosts wurde in der Abbildung 4.3.4 dargestellt. Die ermittelten Fusionswerte wurden auf die entsprechenden Fusionswerte bei 37°C (100 %) normiert. Wie oben beschrieben, erhöht sich das Fusionsausmaß mit der Temperatur. Bei 50°C erreicht die Fusion von SeV mit Ghosts das Maximum. Bei SV5 ist ein drastischer Anstieg der Fusion bei 55°C zu beobachten. Bei 55°C steigt das Fusionsausmaß um das zweieinhalbfache gegenüber der Kontrolle. Mit einer weiteren Erhöhung der Temperatur nimmt die Fusion bei beiden Viren ab. Dies ist mit der Inaktivierung der viralen Fusionsproteine verbunden. Es ist bekannt, daß eine Inkubation von Sendaiviren ohne Target selbst bei 37°C zur Inaktivierung der Virusfusion führt (Wharton et al., 2000) . Dieser Prozeß verläuft bei 37°C jedoch sehr langsam. Eine 50 %ige Verminderung der Fusionsaktivität wird nach einer Inkubation von 4 h bei 37°C beobachtet (Wharton et al., 2000) . Bei höheren Temperaturen werden SeV viel schneller inaktiviert. Nach einer 2-minütigen Vorinkubation von SeV ohne Target bei 56°C ist die Fusion von SeV mit Ghosts [Seite 68↓] um ca. 50 % reduziert (Ohlwein, Baljinnyam und Herrmann, unveröffentlichte Resultate) . Dies legt die Vermutung nahe, daß die Fusionsaktivität der SeV ab 55°C abnimmt, weil möglicherweise die gleichzeitig stattfindende Inaktivierung der Viren schneller abläuft als bei niedrigeren Temperaturen. Das SV5 ist im Vergleich zum SeV stabiler. Die Fusion von SV5 wird bei der gleichen Temperatur langsamer inaktiviert. Nach einer 10 minütigen Vorinkubation von SV5 ohne Target bei 55°C verringert sich die Fusionsaktivität der Viren um 30 %, aber bei 60°C schon um ca. 65 % (Ohlwein, Baljinnyam und Herrmann, unveröffentlichte Resultate) . Daher nimmt die Fusionsaktivität von SV5 erst ab 60°C ab, und nicht bei 55°C wie von SeV.

4.4 Einfluß von Lysolipiden auf die Fusion von Sendaiviren

Ein Fusionsprotein durchläuft mehrere Intermediate der Strukturänderung um eine Membranverschmelzung zu induzieren (siehe "Einführung"). Die Kenntnis der 3D-Struktur des Fusionsproteins in den einzelnen Intermediaten ist zum Verständnis des Fusionsmechanismus wichtig. Dazu müßten diese Intermediate "eingefangen" werden, um die Proteinstruktur aufzuklären. In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß Lysolipide die Fusion von unterschiedlichen Fusionssystemen auf einem bestimmten Zwischenschritt inhibieren (Yeagle et al., 1994; Chernomordik et al., 1993; Vogel et al., 1993) . Daher soll geklärt werden, ob Lysolipide die Fusion von Sendaiviren hemmen.

Es wurde Lysophosphatidylcholin, Myristoyl, (LPC, 14:0) verwendet, und die Virus-Ghost-Fusion in An- bzw. Abwesenheit von LPC mittels FDQ-Assay unter Anwendung des lipidähnlichen Fluorophors R18 gemessen. Zunächst wurden die Lysolipide zur Ghost-Suspension bei 37°C und pH 7.4 zugegeben. Nach 4 min Inkubation wurden die markierten Viren hinzugefügt. In Anwesenheit von 17 µM LPC nahm die Virus-Ghost-Fusion von 28 % auf 6 % ab (Abb. 4.4.1). Die 17 µM Endkonzentration der Lysolipide entspricht 10 mol% der endogenen Lipide der Ghosts und Viren1 .


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Abb. 4.4.1:Fusion von Sendaiviren mit Erythrozyten-Ghosts in Anwesenheit von 17 µM LPC (14:0) bei 37°C und pH 7.4. Die Kontrolle wurde ohne Lysolipidzugabe gemessen. Weitere Details siehe Text und "Material und "Methoden".

