[Seite 85↓]

5  Diskussion

5.1 Die 3D-Struktur des Sendaivirus-Fusionsproteins

Das Fusionsprotein des Sendaivirus (SeV-F) wurde erfolgreich aus nativen Viren isoliert. Es lag in der gespaltenen fusionskompetenten Form F1+F2 vor, und wies nach der Isolierung Fusions- und Hämolyseaktivität auf. Die Crosslinking Experimente ergaben, daß das SeV-F als Homotrimer organisiert ist. Dies steht im Widerspruch zu den Ergebnissen von Sechoy et al. (1987) , die basierend auf dem Molekulargewicht von crosslinkten Proteinen eine tetramere Struktur des SeV-F berechnet haben. Untersuchungen an anderen Vertretern aus der Familie Paramyxoviridae wie das SV5, das HPIV3 (Russel et al., 1994) , das Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV) (Calder et al., 2000) sowie das NDV (Chen et al., 2001) ergaben jedoch, daß deren F-Proteine eine trimere Struktur haben. Da unser Ergebnis mit drei unabhängigen Untersuchungen übereinstimmt, ist es sehr wahrscheinlich, daß das SeV-F als Trimer vorliegt. Dies wurde auch während der Aufklärung der 3D-Struktur bestätigt (siehe "Ergebnisse").

Durch die Rekonstitution des F-Proteins unter Zugabe von 131 µM Ei-PC und 55.6 µM Rh-PE gelang es, eine homogene Probe von sich nicht überlappenden Molekülen mit unterschiedlicher Verteilung im Raum herzustellen. Damit wurde eine zwingende Voraussetzung für die Aufklärung der 3D-Struktur des F-Proteins geschaffen.

Die dreidimensionale Struktur der gesamten Ektodomäne des F-Glykoproteins des Sendaivirus wurde aus kryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen einzelner Moleküle mit einer Auflösung von 16 Å rekonstruiert. Mit seinem Molekulargewicht von ca. 180 kDa ist es eines der kleinsten Moleküle, dessen 3D-Struktur bisher mit dieser Methode aufgeklärt wurde.

Die einzige bisher bekannte 3D-Struktur eines Paramyxovirus-F-Proteins ist die Röntgenkristallstruktur des NDV-F mit einer Auflösung von 3.3 Å (Chen et al., 2001) . Der Vergleich der Primärsequenz dieses Proteins mit der des SeV-F zeigt eine Identität von


[Seite 86↓]

Abb. 5.1.1: Vergleich der 3D-Struktur des NDV-F und des SeV-F. Die obere Reihe zeigt die seitliche Ansicht der Proteine, die untere Reihe die Ansicht von oben. (A) Die Röntgenkristallstruktur des NDV-F mit einer verringerten Auflösung von 16 Å (fliederfarbene Darstellung). (B) Anpassung der Röntgenstruktur des NDV-F an die kryoelektronenmikroskopisch ermittelte 3D-Struktur des SeV-F (blaue Darstellung). (C) Anpassung der SeV-F-Struktur (Netzgitter) an die "low-pass"-gefilterte NDV-F-Struktur (fliederfarbene Darstellung). Weitere Details siehe Text. Mit freundlicher Genehmigung von K. Ludwig.

ca. 25 %, die ziemlich homogen über die gesamte Proteinsequenz verteilt ist. Wenn man in Betracht zieht, daß die Fusionsproteine des Semliki-Forest-Virus E1 (Lescar et al., 2001) und des Thick-Borne-Encephalitis-Virus E (Rey et al., 1995) trotz einer Sequenzidentität von nur 12 % eine sehr ähnliche Faltung aufweisen, kann man auch eine große Analogie zwischen den 3D-Strukturen des SeV-F und des NDV-F erwarten. Um einen direkten Vergleich zwischen [Seite 87↓] diesen Proteinen zu ziehen, wurde die hohe Auflösung der Röntgenkristalstruktur mittels eines scharfen Fourierfilters zurückgesetzt (Abb. 5.1.1 A).

Bei einer Auflösung von 16 Å weisen die Proteine abgesehen von den Unterschieden in der Stiellänge eine gute Übereinstimmung in ihrer äußeren Form und räumlichen Anordnung auf (siehe Abb.  4.1.6 und 5.2.1 A). Die Ansicht von oben zeigt bei den Proteinen eine dreieckige Ausrichtung des Moleküls und eine zentrale Öffnung. Auch die Lage und die Größe der radialen und axialen Kanäle im oberen Bereich der Proteine sind vergleichbar. Um eine exakte Aussage zu machen, inwieweit die 3D-Strukturen des SeV-F und des NDV-F sich decken, reicht jedoch ein rein äußerlicher Vergleich nicht aus. Daher wurde ein SITUS Software Paket, das Proteinstrukturen an Hand ihrer vertikalen dreidimensionalen Dichtekarte aneinander dockt, verwendet. Die Resultate einer Andock-Berechnung sind in Abbildung 5.1.1 B, C dargestellt und zeigen folgende Übereinstimmungen und Unterschiede in der Struktur der beiden Proteine auf: Ein gemeinsames charakteristisches Detail ist, daß die radialen Kanäle und die zentrale Höhlung von ähnlichen Fragmenten mit hoher Dichte umgeben sind. Auch die Lage dieser Fragmente stimmt überein. Bei beiden Proteinen bildet der Hals im unteren Bereich eine Verdickung. Die Strukturen weisen drei wesentliche Unterschiede auf. (i) Der Hals des SeV-F ist im oberen Bereich breiter als bei NDV-F (gut erkennbar auf der Abb. 5.2.1 C). (ii) Der axiale Kanal ist bei SeV-F durch eine Dreiarm-Brücke von den radialen Kanälen abgegrenzt (siehe auch Abb. 4.2.6 C, D). (iii) Die flügelähnlichen Ausbuchtungen sind im Uhrzeigersinn verschoben (Abb. 5.1.1 B und C, untere Reihe). Der kürzere Stiel des NDV-F basiert aber nicht auf einem Strukturunterschied zwischen den Proteinen. Das zur Virushülle hin proximale Ende des NDV-F-Proteins konnte aufgrund seiner hohen Flexibilität nicht aufgelöst werden und fehlt daher in der Röntgenstruktur (Chen et al., 2001) . Außerdem fehlen in dieser Struktur Segmente, die in der Primärstruktur den AS 106-170 und AS 455-553 entsprechen.

