Untersuchungen zur F-proteinvermittelten Fusion von Paramyxoviren

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biophysik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biophysikerin Bolormaa Baljinnyam

geb. am 24.06.1971 in Ulaanbaatar, Mongolei

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Klaus Arnoldt
3. Prof. Dr. Michael F.G. Schmidt

Tag der mündlichen Prüfung: 25.03.2003

Zusammenfassung

Untersuchungen zur F-proteinvermittelten Fusion von Paramyxoviren

122 Seiten, 29 Abbildungen und 6 Tabellen

Bolormaa Baljinnyam, 2002, Berlin, Humboldt-Universitat zu Berlin, Dissertation

Die für die Vermehrung der Paramyxoviren notwendige Freisetzung des Virusgenoms in die Wirtszelle findet nach einer Verschmelzung der Virushülle mit der Zellmembran statt. Die Membranfusion wird durch eine Konformationsänderung des membranständigen Fusionsproteins (F-Protein) der Paramyxoviren vermittelt. Der Auslöser der Strukturumwandlung des F-Proteins ist bislang unbekannt. Man nimmt an, daß eine Wechselwirkung mit dem zweiten membranständigen Protein der Hämagglutinin-Neuraminidase (HN-Protein) die Strukturumwandlung des F-Proteins induziert. Das F-Protein kann jedoch auch in Abwesenheit des HN-Proteins eine Membranfusion vermitteln. Für das Verständnis des Mechanismus der F-proteinvermittelten Fusion ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des F-Proteins notwendig.

In der vorliegenden Arbeit wurden die F-Proteine der Paramyxoviren, Sendaivirus und Simianvirus 5, in fusionskompetenter Form isoliert und in kleine Lipidvesikel rekonstituiert, um deren Struktur mittels Kryoelektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse aufzuklären. Die 3D-Struktur des Sendaivirus-F-Proteins konnte mit einer Auflösung von 16 Å aufgeklärt werden.

Um geeignete Bedingungen herauszufinden, die das Auslösen der Konformationsänderung der F-Proteine bzw. das "Einfangen" von Strukturintermediaten während der Fusion ermöglichen, wurde das Fusionsverhalten von Sendaivirus und Simianvirus 5 bei unterschiedlichen Temperatur- und pH-Werten sowie in Anwesenheit von Lysolipiden mittels Fluoreszenzdequenchingassays untersucht. Ein signifikanter Anstieg der Fusionsaktivität der untersuchten Viren konnte durch eine Erhöhung der Temperatur erreicht werden. Mittels ESR-Spektroskopie unter Einsatz von spinmarkierten Lysolipiden konnte gezeigt werden, daß Lysolipide die proteinvermittelte Fusion von Hüllviren in einem späten lipidabhängigen Schritt hemmen. Diese Untersuchungen bilden damit eine Grundlage zur Aufklärung der 3D-Struktur des F-Proteins im fusionsaktiven Zustand.

Desweiteren wurde die Rolle der transmembranalen und zytoplasmatischen Domäne des F-Proteins bei der Membranfusion und der Wechselwirkung mit dem HN-Protein mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Befunde der 3D-Strukturaufklärung und der fluoreszenzmikroskopischen Studien wurden unter anderem in Hinblick auf die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen den F- und HN-Proteinen für die Fusion diskutiert.

Eigene Schlagworte: Paramyxovirus, Sendaivirus, 3D-Struktur, F-Protein, HN-Protein, Membranfusion, Lysolipide, Fusionsintermediat, Lipidvermischung, Fusionspore, zytoplasmatische Domäne

Abstract

Paramyxoviruses infect their host cells by fusion of the viral envelope with the cell membrane. The membrane fusion is mediated by a confomational change of a viral envelope glycoprotein called the fusion (F) protein. The trigger of the F protein conformational change is still unknown. It is suggested, that an interaction of the F protein with the second envelope glycoprotein hemagglutinin-neuraminase (HN) induces its conformational change. However the F protein can mediate membrane fusion in absense of HN. The knowledge of the three dimensional structure of the F protein is reqiured to understand the F mediated membrane fusion.

In the present work the fusion competent form of the fusion proteins of the paramyxoviruses Sendai virus and Simian virus 5 were isolated and incorporated each of them into small lipid vesicles. The 3D-structure of the entire ectodomain of the Sendai virus F protein has been determined in fusion potential conformation by cryo electron microscopy of single moleculesand 3D-reconstruction at a resolution of ~16 Å.