Der inhibierende Einfluß von LPC war abhängig von der Menge der zugegebenen Lysolipide (Abb. 4.4.2). Wenn in Anwesenheit von 2 mol% LPC bezogen auf endogene Ghost- und Viruslipide (Endkonzentration 3.4 µM) die Virus-Ghost-Fusion um ca. 20 % gehemmt wurde, so in Anwesenheit von 10 mol% LPC wurde die Fusion um 80 % inhibiert. Damit könnte man Lysolipide zum "Einfangen" von Intermediaten der Sendaivirusfusion einsetzen. Es ist jedoch nicht eindeutig bewiesen, wie die Lysolipide die proteinvermittelte Fusion hemmen (siehe "Einführung"). Daher muß geklärt werden, ob der inhibierende Einfluß von Lysolipiden auf eine Wechselwirkung mit dem Fusionsprotein oder mit der Membran basiert.


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Abb. 4.4.2:Inhibierung der Sendaivirus-Ghost-Fusion durch Zugabe von LPC (14:0). Die Menge der zugegebenen Lysolipide bezieht sich auf endogene Lipide der Ghots und Viren. Die Virus-Ghost-Fusion wurde mittels R18-FDQ-Assay bei 37°C und pH 7.4 gemessen. Das Fusionsausmaß in Abwesenheit von LPC wurde als Kontrollwert auf 100 % angesetzt. Weitere Einzelheiten siehe Text und "Material und Methoden".

4.5 Wechselwirkung von Lysolipiden mit Influenzavirus

Die "Spinsonden-Technik" der Elektronenspinresonanz (ESR)-Spektroskopie bietet eine gute Möglichkeit zur Untersuchung der Lipid-Protein-Wechselwirkung. An Hand der ESR-Spektren von spinmarkierten Lysolipiden (z.B. mit einer Nitroxidgruppe) könnte man klären, ob sich Lysolipide an das Fusionsprotein bindet oder in die Membran einbaut. Daher wurde in den folgenden Untersuchungen spinmarkiertes LPC (SL-LPC, spinlabeled LPC) verwendet. Die Versuche wurden an Influenzaviren durchgeführt, weil im Gegensatz zu den Paramyxoviren das Auslösen der HA-vermittelten Fusion aufgrund der pH-Abhängigkeit der Strukturumwandlung des HA sehr gut steuerbar ist. Die Änderung der HA-Konformation läßt [Seite 71↓] sich auch in Abwesenheit einer Targetmembran durch Erniedrigung des pH-Wertes des Außenmilieus induzieren. Dies ermöglicht eine direkte Untersuchung der Wechselwirkung von Lysolipiden mit dem HA vor und nach der Konformationsumwandlung.

4.5.1 Inhibierung der Influenzavirus-Fusion durch SL-LPC

Zunächst wurde untersucht, ob das SL-LPC die HA-vermittelte Virus-Zell-Fusion in gleichem Maße inhibieren kann wie nicht spinmarkiertes LPC. Die Influenzavirusfusion wurde ebenso mittels R18-FDQ-Assay untersucht. Der Fluoreszenzmarker wurde in die Virushülle eingebaut und humane Erythrozytenghost dienten als Target. Die markierten Viren wurden bei neutralem pH-Wert an die Ghosts gebunden, und die Membranfusion wurde bei 37°C durch das Erniedrigen des pH-Wertes auf 5.0 ausgelöst. In Abwesenheit von SL-LPC war das Fusionsausmaß ca. 50 % (Abb. 4.5.1 A, Kontrolle).

Vor der Untersuchung des Einflusses von SL-LPC auf die Fusion wurde ermittelt, ob die Nitroxidgruppe des SL-LPC die Fluoreszenzintensität von R18 beeinflußt (paramagnetische Fluoreszenzlöschung). Dazu wurde das Analogon (13 µM Endkonzentration) zur Kontrollmessung zugegeben, nach dem das Fusionsausmaß ein Plateau erreicht hatte. Wie in der Abbildung 4.5.1 A gezeigt ist, konnte nur eine geringe Löschung der R18-Fluoreszenz durch die Nitroxidgruppe beobachtet werden (rechter Pfeil in Abb. 4.5.1 A). Aus der Kinetik dieses Abfalls ist auch ersichtlich, daß sich SL-LPC bei 37°C in weniger als 1 min in die Virushülle einbaut.