Die Tatsache, daß die Proteinstrukturen trotz einiger Übereinstimmungen Unterschiede aufweisen, deutet auf verschiedene Konformationszustände der Proteine hin. Ein Grund für unterschiedliche Konfomationszustände könnte im Ursprung dieser Proteine liegen. Für die Röntgenstrukturanalyse des NDV-F wurde das Vorläuferprotein F0 exprimiert. Im Falle des SeV-F kann man sicher sagen, daß es sich um ein gespaltenes Protein handelt. Aus früheren Untersuchungen an Paramyxoviren ist bekannt, daß nach der Spaltung des F0 zur F1+F2-Form eine Konformationsumwandlung stattfindet (Hsu et al., 1981; Dutch et al., 2001) . [Seite 88↓] Mittels CD-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß das Vorläuferprotein des SeV-F und das gespaltene SeV-F Abweichungen in ihrer Konformation aufweisen (Hsu et al., 1981) . Eine signifikante Änderung in der Antikörpererkennung wurde bei SV5-F nach der Spaltung des F0 in die fusionskompetente Form F1+F2 beobachtet (Dutch et al., 2001) . Antikörper gegen die ‚heptad repead’-Sequenzen konnten diese Regionen nur beim ungespaltenen Protein erkennen. Daher kann man schlußfolgern, daß die von uns rekonstruierte 3D-Struktur ein gespaltenes F-Protein in der F1+F2-Form darstellt. Eine eindeutige Klassifizierung der Kristallstruktur des NDV-F ist leider nicht möglich. Obwohl zur Expression des F0 von NDV eine F-Mutante, die die Spaltungsstelle zwischen F1 und F2 nicht besitzt, und ein Expressionssystem, das nicht in der Lage ist das F0 zu spalten, verwendet wurde, war das auskristallisierte F-Protein proteolytisch gespalten. Die Autoren vermuten, daß die Röntgenstruktur einer Mischung aus F0 und gespaltenem F-Protein entspricht (Chen et al., 2001) .

In einer früheren Arbeit von Calder et al. (2000) wurde von zwei unterschiedlichen Formen der F-Ektodomäne eines Paramyxovirus berichtet. Anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen von negativkontrastierten und getrockneten Proben von HRSV-F konnte eine "cone"- bzw. "lollipop"-Form identifiziert werden. Weiterführende Untersuchungen ergaben, daß das HRSV zwei Spaltungsstellen besitzt und erst durch die enzymatische Spaltung an beiden Stellen das F-Protein den fusionskompetenten Zustand erreicht. Es wird angenommen, daß das F-Protein nach der zweiten Spaltung von der "cone" zur "lollipop"-Form übergeht (Gonzales-Reyes et al., 2001; Ruiz-Argello et al., 2002) . Weil das von uns verwendete SeV-F in der gespaltenen Form vorliegt, müßte es nach diesen Erkenntnissen die "lollipop"-Form aufweisen. Chen und Mitarbeiter nehmen an, daß das NDV-F dem "cone"-förmigen Zustand entspricht (Chen et al., 2001) . Ein Vergleich der äußeren Form der beiden Proteine, die in der Abbildung 4.6.1 B und 5.1.1 A (oben) dargestellt sind, zeigt, daß der globuläre Teil des SeV-F tatsächlich etwas kugelförmig und der des NDV-F konusförmig ist.

Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen und des Befundes, daß das isolierte F-Protein Fusionsaktivität aufweist, stellt die von uns aufgeklärte 3D-Struktur des Sendaivirus-F-Proteins einen gespaltenen fusionskompetenten Zustand dar.


[Seite 89↓]

5.2  Das Fusionsprotein des Simianvirus 5

Die Struktur des antiparallelen "coiled-coil" eines Paramyxovirus wurde zum ersten Mal anhand von gentechnisch hergestellten Peptiden, die den "heptad repeat"-Sequenzen des Simianvirus 5 entsprechen, aufgeklärt (Baker et al., 1999) . SV5 unterscheidet sich von den anderen Paramyxoviren auch dadurch, daß das exprimierte SV5-F in Abwesenheit des homotypischen HN eine Fusion induzieren kann. Das SV5 ist daher einer der interessantesten Vertreter der Paramyxoviren, und die Aufklärung der 3D-Struktur des SV5-F könnte neue Hinweise zur paramyxovirusvermittelten Fusion geben.

Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit eine Methode zur Isolierung des SV5-F unter Erhaltung der biologischen Proteinfunktion etabliert. Zur Solubilisierung der Virushülle wurde Triton X-100 verwendet, und die Membranproteine F und HN wurden mittels Säulenchromatographie voneinander getrennt (siehe Abschnitt 4.2). Das aus nativen Viren isolierte F-Protein des SV5 lag im fusionskompetenten Zustand vor, denn es konnte Hämolyse induzieren (Abb. 4.2.2). Damit wurde erstmals gezeigt, daß das SV5-F aus nativen Viren in Abwesenheit von HN Hämolyse induzieren kann. Diese Feststellung korreliert mit den Ergebnissen der Untersuchungen an exprimierten SV5-F-Proteinen. Zur Induktion von Hämolyse war jedoch die Zugabe von WGA notwendig, das die Bindung der SV5-F-Virosomen an die Erythrozyten gewährleistet.

Die ersten elektronenmikroskopischen Aufnahmen dieser Proben zeigten, daß das SV5-F-Protein eine dem SeV-F ähnliche Form hat. Es besteht aus einem globulären Kopf und einem dünnen Stiel. An manchen Proteinen ist sogar zu erkennen, daß sie im globulären Teil eine Höhlung aufweisen. Nähere Aussagen können natürlich erst nach der Aufklärung der 3D-Struktur gemacht werden. Aus den Aufnahmen ist auch ersichtlich, daß diese Präparation für die Rekonstruktion der 3D-Struktur mittels Kryoelektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse sehr gut geeignet ist. Die Arbeiten zur Aufklärung der 3D-Struktur des SV5-F werden demnächst begonnen.


[Seite 90↓]

5.3  pH- und Temperaturabhängigkeit der Fusionsaktivität von Paramyxoviren

Für das Verständnis der paramyxovirusvermittelten Membranfusion ist die Kenntnis der 3D-Struktur des Fusionsproteins im fusionsaktiven Zustand notwendig. Der Auslöser für die Konformationsumwandlung des F-Proteins vom fusionskompetenten zum fusionaktiven Zustand ist jedoch bislang nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Fusionsverhalten des Sendaivirus und des Simianvirus 5 bei unterschiedlichen pH-Werten und Temperaturen untersucht, um physikochemische Bedingungen herauszufinden, bei denen eine Strukturänderung des isolierten F-Proteins induziert werden kann.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Änderung des pH-Wertes nur einen geringen Einfluß auf die Fusionsaktivität des SeV hat (Abb. 4.3.1 und 4.3.2). In der Literatur gibt es keine einheitlichen Aussagen über die pH-Abhängigkeit der SeV-vermittelten Fusion. Hsu und Mitarbeiter haben eine Erhöhung der Fusionsaktivität bei basischem pH gefunden, aber Klappe und Mitarbeiter ermittelten bei saurem pH einen Anstieg der Fusion (Hsu et al., 1982; Klappe et al., 1986) . In der vorliegenden Arbeit wurde eine leichte Erniedrigung des Fusionsausmasses bei basischem pH und eine leichte Erhöhung bei saurem pH gefunden. Trotz des beobachteten Anstiegs des Fusionsausmasses bei saurem pH-Wert kann man feststellen, daß diese Bedingungen keine optimalen Konditionen für die SeV-Ghosts-Fusion bieten, da die Anfangsgeschwindigkeit der Fusion bei saurem pH niedriger als bei neutralem pH ist und die Fusionskurve bei saurem pH eine "lag"-Zeit aufweist (Abb. 4.3.1). Die „lag“-Zeit kennzeichnet die Zeitdauer zwischen dem Start der Fusionsmessung und der ersten meßbaren Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Während dieser Zeit finden wahrscheinlich Schritte statt, die zur Initiierung der Fusion notwendig sind, wie die Wechselwirkung zwischen HN und F, Akkumulation der Membranproteine an den Kontaktseiten mit dem Target sowie die Konformationsumwandlung des F-Proteins. Aus diesen Messungen können keine direktenSchlußfolgerungen über den Ablauf oben genannter Prozesse gewonnen werden. Es ist jedoch anzunehmen, daß die Strukturumwandlung des SeV-F beim saurem pH-Wert zu einem späteren Zeitpunkt stattfindet oder langsamer verläuft als bei neutralem pH-Wert, weil die Membranfusion bei saurem pH-Wert später als bei neutralem zu beobachten ist.


[Seite 91↓]

Im Falle des SV5 wurde eine fast zweifache Zunahme der Fusionsaktivität bei einem pH-Wert von 5.0 gefunden (Abb. 4.3.2). Es ist jedoch unklar, ob der niedrige pH-Wert die Konformationsumwandlung des SV5-F beeinflußt. Die Tatsache, daß durch eine Inkubation des SV5 in Abwesenheit von Target bei saurem pH über längere Zeit (6 h) die Fusionsaktivität des SV5 nicht beeinträchtigt wurde (siehe Abschnitt 4.2), deutet eher darauf hin, daß das saure Milieu anders als beim Influenzavirus-HA keine Konformationsänderung des F-Proteins auslöst. Bei Paramyxoviren könnte jedoch das Vorhandensein eines Targets für die Konformationsumwandlung des F-Proteins notwendig sein. Daher müssen zukünftige Strukturuntersuchungen klären, ob ein niedriger pH-Wert einen direkten Einfluß auf die F-Protein-Strukturänderung hat.

Die Untersuchungen zur Temperaturabhängigkeit der Fusionsaktivität des SeV und des SV5 zeigen, daß mit der Erhöhung der Temperatur das Ausmaß sowie die Anfangsgeschwindigkeit der Fusion ansteigt und die "lag"-Zeit abnimmt (Abb. 4.3.3 und 4.3.4). Dies ist wahrscheinlich auf eine erhöhte laterale Beweglichkeit der beiden membranständigen Proteine F und HN zurückzuführen, denn es existiert eine direkte Korrelation zwischen der lateralen Mobilität der Proteine und der Fusionsaktivität (Henis et al., 1989). Es wurde festgestellt, daß durch eine Immobilisierung der Proteine HN und F die SeV-Fusion inhibiert wird. Daher ist die laterale Beweglichkeit der Membranproteine essentiell für die Fusion (Henis et al., 1989) . Außerdem hat die Erhöhung der Temperatur auch einen Einfluß auf die Konformationsumwandlung des F-Proteins. Das Erwärmen von SeV führt auch in Abwesenheit von Target zur Strukturänderung des F-Proteins, wodurch das F-Protein zugänglich für Proteinase K wird (Wharton et al., 2000) . Es konnte für das HA von Influenzavirus A gezeigt werden, daß aufgrund der Metastabilität der nativen Konformation des HA nicht nur durch Senkung des pH-Wertes, sondern auch durch Erwärmung bei neutralem pH-Wert die fusionsaktive Konformation erzielt werden kann (Wharton et al., 1986, Carr et al., 1997) . Falls diese Metastabilität ein typisches Charakteristikum der Fusionsproteine von Hüllviren ist, kann man schlußfolgern, daß die Erhöhung der Temperatur einen direkten Einfluß auf die Konformationsänderung des F-Proteins hat. Durch Erwärmung könnte die Wechselwirkung zwischen den F2- und F1-Untereinheit aufgelockert werden, und dies könnte zur Freilegung der hydrophoben Fusionspeptide aus dem Innern des F-Trimers und damit zur Fusion führen. Man nimmt an, daß eine Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten F1 und F2 zur Stabilisierung des F-Proteins beiträgt. Punktmutationen dieser [Seite 92↓] Untereinheiten führen zur Destabilisierung des F-Proteins, und entsprechende F-Mutanten sind in der Lage in Abwesenheit von HN eine Membranfusion zu vermitteln (Ito et al., 1997; Ito et al., 2000; Tsurudome et al., 2001) . Es ist jedoch zu beachten, daß bei den genannten Versuchen entweder das HN-Protein oder eine Targetmembran vorhanden war. Die Experimente zur Strukturänderung des F-Proteins in Abwesenheit von Target wurden an nativen Viren, d.h. in Anwesenheit von HN, durchgeführt (Wharton et al., 2000). Die Fusionsaktivität des F-Proteins in Abwesenheit von HN wurde anhand von F-proteinvermittelten Zell-Zell-Fusion überprüft (Ito et al., 1997; Ito et al., 2000; Tsurudome et al., 2001) .