Nach einer Inkubation des Virus-Ghost-Komplexes mit SL-LPC (10 mol% bezogen auf endogene Virus- und Ghostlipide, 13 µM Endkonzentration) bei pH 7.4 und 37°C für 4 min wurde das Ausmaß der Membranfusion um ca. 1/3 erniedrigt (Abb. 4.5.1 A und Abb. 4.5.2). Bei der Berechnung des Fluoreszenzdequenchings und Darstellung der Fusionskurve wurde die Löschung der Markerfluoreszenz durch die Nitroxidgruppe berücksichtigt. Um den inhibierenden Einfluß von SL-LPC mit dem von nicht markierten LPC zu vergleichen, wurde die Fusion von Influenzaviren mit Ghosts in Anwesenheit von LPC mit unterschiedlichen Fettsäurenkettenlängen gemessen. In der Abbildung 4.5.1 B ist ein typisches Beispiel des LPC-Einflusses auf die Fusion gezeigt. Bei einer Konzentration von 10 mol% LPC (14:0) bezogen auf endogene Lipide von Ghost und Virus nahm die Membranfusion von ca.
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Abb. 4.5.1Inhibierung der Influenzavirus-Ghost-Fusion durch SL-LPC (A) oder LPC (14:0) (B) bei 37°C. Die Fusion wurde mittels R18-Assay gemessen (mehr dazu siehe Text und „Material und Methoden“). Bei t=-240 sec (Pfeile) wurde SL-LPC (A) oder LPC (B) zu der Virus-Ghost-Suspension in einer Küvette mit NaAc, pH 7.4 und 37°C, zugegeben (Kontrolle – ohne Zusatz von Lysolipiden), was mit einer leichten Erhöhung der R18-Intensität verbunden war. Dieser Effekt beruht auf der Aufhebung des R18-Quenchings durch den Einbau von Lysolipiden in die markierte Membran. Die Endkonzentration der Lysolipide betrug 13 µM und entsprach 10 mol% der endogenen Lipide von Virus und Ghost. Zum Zeitpunkt t=0 wurde die Fusion durch Erniedrigung des pH-Wertes auf 5.0 ausgelöst. Um die paramagnetische Löschung der R18-Fluoreszenz durch SL-LPC aufzuklären, wurde SL-LPC zur Virus-Ghost-Suspension nach dem Erreichen eines Fusionsplateaus zugegeben (rechter Pfeil in A). Der FDQ-Wert wurde -wie in „Material und Methoden“ angegeben- berechnet und im Falle von SL-LPC bezüglich des paramagnetischen Fluoreszenzlöschung korrigiert.


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60 %(Kontrolle) auf 40 % ab. Bei dieser LPC-Konzentration (10 mol%) war der Unterschied des inhibierenden Einflusses in Abhängigkeit von der Fettsäurenkettenlänge der benutzten LPCs nur sehr gering (Abb. 4.5.2). Diese Ergebnisse zeigen, daß SL-LPC ein geeignetes Analogon für LPC im Hinblick der Inhibierung der Influenzavirusfusion ist.

Abb. 4.5.2Einfluß von Lysolipiden mit unterschiedlichen Fettsäurekettenlängen und spinmarkierten LPC (18:0) (SL-LPC) auf die Fusion von Influenzaviren mit Ghosts bei 37°C. Das Fusionsausmaß ohne Zugabe von Lysolipiden wurde auf 100% angesetzt, und die dargestellten Fusionswerte darauf bezogen. Die Lysolipidkonzentration entsprach 10 mol% der endogenen Lipide von Virus und Ghost. Es wurden der Mittelwert und die Standardabweichung (n≥3) angegeben.

4.5.2 Wechselwirkung von SL-LPC mit der HA-Ektodomäne

Zur Untersuchung der Wechselwirkung von SL-LPC mit der HA-Ektodomäne wurde BHA isoliert (siehe „Material und Methoden"). Für diese Studien eignen sich isolierte vollständige HA-Moleküle nicht, weil die Lysolipide mit der hydrophoben Transmembrandomäne des HA interagieren würden und die Messungen zur Wechselwirkung mit der Ektodomäne erschweren würden.

Zuerst wurde geklärt werden, ob die biologischen Eigenschaften des HA durch die Isolierung beeinflußt worden ist. Dazu wurde der bis-ANS-Assay verwendet. Sowohl in [Seite 74↓] unserer als auch in anderen Arbeitsgruppen konnte gezeigt werden, daß die Strukturänderung der HA-Ektodomäne und die damit verbundene Freisetzung des hydrophoben Fusionspeptides kontinuierlich mittels des hydrophobizitätssensitiven Fluorophors bis-ANS verfolgt werden kann (Korte und Herrmann, 1994; Korte et al. 1999; Bethell et al. 1995). Die Abbildung 4.5.3 zeigt die Kinetik der bis-ANS-Fluoreszenzänderung in Anwesenheit von Influenzavirus und BHA bei pH 5.0 und 37°C. BHA oder intaktes Virus wurde zu einer vorgewärmten Puffer mit bis-ANS-Zusatz bei pH 7.4 zugegeben. Nach der Änderung des pH-Wertes auf 5.0 wurde eine schnelle Erhöhung der Fluoreszenzintensität von bis-ANS beobachtet. Diese Änderung beruht auf einer verstärkten Bindung von bis-ANS an hydrophobe Sequenzen der HA-Ektodomäne, die durch die Konformationsänderung freigelegt wurden, und damit einer erhöhten Quantenausbeute des Fluorophors. Wie die Messungen zeigten, war die Konformationsänderung von BHA nach der Erniedrigung des pH-Wertes vergleichbar mit der eines im intakten Virus vorhandenen HA (Abb. 4.5.3).