Die vorliegenden Ergebnisse bilden eine Grundlage für weterführende Untersuchungen am isolierten SeV-F- bzw. SV5-F-Protein. Es ist wichtig zu erforschen, ob eine Erhöhung der Temperatur oder eine Erniedrigung des pH-Wertes ausreichend für die Strukturänderung eines isolierten F-Proteins ist oder andere Faktoren wie z. B. das Vorhandensein von Target oder des HN-Proteins eine entscheidende Rolle dabei spielen. Erst dann könnten ausreichende Bedingungen zum Auslösen der Konformationsänderung des isolierten F-Proteins vom fusionskompetenten zum fusionsaktiven Zustand geschaffen werden. Außerdem müssen natürlich optimale Bedingungen für die Strukturaufklärung herausgefiltert werden, denn eine zu lange Inkubationszeit oder eine zu hohe Inkubationstemperatur könnte zur Inaktivierung des F-Proteins führen.

5.4 Wechselwirkung von LPC mit Myxoviren

5.4.1 Einfluß von LPC auf die Fusion von Sendai- und Influenzaviren

In diesem Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, daß Lysophosphatidylcholin, Myristoyl, (LPC) die Fusion von Sendaiviren mit Erythrozytenghosts hemmt. Der inhibierende Einfluß von LPC war abhängig von der Menge der zugegebenen Lysolipide. In Anwesenheit von 2 mol% LPC bezogen auf endogene Virus- und Ghostlipide (3.4 µM) wurde [Seite 93↓] die Fusion von SeV um 20 % gehemmt, und durch 10 mol% LPC (17 µM Endkonzentration) um 80 % (Abb. 4.4.2). Der inhibierende Einfluß von LPC auf die Membranfusion wurde ebenso bei Influenzavirus-vermittelter Fusion festgestellt. Durch Zugabe von 10 mol% LPC bezogen auf die endogenen Lipide von Ghost und Virus (13 µM Endkonzentration) wurde die Influenzavirus-Ghost-Fusion jedoch nur um ca. 20 % erniedrigt (4.5.1 B). Es ist unwahrscheinlich, daß dieser Unterschied des LPC-Einflusses durch die unterschiedlichen Endkonzentrationen hervorgerufen wird, denn bezogen auf das gesamte System (Ghost und Virus) wurde immer die gleiche Menge von LPC eingesetzt. Die unterschiedliche Hemmung des Fusionsausmasses von Influenza- bzw. Sendaiviren durch LPC basiert daher eher auf den Eigenschaften des jeweiligen Fusionssystems. Ein Vergleich der Ergebnisse von früheren Arbeiten zeigt auch, daß die Sensitivität verschiedener Systeme hinsichtlich des inhibierenden Einflusses von Lysolipiden auf die Fusion unterschiedlich ist. Während durch 10 mol% LPC, Palmitoyl, die Fusion von HA-exprimierenden Zellen mit Erythrozyten um ca. 70 % gehemmt wird (Chernomordik et al., 1997) , wird die GTP-abhängige Mikrosom-Mikrosom-Fusion nur um 50 % inhibiert (Chernomordik et al., 1993) .

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen deutlich, daß sich Lysolipide zum "Einfangen" von Intermediaten der SeV-F-vermittelten Fusion besonders eignen. Es ist jedoch nicht eindeutig geklärt wie und im welchem Fusionsintermediat die Lysolipide die Membranfusion hemmen. Wie bereits in der Einführung erwähnt, existieren zwei gegensätzliche Theorien. Chernomordik und Mitarbeiter vertreten die Ansicht, daß die Lysolipide durch ihren Einbau in die äußere Monolayer die Ausbildung von Stalks hemmen (Chernomordik et al., 1987; Kozlov et al., 1989; Chernomordik et al., 1995; Chernomordik et al., 1997; Chernomordik et al., 1999). Günther-Ausborn und Mitarbeiter vermuten dagegen, daß eine direkte Interaktion von LPC mit der HA-Ektodomäne die Wechselwirkung des Fusionspeptides mit der Targetmembran verhindert und damit Lysolipide die Membranfusion in einem früheren Schritt als der Ausbildung von Stalks hemmen (Günther-Ausborn et al. 1995).

5.4.2 LPC wechselwirkt mit der Virushülle und nicht mit der HA-Ektodomäne

Um die Interaktion von LPC mit der HA-Ektodomäne bzw. mit der Virushülle [Seite 94↓] aufzulösen, wurde spinmarkiertes LPC verwendet. Beim spinmarkierten Derivat ist die für LPC typische „umgekehrte Kegel“-Form durch die Nitroxidgruppe an der hydrophoben Ende der C18-Kette etwas gestört. Jedoch konnten wir zeigen, daß die Inhibierung von Influenzavirus-Fusion durch spinmarkierte LPC vergleichbar mit der des nicht markierten LPC ist (siehe Abb. 4.5.2). Das SL-LPC stellt daher ein geeignetes Analogon dar.

Die Wechselwirkung von SL-LPC mit BHA war pH-abhängig. Bei neutralem pH-Wert wurde eine Wechselwirkung von SL-LPC mit BHA festgestellt, obwohl bei HA unter diesen Bedingungen das hydrophobe Fusionspeptid nicht aus der Ektodomäne herausragt. Wenn der pH-Wert auf 5.0 gesenkt wurde, erhöhte sich die Bindung von SL-LPC zu BHA. Dieses Ergebnis kann durch die Exponierung hydrophober Sequenzen nach der Konformationänderung der HA-Ektodomäne erklärt werden. Dies wurde auch durch den Befund, daß die erhöhte Bindung von SL-LPC bei saurem pH-Wert auch nach einer Reneutralisierung konstant bleibt, unterstützt. Es ist bekannt, daß die Konformationsänderung des HA und die damit verbundene Exponierung des Fusionspeptides irreversibel ist (Korte et al., 1999; Stegmann et al., 1986). Aufgrund ihrer hohen Hydrophobizität bietet das Fusionspeptid am N-terminalen Ende des HA2 wahrscheinlich nach der Exponierung neue Bindungsstellen für SL-LPC. Diese Bindung der Lysolipidanaloga an die HA-Ektodomäne spiegelt sich in einer erhöhten Immobilisierung von SL-LPC wider. Die Wechselwirkung von SL-LPC mit BHA war jedoch im Vergleich zur Wechselwirkung von SL-LPC mit dem fettsäure- und lipidbindenden Protein BSA viel schwächer. Um die Wechselwirkung von SL-LPC mit der HA-Ektodomäne aufzulösen, musste in der Tat ein viel höheres Mengenverhältnis von BHA zu SL-LPC verwendet werden.

In Anwesenheit von Influenzavirus war SL-LPC fast ausschließlich in die Virusmembran eingebaut. Bei einer Konzentration von 10 mol% der endogenen Lipide befanden sich weniger als 4 % der zugegebenen SL-LPC in der wäßrigen Umgebung. Diese Ergebnisse deuten auf eine hohe Affinität der Lysolipidanaloga zur Membran hin. Tatsächlich entsprechen die gemessenen Spektren typische Membranspektren. Es gab keine Hinweise darauf, daß eine signifikante Menge an SL-LPC sowohl bei neutralem als auch bei saurem pH-Wert an die HA-Ektodomäne des intakten Viruses bindet. Die Spektrumkomponente, die bei der Bindung von SL-LPC an BHA aufgenommen wurde, war bei den Spektren mit intakten Viren nicht vorhanden. Desweiteren war das SL-LPC-Spektrum in Anwesenheit von intakten Viren identisch mit dem Spektrum in Anwesenheit von Viren, bei denen die HA-[Seite 95↓] Ektodomäne durch eine Bromelainbehandlung abgespalten waren. Daher ist zu vermuten, daß die hohe Anzahl der Bindungstellen der Virushülle und deren Affinität mit den Bindungsstellen der HA-Ektodomäne konkurriert und damit eine signifikante Bindung der Lysolipidanaloga zur Ektodomäne unterbindet. Zusätzliche Unterstützung für diese Vermutung gaben Untersuchungen der Wechselwirkung von BHA mit SL-LPC markierten Liposomen. Es wurde weder eine Interaktion noch eine Extraktion der Analoga durch BHA aus der Liposomenmembran gefunden. Im Gegensatz dazu war BSA in der Lage die Lysolipide aus der Liposomenmembran vollständig zu extrahieren. Daraus schlußfolgern wir, daß die immobilisierte Komponente in den Membranspektren von SL-LPC durch die in die Membran eingebauten und nicht durch die an die HA-Ektodomäne gebundenen SL-LPC hervorgerufen wurde.

Zusammenfassend kann man sagen, daß unter Bedingungen, bei denen die Fusionsinhibierung festgestellt wurde, eine starke Wechselwirkung der SL-LPC mit dem Lipidbilayer der Virushülle und keine Bindung der spinmarkierten Analoga an die HA-Ektodomäne gefunden wurde. Diese Ergebnisse liefern ein überzeugendes Indiz dafür, daß die Lysolipidhemmung der Membranfusion durch in die Lipidbilayer eingebauten Lysolipide hervorgerufen wird, so wie in der Stalk-Hypothese angenommen wurde (Chernomordik et al., 1999). Unsere Daten sprechen gegen die Hypothese der Wechselwirkung von Lysolipiden mit der HA-Ektodomäne, wodurch das Eintauchen des Fusionspeptides in die Targetmembran verhindert wird (Günther-Ausborn et al., 1995). Dementsprechend hemmen die Lysolipide die Membranfusion in einem späten Schritt, und nicht am Anfang der Fusion. Obwohl diese Daten für eine Inhibierung der Fusion durch membrangebundene Lysolipide sprechen, können sie eine Wechselwirkung des Fusionspeptides mit Lysolipiden nach dem Eintauchen dieser Sequenz in die Membran nicht widerlegen. Diese Wechselwirkung würde aber zu einer lokalen Anreicherung von Lysolipiden führen, die eine Bildung von Strukturen mit einer negativen Krümmung verhindern würde. In diesem Falle würde die Ausbildung der Stalks mit einem Hemifusionsintermediat aufgrund der lokalen Anreicherung von Lysolipiden energetisch noch ungünstiger.


[Seite 96↓]

5.5  Die Rolle der transmembranalen und zytoplasmatischen Domäne des Sendaivirus-F bei der Membranfusion

In der vorliegenden Arbeit wurde die Fusionsaktivität unterschiedlicher Chimären des SeV-F mit transmembranalen (TM) und/oder zytoplasmatischen (CT) Domänen des Influenzavirus-HA bzw. des membranständigen Proteins CD4 untersucht. Der Wildtyp des SeV-F bzw. die F-Chimären wurden mittels eines transienten T7-RNA-Polymerase Vakziniavirus Expressionssystems in CV1-Zellen exprimiert. Für eine erfolgreiche proteinvermittelte Zell-Zell-Fusion war die Co-Expression des Sendaivirus-HN notwendig (mehr dazu im nächsten Abschnitt). Zur Untersuchung der Fusionsaktivität der exprimierten Proteine wurden fluoreszenzmarkierte humane Erythrozyten verwendet. Um die einzelnen Fusionsintermediate die Lipidvermischung und die Bildung kleiner wäßriger Poren aufzulösen, waren die Targetzellen mit dem Membranmarker R18 und mit dem Zytoplasmamarker Calcein markiert.

Alle F-Chimären waren in der Lage, eine Membranfusion (Übergang von R18) zwischen den Zellen zu vermitteln. Die Bildung kleiner wäßriger Poren (Calcein-Übergang) konnten alle Chimären außer dem F44 vermitteln. Da die Fusionsausmaße der F-HA-Chimären nur etwas niedriger waren als bei Fwt, kann man schlußfolgern, daß die Substitution der TM und/oder CT Domäne des SeV-F durch die äquivalente Domäne eines viralen Proteins mit der gleichen Funktion des Influenzavirus-HA, die Fusionsaktivität des SeV-F kaum beeinflußt. Ähnliche Resultate wurden auch in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe erzielt. Schroth-Diez et al., 1998 und Kozerski et al., 2000 fanden, daß die Substitution der TM und/oder CT Domäne des Influenzavirus-HA durch SeV-F-Domänen keinen Einfluß auf die Fusionsaktivität des HA hatte. Die unterschiedlichen HA-F-Chimären waren in der Lage, eine vollständige Membranfusion, d.h. nicht nur Lipidvermischung und Bildung kleiner wäßriger Poren sondern auch eine Vergrößerung der Fusionsporen zu vermitteln. Auch andere Autoren fanden, daß HA-Chimären mit TM und CT Domäne des G-Proteins des Vesikular-Stomatites-Virus, des gC-Glycoproteins des Herpes-Simplex-Virus 1 oder des Hüllproteins des Rous-Sarkoma-Virus gleiche biologische Funktionen wie das Wildtyp des HA zeigten (Roth et al., 1986; Dong et al., 1992) .