Abb. 4.5.3Erhöhung der Fluoreszenzintensität von bis-ANS in Anwesenheit von intaktem Virus oder BHA bei pH 5.0 und 37°C. BHA (5 µg/ml) oder Influenzavirus (5 µg HA/ml unter Annahme der Verhältnisse 2.5 x 1012 Viruspartikel/mg Virusprotein sowie 500 Trimere/Virion und eines Molekulargewichts des HA von 75-80 kDa) wurde zu 2 ml NaAc-Puffer mit 1 nmol bis-ANS/ml bei pH 7.4 und 37°C zugegeben. Bei t=0 wurde der pH-Wert durch Zugabe von Zitronensäure erniedrigt. Weitere Details siehe „Material und Methoden“.


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Es ist auch bekannt, daß das HA nur nach einer Konformationsänderung zugänglich für Proteinase K wird (Doms et al., 1985) . Der Proteinase K-Sensitivitätstest zeigte ebenso, daß die BHA-Moleküle durch die Isolierung nicht beschädigt wurden. Nach einer Inkubation bei saurem pH wurde das BHA genauso durch Proteinase K abgebaut, wie das HA im nativen Virus (Daten nicht gezeigt).

Die Wechselwirkung von SL-LPC mit BHA wurde mittels ESR-Spektroskopie bei 37°C untersucht. Um eine ausreichende Signalintensität von BHA-gebundenen SL-LPC zu erreichen, wurde eine höhere SL-LPC-Konzentration als bei den Fusionsversuchen verwendet. Zunächst wurde ein Spektrum von SL-LPC (63 µM Endkonzentration) in wäßriger Lösung in Abwesenheit von BHA aufgenommen. Die Abbildung 4.5.4 A3 zeigt ein ESR-Spektrum aus drei schmalen Linien, die typisch für monomeres, sich frei in der Lösung bewegendes Lipid sind. Es sind keine SL-LPC-Mizellen vorhanden, diese wären durch eine Verbreiterung der Spektrenlinien aufgrund der Spin-Spin-Wechselwirkung von SL-LPC in Mizellen zu identifizieren. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß die SL-LPC Konzentration unter oder sehr nah an der kritischen Mizellarkonzentration liegt.

In Anwesenheit von BHA (molares Verhältnis von BHA-Monomeren zu SL-LPC = 1:1.5) besteht das Spektrum aus zwei überlagerten Komponenten (Abb. 4.5.4 A1, A2). Neben einer mobileren Komponente ist auch eine immobilisierte Komponente zu erkennen. Die immobilisierte Komponente, die durch die Bindung von SL-LPC an BHA hervorgerufen wird, ist bei pH 5.0 stärker ausgeprägt (Abb. 4.5.4 A2) als bei neutralem pH (Abb. 4.5.4 A1). Bei der Aufnahme des Spektrums bei saurem pH erfolgte die Erniedrigung des pH-Wertes nach der Zugabe von SL-LPC zu der BHA-Suspension, um eine mögliche Abschirmung hydrophober Bindungsstellen für SL-LPC durch Proteinaggregation zu verhindern. Um den Anteil des gebundenen SL-LPC zu bestimmen, wurde von den Spektren von SL-LPC in Anwesenheit von BHA das Spektrum von SL-LPC in wäßriger Lösung subtrahiert. Die Differenzspektren sind in der Abbildung 4.5.4 B dargestellt. Leider war es nicht möglich, die mobile Komponente der Spektren vollständig zu subtrahieren. Unter Vernachlässigung dieser kleinen Komponente wurde der Anteil der immobilisierten SL-LPC bestimmt. Während bei neutralem pH 30 % des gesamten SL-LPC an BHA gebunden waren, betrug der Anteil des mit BHA assoziierten SL-LPC bei pH 5.0 64 %. Das Spektrum des gebundenen SL-LPC bei pH 5.0 war stärker immobilisiert (siehe Pfeile in der Abb. 4.5.4 B) als bei neutralem pH-Wert. Die Bindung von SL-LPC an BHA bei saurem pH-Wert war [Seite 76↓] irreversibel. Nach der Reneutralisation der Suspension blieb der Anteil des an BHA gebundenen SL-LPC konstant (Daten nicht gezeigt).