Im Falle der F-Chimären mit der TM Domäne eines nichtviralen und nichtfusiogenen [Seite 97↓] membranständigen Proteins CD4 wurden gleiche Ergebnisse gefunden. Der F4F-Chimäre vermittelte die Lipidvermischung sowie die Öffnung kleiner wäßriger Poren. Diese Daten stimmen mit früheren Untersuchungen an Vertretern anderer Virusfamilie überein (Melikyan et al., 1999; Kozerski et al., 2000) . Die Substitution der TM Domäne des HA durch die aquivalente Domäne des CD4 (Kozerski et al., 2000) bzw. eines anderen nichtviralen Membranproteins, Poly-Immunoglobulinrezeptor des Kaninchens, hatte keinen Einfluß auf die Fusionaktivität des HA (Melikyan et al., 1999). Obwohl die TM Domäne des SeV-F innerhalb der Paramyxovirusgattung hoch konserviert ist (siehe dazu Schroth-Diez et al., 2000 ), konnte keine nachweisbare Beeinflußung der biologische Funktion des SeV-F durch die Substitution dieser Domäne durch die TM Domäne anderer membranständigen Proteine nicht gefunden werden. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt ist, daß die Eigenschaften der TM Domänen, wie z.B. die Hydrophobizität oder die Länge, aufgrund ihrer Funktion als Proteinanker sehr ähnlich sind. Die durchgehenden TM Domänen unterschiedlicher Proteine sind mehr oder weniger hydrophob, und müssen eine bestimmte Mindestlänge haben, um ein Lipidbilayer durchspannen zu können. Eine Verkürzung der TM Domäne hingegen beeinflußt die Funktion eines Fusionsproteins (Armstrong et al., 2000) . Es konnte festgestellt werden, daß die TM Domäne des Influenza-HA eine Mindestslänge von 17 AS haben muß, damit das HA eine vollständige Fusion vermitteln kann. Falls die TM Domäne auf 15 AS oder weniger verkürzt wurde, konnte nur eine Hemifusion beobachtet werden (Armstrong et al., 2000) .

Nur bei der Chimäre F44, deren TM und CT Domäne durch die äquivalenten Domänen des CD4 ersetzt sind, wurde trotz einer Lipidvermischung (Übergang von R18) keine Bildung kleiner wäßriger Poren (Übergang von Calcein-Molekülen) gefunden. Der Übergang der Membranmarker deutet darauf hin, daß die TM und CT Domänen des CD4 von SeV-F toleriert wird und zumindest eine Strukturumwandlung des Proteins stattgefunden hat. Es ist jedoch unklar, ob die Hemifusion auf die Wechselwirkung der TM und CT Domänen während der Membranfusion oder allein auf die Substitution der CT Domäne zurückzuführen ist. Um diese Frage zu klären, müßte eine F-Chimäre mit der CT Domäne des CD4 hergestellt und überprüft werden. Allerdings ist bekannt, daß eine Modifikation der CT Domäne des F-Proteins bei Paramyxoviren die späten Fusionsschritte beeinflußt. Die Verkürzung der CT Sequenz des F-Proteins führte bei SV 5 und NDV zur Inhibierung der Erweiterung der Fusionsporen bzw. der Synzytiumformation (Bagai und Lamb, 1996; Dutch und Lamb, 2001; Sergel und Morrison, 1995) . Auch wenn die CT Domäne des CD4 kürzer als die [Seite 98↓] entsprechende SeV-F-Domäne ist, trifft diese Feststellung auf die F44-Chimäre nicht zu, denn die FFH-Chimäre zeigte die gleiche Fusionsaktivität wie das Fwt, obwohl die CT Domäne des HA fast vierfach kürzer als die vom SeV-F ist.

In früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, daß die HA-Chimäre mit TM und CT Domänen des CD4 (HA-CD4-CD4) zwar die Porenbildung, aber nicht die Porenerweiterung induzieren kann (Kozerski et al., 2000) . Die HA-Chimäre mit der CD4-Zytoplasmadomäne (HA-HA-CD4) kann ebenso die Lipidvermischung und die Öffnung kleiner wäßriger Poren vermitteln, aber nicht die Erweiterung der Fusionspore (Kozerski et al., 2000) . Die Autoren führten diesen Effekt auf die Hydrophobizität der Aminosäuresequenz der CD4-CT-Domäne zurück. Die Aminosäuresequenz der CD4-CT-Domäne, die unmittelbar der TM Domäne folgt, ist stark hydrophil (Abb. 5.5.1). Im Gegensatz dazu sind die entsprechenden Sequenzen der meisten viralen Fusionsproteinen stark hydrophob (Abb. 5.5.1). Basierend auf dem „elastic-coupling“ Model für HA (Melikyan et al., 1995) wurde postuliert, daß eine Verringerung der Hydrophobizität das teilweise Eintauchen der CT Domäne in die Membran erschwert. Dieses Eintauchen erfolgt während der Verschiebung des HA von der vertikalen zur Schräglage und eine geringe Hydrophobizität könnte diese Positionsverschiebung der TM Domäne des HA verhindern. Dies würde zur Unterbindung einer vollständigen Fusion führen (Kozerski et al., 2000) . Diese Hypothese könnte auch auf die hier untersuchte Chimäre F44 zutreffen.

Es ist jedoch hervorzuheben, daß die F44-vermittelte Fusion in einem früheren Schritt, der Bildung kleiner wäßriger Poren, eingefroren war. Es besteht die Möglichkeit, daß dieser Effekt auf der Wechselwirkung zwischen SeV-F und SeV-HN, die im Unterschied zur HA-vermittelten Fusion für eine SeV-F-vermittelte Zell-Zell-Fusion notwendig ist, basiert. Tsurudome und Mitarbeiter konnten feststellen, daß das F-Protein des Simianvirus 41, dessen HR1-Sequenz (HRC) und TM/CT-Domänen substituiert sind, unterschiedlich starke Fusionsaktivität in Anwesenheit von homo- bzw. heterotypischen HN aufweist (Tsurudome et al., 1998) . Es wird vermutet, daß eine spezifische Interaktion der F-CT-Domäne der Paramyxoviren mit HN eine essentielle Rolle bei der Fusion spielt (Tsurudome et al., 1998; Ito et al., 2000) . Es ist aber immer noch unklar, wie dieser Mechanismus funktioniert.


[Seite 99↓]

Abb. 5.5.1Hydrophobizitätsplots der zytoplasmatischen Domänen des Influenza-A-Virus-HA, des Sendavirus-F und des CD4-Proteins. Mit freundlicher Genehmigung von Ch. Kozerski.