Abb. 4.5.4Wechselwirkung von SL-LPC mit BHA. A: das obere (A1) und das mittlere (A2) Spektrum wurden in Anwesenheit von BHA bei pH 7.4 bzw. bei pH 5.0 aufgenommen (molares Verhältnis von BHA-Monomer : SL-LPC = 1:1.5). Das untere Spektrum (A3) entspricht SL-LPC in einer wäßrigen Umgebung (ohne Zugabe von BHA). Die Skala der Spektren A1 und A2 entspricht der zweifachen (pH 7.4) bzw. vierfachen (pH 5.0) des Spektrums A3. B: Das obere und das mittlere Spektrum wurden durch Subtraktion des Spektrums A3 vom Spektrum A1 bzw. A2 mittels ESR Softwares ermittelt. Es entspricht den an BHA gebundenem SL-LPC bei pH 7.4 (B1) bzw. pH 5.0 (B2). Bei saurem pH ist der Anteil der gebundenen SL-LPC (Pfeile) größer als bei neutralem pH. C: Das Spektrum von SL-LPC in Anwesenheit von BSA (molares Verhältnis von BSA:SL-LPC = 1:1.8). Das ESR-Spektrum zeigt eine starke Bindung (Pfeile) der SL-LPC-Analoga. Alle Spektren wurden bei 37°C mit einer Modulationsamplitude von 4 G und einer Scanbreite von 100 G aufgenommen. Der pH-Wert der entsprechenden BHA-Suspension wurden in Anwesenheit von SL-LPC auf 5.0 erniedrigt.


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Dennoch ist diese Bindung von SL-LPC an BHA bei saurem pH-Wert schwach im Vergleich zur Bindung von SL-LPC an das fettsäure- und lipidbindende Protein BSA (Bovines Serumalbumin) (Abb. 4.5.4 C). Bei einem molaren Verhältnis von BSA:LPC von 1:1.8 besteht das Spektrum nur aus einer immobilisierten Komponente. Das Fehlen von schmalen Linien deutet daraufhin, daß die gesamte Menge von SL-LPC an BSA gebunden ist.

4.5.3 Wechselwirkung von SL-LPC mit Influenzaviren

Bei der Untersuchung der Wechselwirkung von SL-LPC sowohl mit intakten als auch mit Bromelain-behandelten Viren wurde das gleiche molare Verhältnis von SL-LPC zu endogenen Lipiden (1:10) wie bei den Fusionsmessungen eingesetzt. Dies entspricht einem Verhältnis von SL-LPC zu HA-Monomeren von 1:5 (siehe "Material und Methoden"). In Anwesenheit von intaktem Virus bestand das SL-LPC-Spektrum aus zwei Komponenten: einer kleinen mobilen Komponente (schmale Linien), entstanden durch die sich im Suspensionsmedium frei bewegenden SL-LPC-Monomere (wie oben beschrieben), und einer immobilisierten Komponente, die typisch für ein Membranspektrum ist. In der Abbildung 4.5.5 sind die Membranspektren von intakten bzw. Bromelain-behandelten Viren bei den pH-Werten 7.4 und 5.0 (Abb. 4.5.5, A und B, C und D) nach der Subtraktion der mobilen Komponente dargestellt. Die Erniedrigung des pH-Wertes erfolgte wieder nach Zugabe von SL-LPC zu den Viren. Die Subtraktion ergab, daß der Anteil der freien SL-LPC weniger als 4 % der Gesamtmenge entspricht. Die Spektren wiesen keine signifikanten Unterschiede auf.

Durch zusätzliche Experimente konnte gezeigt werden, daß sich SL-LPC im äußeren Leaflet befindet. Es ist bekannt, daß BSA Lipide nur aus der äußeren, aber nicht aus der inneren Leaflet extrahieren kann (Morrot et al., 1989) . Nach Zugabe von BSA zu den markierten Viren wurde das gleiche immobilisierte Spektrum von SL-LPC mit BSA in Abwesenheit von Membranen erhalten (Abb. 4.5.4 C). Folglich wurde die gesamte Menge von SL-LPC aus der Membran extrahiert und an BSA gebunden.


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Abb. 4.5.5Wechselwirkung von SL-LPC mit intaktem (A und B) oder Bromelain-behandeltem Influenzavirus (C und D) bei pH 7.4 (A und C) bzw. pH 5.0 (B und D). Die Gesamtmenge von SL-LPC entspricht 10 mol% der endogenen Lipide in der Virushülle. Das molare Verhältnis von HA-Monomeren zu SL-LPC beträgt 1:5. Pfeile bezeichnen immobilisierte Komponenten. Für weitere Details siehe „Material und Methoden“ und Text. Die Spektren wurden bei 37°C mit einer Modulationsamplitude von 4 G und einer Scanbreite von 100 G aufgenommen.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Affinität von SL-LPC zur viralen Membran stärker ausgeprägt ist als zur HA-Ektodomäne. Um dies zu überprüfen, wurden Ei-PC-SUV mit SL-LPC in einem Verhältnis von SL-LPC:Ei-PC = 1:10 (wie bei SL-LPC zu Virus-Ghost-Komplex) markiert. Erneut wurde ein Zwei-Komponenten-Spektrum mit einer kleinen mobilen und einer immobilen Komponente, die auf in die äußere Leaflet eingebautes SL-LPC zurückzuführen ist, erhalten. Die Membrankomponente wurde durch die Zugabe von BHA sowohl beim neutralen pH-Wert als auch beim sauren pH-Wert nicht beeinträchtigt (Daten nicht gezeigt). Das molare Verhältnis von SL-LPC zu BHA-Monomer entsprach dem von SL-LPC zu HA im intakten Virus (5:1). Diese Ergebnisse zeigen, daß (a) BHA nicht in der Lage ist, SL-LPC aus der Membran in einer nachweisbaren Menge zu extrahieren und (b) SL-LPC eine höhere Affinität zum Lipidbilayer als zu BHA hat.


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4.6  Fluoreszenzmikroskopische Studien am exprimierten Sendaivirus-F-Protein und dessen Chimären

In diesem Teil der Arbeit wurde die Rolle der transmembranalen und zytoplasmatischen Domäne des Sendaivirus-F-Proteins für den Fusionsprozeß und entsprechende Intermediate untersucht. Dazu wurden unterschiedliche Chimären des SeV-F konstruiert, deren transmembranale und/oder zytoplasmatische Domäne durch die äquivalenten Domänen der Influenzavirus-HA oder des membranständigen Proteins CD4 ersetzt wurden (siehe Tab. 3.1). Die Proteine wurden unter Anwendung eines transienten T7-RNA-Polymerase-Vakziniavirus-Expressionssystems auf CV1-Zellen exprimiert (siehe "Material und Methoden"). Nach der Bindung der fluoreszenzmarkierten Targetzellen an Expressionszellen wurde die proteinvermittelte Zell-Zell-Fusion durch eine Inkubation bei 37°C ausgelöst und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es wurden doppelmarkierten Targetzellen verwendet. Um die Fusionsintermediate, die Lipidvermischung und die Öffnung kleiner wässrigen Fusionsporen aufzulösen, war die Plasmamembran der Targetzellen mit R18 und das Zytosol mit Calcein markiert.

4.6.1 Notwendigkeit der Co-Expression von HN

Die Arbeiten von Bousse et al., 1994 und Tanabayashi und Compans, 1996 belegen, daß bei Sendaiviren die Co-Expression von F und HN für die proteinvermittelte Zell-Zell-Fusion notwendig ist. Bei diesen Untersuchungen wurden aber Targetzellen verwendet, die keine spezifischen Rezeptoren für das SeV-F besitzen. In der vorliegenden und früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, daß das SeV-F in Abwesenheit von HN eine Fusion mit HepG2-Zellen vermitteln kann, vermutlich aufgrund einer Wechselwirkung mit ASGP-Rezeptoren (Bagai et al., 1993; Leyrer et al., 1998) . Basierend auf diesen Ergebnissen wurde untersucht, ob auch das exprimierte SeV-F eine Fusion mit HepG2-Zellen induzieren kann. Das Sendaivirus-F (Fwt) oder eine der F-Chimären wurden ohne HN auf CV1-Zellen exprimiert und die CV1-Zellen mit R18 und Calcein doppelmarkierten HepG2-Zellen bei 4°C inkubiert. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte festgestellt werden, daß nur 1 bis 2 HepG2-Zellen pro CV1-Zellen gebunden waren. Zum Auslösen der Zell-Zell-Fusion wurden die [Seite 80↓] Petrischalen mit den Zellen bei 37°C unterschiedlich lange (max. 3 Stunden) inkubiert. Es wurde ein Übergang weder der R18- noch der Calcein-Moleküle von HepG2-Zellen auf CV1-Zellen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Die ohne HN exprimierten Fwt bzw. F-Chimären konnten auch keine Fusion mit markierten Erythrozyten (RBC), die durch WGA an den CV1-Zellen gebunden waren, vermitteln (Daten nicht gezeigt). Aus diesen Daten wurde geschlußfolgert, daß eine Co-Expression des Sendaivirus-HN für unsere weitere Untersuchungen der SeV-F-vermittelten Zell-Zell-Fusion notwendig ist.