Um eine endgültige Aussage über die Wirkungsweise der F44-Chimäre zu machen, müßte, wie schon erwähnt, die Fusionsaktivität der F-Chimäre mit der CD4-CT-Domäne untersucht werden. Es muß noch geklärt werden, inwieweit die Co-Expression von HN die Oberflächenexpression von Fwt und dessen Chimären beeinflußt. Aufgrund der fehlenden Antikörper wurden diese Untersuchungen noch nicht durchgeführt. Aus dem unterschiedlich starken Ausmaß der Bindung von Targetzellen ist jedoch ersichtlich, daß die Oberflächendichte des HN-Proteins in den unterschiedlichen Expressionsansätzen entweder mit Fwt oder den einzelnen F-Chimären nicht gleich war. Demzufolge ist es möglich, daß die Oberflächenexpression des Fwt bzw. der F-Chimären durch die Co-Expression von HN [Seite 100↓] beeinflußt wird.

Die vorliegenden Ergebnisse bilden eine Grundlage für weiterführende Untersuchungen der F-vermittelten Zell-Zell-Fusion, wie z.B. Erweiterung der Fusionspore und Ermittlung der Porengröße unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem Dextran mit unterschiedlichen Molekulargewichten.

5.6 Die Funktion der Hämagglutinin-Neuraminidase bei der F-proteinvermittelten Membranfusion

Eine der interessanten Fragestellungen im Hinblick auf Paramyxoviren ist, welche Rolle das HN bei der Membranfusion spielt. Die Antwort auf diese Frage könnte auch Hinweise auf den Trigger und den Mechanismus der Fusion von Paramyxoviren mit der Targetmembran geben.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß das HN für die SeV-F-vermittelte Fusion nicht notwendig ist, wenn Rezeptoren oder Agenzien für eine Bindung vorhanden sind. Virosomen mit dem SeV-F-Protein konnten in Abwesenheit von HN mit HepG2-Zellen fusionieren. Da das SeV-F Kohlenhydrateinheiten mit endständiger Galaktose besitzt, wird es vom Asialoglykoproteinrezeptor der HepG2-Zelle erkannt und gebunden (Yoshima et al.; 1981, Markwell et al., 1985) . Das isolierte SeV-F war auch in der Lage, Hämolyse hervorzurufen, wenn in der Virosomen-Erythrozyten-Suspension WGA vorhanden war. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Untersuchungen am isolierten SeV-F oder an SeV-Mutanten ohne HN überein (Tomasi und Loyter, 1981; Markwell et al., 1985; Bagai et al., 1993 und Leyrer et al., 1998) .

Für die SeV-F-vermittelte Zell-Zell-Fusion war jedoch die Co-Expression von HN notwendig. Weiterhin konnte festgestellt werden, daß die maximale Fusion erreicht wird, wenn die CV1-Zellen mit cDNA von Fwt und HN in einem Verhältnis von 1:2 (w/w) transfiziert werden. Dies zeigt, daß für die F-vermittelte Fusion nicht nur das Vorhandensein der homotypischen F und HN notwendig ist, sondern auch eine bestimmte Stöchiometrie zwischen den Proteinen eingehalten werden muß. Es ist bekannt, daß das Fusionsprotein nicht [Seite 101↓] nur des Sendaivirus sondern auch anderer Paramyxoviren wie HPIV2, HPIV3, NDV, SV41 und BPIV3 für eine Zell-Zell-Fusion die Co-Expression der homotypischen HN benötigen (Hu et al., 1992; Ebata et al., 1991; Tsurudome et al., 1995; Moscona und Peluso, 1991; Sakai und Shibuta, 1989) . Eine Ausnahme bilden SV5, Stamm W3A, und Measlesvirus. Bei diesen Viren ist die Expression des F-Proteins ausreichend für eine Zell-Zell-Fusion (Horvath et al., 1992; Alkhatib et al., 1990) . Der Mechanismus der Wechselwirkung zwischen F und HN während der Fusion ist dabei unklar. Man nimmt an, daß eine Strukturänderung des HN nach der Bindung an Zellrezeptoren stattfindet und dies zur einen Wechselwirkung mit dem F-Protein führt. Diese Wechselwirkung induziert wiederum eine Konformationsumwandlung des F-Proteins und damit die Membranfusion (Dallocchio et al., 1994; Stone-Hulslander und Morrison, 1997; Hu et al., 1992) .

Eine andere Hypothese besagt, daß das HN nur für die Akkumulation von F-Proteinen an der Kontaktseite mit der Targetmembran verantwortlich ist (Bagai et al., 1993) . Bei Sendaiviren wurde eine direkte Korrelation zwischen der lateralen Beweglichkeit der Membranproteine sowie deren Ansammlung an der Zell-Zell-Kontaktseite mit der Fähigkeit der Proteine, eine Fusion zu induzieren, gefunden (Henis et al., 1989; Aroeti und Henis, 1991). In einem nativen Virus sind die Membranproteine sehr dicht gepackt, und auch in den SeV-F-Virosomen stehen die Proteine eng aneinander. Im Gegensatz dazu ist die Dichte der exprimierten F-Proteine geringer als bei Viren oder Virosomen. Ein anderes Argument für die letzt genannte Funktion des HN liefert die Tatsache, daß SeV-F in Abwesenheit von HN eine geringere Fusionsaktivität zeigt. Sowohl in der vorliegenden Arbeit als auch in früheren Untersuchungen wurde eine verringerte Hämolyse- und Fusionsaktivität des isolierten SeV-F festgestellt (Tomasi und Loyter, 1981; Bagai et al., 1993) . Wenn jedoch HN in den F-Virosomen ebenfalls rekonstituiert wurde, war die Anfangsgeschwindigkeit der Fusion der Virosomen mit HepG2-Zellen um das Zwei- bis Dreifache höher (Bagai et al., 1993) . Die F-HN-Virosomen induzierten auch eine höhere Hämolyse als die F-Virosomen (Bagai et al., 1993) . Auch im Falle des exprimierten SV5-F, das ohne HN eine Zellfusion induzieren kann, wurde eine Erhöhung der Anfangsgeschwindigkeit der Fusion durch die Co-Expression von HN festgestellt (Bagai und Lamb, 1997; Dutch et al., 1998) . Es ist möglich, daß die Konformationsumwandlung des F-Proteins durch eine Wechselwirkung der Proteine untereinander und/oder mit einem Rezeptor bzw. mit der Targetmembran ausgelöst wird. Dabei könnte das HN-Protein, das auch die Bindung zum Target vermittelt, eine schnellere [Seite 102↓] und effektivere Akkumulation des F-Proteins an der Fusionsstelle sowie eine kürzere Distanz zur Targetmembran und so eine schnellere Strukturumwandlung des F-Proteins bewirken.

Der genauere Mechnismus der Wechselwirkung zwischen HN- und F-Proteinen ist unbekannt. Es gibt Hinweise, daß für die fusionfördernde Wechselwirkung die globulären Kopfdomänen des HN- und des F-Proteins eine wichtige Rolle spielen (Bousse et al., 1995; Tsurudome et al., 1995; Tanabayashi und Compans, 1996) . Die 3D-Struktur der Kopfdomäne des NDV-HN-Proteins wurde röntgenkristallographisch ermittelt (Crennell et al., 2000) . Diese Domäne des dimeren HN-Proteins stellt eine hantelförmige Struktur, die parallel zur Membran gerichtet ist, dar. Die Länge des Proteinstiels, der die Kopfdomäne mit der Transmembrandomäne verbindet ist jedoch nicht bekannt, weil die 123 AS am N-terminalen Ende des kristallisierten Proteinfragments fehlten. Wenn man jedoch in Betracht zieht, daß die Transmembrandomäne den AS von 27 bis 48 entsprechen (SWISS-PROT Datenbank: P12554) und die Kopfdomäne ab AS 124 beginnt (Crennell et al., 2000) , ist die Stielregion ca. 75 AS lang und würde eine Länge von etwa 130 Å haben1 . Mit dieser Stiellänge würde sich die Kopfdomäne im gleichen Abstand von der Virushülle befinden, wie die Kopfdomäne des F-Proteins. Auch wenn der Stiel etwas kürzer ist, würde aufgrund der großen Kopfdomäne des HN-Proteins die Wechselwirkung zwischen den Kopfdomänen der beiden Proteine nicht unterbrochen sein. Damit unterstützt diese Berechnung die Befunde, daß eine solche Wechselwirkung zur Förderung der F-proteinvermittelten Fusion beiträgt (Bousse et al., 1995; Tsurudome et al., 1995; Tanabayashi und Compans, 1996) . Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß eine Veränderung des HN-Protein-Stiels zur Inhibierung der Fusion führt. Nach dem die Stielregion des NDV-HN-Proteins um 9 AS verkürzt wurde, wies das HN-Protein keine fusionförderende Aktivität auf, obwohl es die Bindung an Rezeptoren vermitteln konnte (Sergel et al., 1993) . Wenn man das Ausmaß des globulären Kopfs des HN-Proteins bedenkt, ist es schwer vorzustellen, wie der Stiel mit dem F-Protein wechselwirken kann. Eine andere Erklärung für diese Befunde könnte sein, daß sich durch die Verkürzung des Stiels die Position der Kopfdomäne so verändert wird, daß die für die Fusionförderung notwendige Wechselwirkung zwischen den Proteinen unterbrochen wird. Außerdem gibt es Vermutungen, daß eine Wechselwirkung zwischen den TM und/oder CT Domänen der F- und [Seite 103↓] HN-Proteine existiert und sie nicht nur den Transport der Proteine, sondern auch die Fusion beeinflußt (Tong und Compans, 1999; Stone-Hulslander und Morrison, 1997; Bousse et al., 1994) . Wenn solche Wechselwirkung für die Förderung der Fusion notwendig ist, implizieren unsere Ergebnisse, daß zumindest solche Wechselwirkung in den ersten Schritten der Fusion zwischen den TM und/oder CT Domänen der F- und HN-Proteine durch die von uns vorgenommene Substitution dieser Domänen des F-Proteins nicht beeinflußt worden ist. Alle verwendeten F-Protein-Chimären waren nach einer Co-Expression mit HN-Protein in der Lage, wenigstens eine Membranverschmelzung (aufgelöst durch R18-Übergang) zu vermitteln. Weitere Untersuchungen z. B. mit den SeV-F-Chimären und heterotypischen HN-Proteinen anderer Paramyxoviren könnten Aussagen über den Mechanismus der Wechselwirkung zwischen den F- und HN-Proteinen geben.

Die Frage, ob zur Induktion der F-proteinvermittelten Membranfusion das HN-Protein notwendig ist, bleibt noch ungeklärt. Wahrscheinlich löst die Wechselwirkung des HN-Proteins mit dem F-Protein, die durch die Bindung des HN an zelluläre Rezeptoren und damit verbundenen Strukturänderung des HN-Proteins vermittelt wird, in vivo eine Konformationsumwandlung des F-Proteins aus. Diese Umwandlung der F-Proteinstruktur beinhaltet vermutlich eine Umorientierung der F2-Untereinheit und eine Abschwächung der Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten F1 und F2, und dies ermöglicht wiederum eine Strukturänderung der F1-Untereinheit. Die Reorganisation der F2-Untereinheit muß nicht durch die Wechselwirkung mit dem HN-Protein, sondern kann z.B. durch eine Wechselwirkung mit spezifischen zellulären Rezeptoren oder mit der Targetmembran induziert werden. Es konnte festgestellt werden, daß nach einer Punktmutation in der Untereinheit F2 des F-Protein des SV5, Stamm WR, die Notwendigkeit des HN-Proteins zur Synzytiumbildung aufgehoben wurde, obwohl dieser Stamm des SV5 im Gegensatz zum Stamm W3A die Anwesenheit des HN-Proteins zur Induktion der Fusion benötigt (Ito et al., 1997) . Daher ist das HN-Protein für das Auslösen der Strukturumwandlung des F-Proteins nicht notwendig. Das HN-Protein spielt jedoch eine Rolle bei der Membranfusion, nämlich die Förderung der Fusion durch die Akkumulierung der F-Proteine an der Kontaktstelle mit dem Target. Diese Funktion des HN-Proteins ist in bestimmten Untersuchungssystemen wie bei F-exprimierenden Zellen erforderlich.


Fußnoten und Endnoten

1  Nach einer Sekundärstruktur-Vorhersage mittels PREDATOR (http://www.embl-heidelberg.de/predator/ predator_info.html) hat der Stiel eine Disposition zur helikalen Struktur. Unter Annahme, daß der Stiel als eine Helix organisiert und 1.7 Å/AS ist, konnte eine maximale Länge von ca. 130 Å berechnet werden.



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
08.12.2003