Als nächstes wurde das Mengenverhältnis der zu exprimierenden F und HN ermittelt, bei dem die Fusionsrate am höchsten ist. Unterschiedliche Mengen an Fwt- und HN-Plasmiden wurden bei der Transfektion der CV1-Zellen eingesetzt. Die Bindung von doppelmarkierten RBC an Expressionszellen sowie die Fusion zwischen RBC und CV1-Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Wenn HN ohne Fwt exprimiert wurde, war die Bindung der Erythrozyten sehr hoch (Abb. 4.6.1; schwarze Balken). Alle Zellen auf der Petrischale hatten mehr als 10 RBC gebunden. Bei allen anderen Ansätzen mit Fwt war die Bindung geringer als wenn nur HN exprimiert wurde, aber vergleichbar miteinander (Abb. 4.6.1; schwarze Balken). Der Anzahl der gebundenen RBC pro CV1-Zelle betrug 5-8. Zur Bestimmung des Fusionsausmaßes wurde die Anzahl der CV1-Zellen, die fluoreszenzmarkiert waren, und die Anzahl der nicht markierten CV1-Zellen, an denen RBC gebunden waren, nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C ermittelt. Basierend auf der Summe dieser Zellen wurde der Prozentsatz der fusionierten Zellen bestimmt. Wenn nur HN exprimiert wurde, fand keine Fusion statt. Bei einem Verhältnis von Fwt-cDNA zu HN-cDNA von 1:2 (w/w) war die Anzahl der fusionierten Zellen am höchsten (Abb. 4.6.1; graue Balken). Zu beachten ist, daß bei den unterschiedlichen Ansätzen alle fusionierten Zellen doppelmarkiert waren. Das heißt, daß sowohl eine Membranverschmelzung als auch eine Öffnung wäßriger Poren stattgefunden hatte. Für weitere Experimente wurden die CV1-Zellen jeweils mit Fwt- bzw. F-Chimäre-cDNA und HN-cDNA in einem Mengenverhältnis von 3 µg:6 µg transfiziert.


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Abb. 4.6.1Ausmaß der Bindung der Targetzellen (schwarze Balken) und der Fusion (graue Balken) an CV1-Zellen, die mit unterschiedlichen Mengen an cDNA von SeV-HN und SeV-F transfiziert wurden. Nach der Transfektion der CV1-Zellen wurden fluoreszenzmarkierte Erythrozyten zugegeben und bei 4°C gebunden. Die Zellen wurden bei 37°C inkubiert, um die Fusion zu induzieren. Die Bindung der Targetzellen und die Fusion wurde anhand der Fluoreszenzmarker mittels Fluoreszenzmikroskopie ermittelt. Für weitere Details siehe „Material und Methoden“ und Text. Es wurden die Mittelwerte und die Standardabweichungen dargestellt (n≥3).

4.6.2 Einfluß der Substitution der F-Domänen auf die Zell-Zell-Fusion

Die Untersuchung der Fusion der Fwt-, FFH-, FHF-, FHH-, F4F- bzw. F44- (siehe Tab. 3.1) exprimierenden CV1-Zellen mit RBC wurde wie in "Material und Methoden" beschrieben durchgeführt. Nach der Bindung der doppelmarkierten RBC an CV1 wurde die Zell-Zell-Fusion durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37°C ausgelöst. Nach 15 min Inkubation bei 37°C wurde bei Fwt-, FFH- und FHF-exprimierenden Zellen der Übergang von R18 und Calcein beobachtet, was auf eine Vermischung der Plasmamembran und Öffnung kleiner wäßrigen Poren hinweist. Nach 30 min war ein weiterer Anstieg der Zahl der fusionierten Zellen zu verzeichnen, und auch bei FHH-exprimierten Zellen fand der Übergang beider Fluorophoren statt. Die F4F-exprimierenden CV1-Zellen waren nach 45 min doppelmarkiert. Erst nach 1 h wurde bei F44 der Übergang von R18 beobachtet, der [Seite 82↓] Übergang von Calcein wurde auch nach einer längeren Inkubation (2 h) nicht registriert. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen der Verteilung der Fluorophore nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C sind in der Abbildung 4.6.2 gezeigt.

Die Zell-Zell-Fusion, die durch das Fwt oder einer der F-Chimären vermittelt wurde, war nicht nur im zeitlichen Verlauf unterschiedlich, sondern auch im Ausmaß. In der Tabelle 4.3 ist die Verteilung der beiden Fluorophore bei den untersuchten Proteinen qualitativ verglichen. Da das Fusionsausmaß unter anderem von der Anzahl der gebundenen Targetzellen abhängig sein könnte, wurde auch die Bindung der RBC angegeben.

Bei allen Chimären, außer F44 und FHF, wurde eine ähnlich starke Bindung von Targetzellen wie bei Fwt festgestellt. Die F44- und FHF-exprimierenden Zellen hatten weniger RBC gebunden. Trotz einer vergleichbaren RBC-Bindung war der Übergang von R18 bei allen Chimären geringer als bei Fwt. Besonders bei F44 waren nur wenige Zellen rot markiert. Der Vergleich des Calcein-Übergangs zeigt noch mehr Unterschiede zwischen den Chimären und Fwt. Nur bei FFH waren alle Zellen wie bei Fwt-exprimierenden Zellen doppelmarkiert. Bei den Chimären FHF, FHH und F4F wiesen nur ein geringer Anteil der rot markierten Zellen eine grüne (Calcein) Markierung auf. Wie oben bereits erwähnt, fand bei den F44-exprimierten Zellen kein Calcein-Übergang statt.

Tab. 4.3:Qualitativer Vergleich des Ausmaßes der Bindung von Targetzellen (RBC) an CV1-Zellen und des durch die Fusion bedingten R18- bzw. Calcein-Übergangs auf CV1-Zellen, die F-Protein bzw. Chimären exprimieren. (+++ - viele Zellen, ++ - einige Zellen, + - einzelne Zellen, - - keine Zellen)

 

 

 

 

 

 

 

Fwt

F4F

F44

FFH

FHF

FHH

 

      

Bindung von RBC

+++

+++

++

+++

++

+++

 

      

R18-Übergang

+++

++

+

++

++

++

 

      

Calcein-Übergang

+++

+

-

++

+

+

Abb. 4.6.2 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Markerverteilung während der proteinvermittelten Zell-Zell-Fusion. An Fwt-, F4F-, F44-, FFH-, FHF- und FHH-exprimierende CV1-Zellen waren doppelmarkierte (R18 und Calcein) Erythrozyten gebunden und die Fusion wurde nachfolgend durch eine Inkubation bei 37°C ausgelöst. Die Bilder des R18- (1. und 3. Reihe) und Calcein-Übergangs (2. und 4. Reihe) auf die CV1-Zellen wurden bei RT 1 h nach dem Auslösen der Fusion aufgenommen. Für weitere Details siehe "Material und Methoden" und im Text.


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Zusammenfassend kann man sagen, daß die Substitution der transmembranalen und/oder zytoplasmatischen Domäne des SeV-F durch HA-Domänen keinen Einfluß auf die Fusionsaktivität des F-Proteins haben. Die F-HA-Chimären vermittelten sowohl eine Lipidvermischung als auch eine Öffnung kleiner wäßrigen Poren. Das Gleiche gilt für die F4F-Chimäre, wo die transmembranale Domäne durch die CD4-Domäne vertauscht worden ist. Wenn aber die transmembranale und zytoplasmatische Domänen durch CD4-Domänen substituiert waren, wurde die Öffnung kleiner wäßrigen Poren verhindert. Ob der Austausch nur der zytoplasmatischen Domäne des SeV durch die entsprechende Domäne des CD4 zum gleichen Effekt, d.h. Lipidvermischung, aber keine Porenöffnung, führt, muß noch untersucht werden.

4.6.3 Untersuchung der Vakziniavirus-infizierten Zellen

Um auszuschließen, daß Vakziniavirus-spezifische Produkte die Zell-Zell-Fusion induzieren konnten, wurden CV1-Zellen ohne der nachfolgenden Transfektion mit cDNA mit Vakziniavirus infiziert. An diese Zellen wurden doppelmarkierte RBC mittels WGA gebunden, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert. Selbst nach 3 h Inkubation bei 37°C wurde weder ein Übergang von R18- noch von Calcein-Molekülen registriert. Da WGA keinen inhibierenden Einfluß auf die Fusion hat (Schroth-Diez et al., 1998) , kann man davon ausgehen, daß die oben beschriebene Zell-Zell-Fusion tatsächlich von Fwt oder entsprechenden Chimären vermittelt wurde. Auch der Befund, daß keine Fusion stattfand, wenn HN alleine exprimiert wurde, bestätigt diese Aussage.


Fußnoten und Endnoten

1  Zur Fusionsmessung wurden auf 2 ml Endvolumen 50 µl Ghosts und 20 µl Viren verwendet. Bei Ghosts machen 50 % der Gesamtmasse Lipide aus, und bei Sendaiviren 26 %. Da der Anteil der viralen Lipide nur 2.75 mol% der gesamten endogenen Lipide im Fusionssystem ausmacht, wurde die gesamte Menge von Lysolipiden zur Ghost-Suspension zugegeben.



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08.12.2003