To detect usefull conditions for triggering the conformational change of F, the fusion of Sendai virus and Simian virus 5 have been studied at different temperature and pH, respectively, using a fluorescence dequenching assay. A significant increase of virus fusion activity has been found due to temperature enhancement. Using ESR-spectroscopy and spin-labeled lysolipids it has been shown that lysolipids inhibit the protein mediated fusion of enveloped viruses at a late lipid-dependent intermediate. Thus lysolipids are capable to freeze a conformational intermediate of the F protein during fusion.

Furthermore the role of the transmembrane and the cytoplasmic domain of the Sendai virus F protein for membrane fusion was investigated using fluorescence microscopy. The results of the fluorescence microscopy study and the detection of the 3D-structure have been discussed in view of the relevance of F-HN-interaction for membrane fusion.

Keywords: Paramyxovirus, Simian virus 5, protein, structure, F protein, membrane fusion, fusion intermediate, fusion pore, domain, domain

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einführung
  • 1.1 Aufbau und Vermehrung der Myxoviren
  • 1.2 Spikeproteine des Influenzavirus
  • 1.3  Spikeproteine des Sendaivirus und Simianvirus 5
  • 1.4 Die Membranfusion
    • 1.4.1 Die HA-vermittelte Fusion
    • 1.4.2  Die F-proteinvermittelte Fusion
  • 1.5 Inhibierender Einfluß von Lysolipiden auf die Membranfusion
  • 1.6 Die Rolle der transmembranalen und intraviralen Domäne des Fusionsproteins bei der Membranfusion
• 2  Zielstellung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Chemikalien und Lösungen
  • 3.2  Biologisches Material
  • 3.3 Anzucht und Reinigung der Viren
    • 3.3.1 Vermehrung von Sendai- und Influenzaviren
    • 3.3.2  Vermehrung von Simianvirus 5
    • 3.3.3 Virusreinigung
  • 3.4 Isolierung und Identifizierung der viralen Fusionsproteine
    • 3.4.1 Isolierung des Sendaivirus-F-Proteins
    • 3.4.2 Isolierung der Glykoproteine des Simianvirus 5
    • 3.4.3 Bestimmung der Tritonmenge
    • 3.4.4 SDS-PAGE
    • 3.4.5 Chemisches Crosslinking
    • 3.4.6 Hämolysetest
    • 3.4.7 FDQ-Assay mit Sendaivirus-F-Virosomen
      • 3.4.7.1 Kultur der HepG2-Zellen
      • 3.4.7.2 Fusionsmessung
  • 3.5 Fluoreszenzspektroskopische Messungen an Paramyxoviren
    • 3.5.1 Markierung von Viren mit R18
    • 3.5.2 Herstellung von offenen Erythrozyten-Ghosts
    • 3.5.3 Fusionsassay und Datenanalyse
  • 3.6 Überprüfung des Lysolipideinflusses auf die Fusion von Myxoviren sowie die Untersuchung der Wechselwirkung von Lysolipiden mit Influenzaviren
    • 3.6.1 Untersuchung der Sendaivirus-Ghost-Fusion in Anwesenheit von Lysolipiden
    • 3.6.2 Fusionsanalyse von Influenzaviren mit Ghosts in Anwesenheit von Lysolipiden
    • 3.6.3 Präparation von Bromelain-behandelten Influenzaviren und Bromelain-gespaltener HA-Ektodomäne
    • 3.6.4 Bindung von bis-ANS an BHA und Influenzaviren
    • 3.6.5 Herstellung von SUVs
    • 3.6.6  ESR-Messungen
  • 3.7  Fluoreszenzmikroskopische Studien an exprimiertem Sendaivirus-F-Protein und dessen Chimären
    • 3.7.1 Das pTM1/vTF7-3 Expressionssystem
      • 3.7.1.1 Zu exprimierende Proteine und deren Plasmide
      • 3.7.1.2 Transformation der Bakterienzellen
      • 3.7.1.3 Anlegen einer Glycerolkultur
      • 3.7.1.4 Plasmidzucht und –reinigung
      • 3.7.1.5 Transfektion von CV1-Zellen
    • 3.7.2  Untersuchung der Zell-Zell-Fusion
      • 3.7.2.1 Markierung von Erythrozyten mit R18 und Calcein-AM
      • 3.7.2.2 Doppelmarkierung der HepG2-Zellen
      • 3.7.2.3  Vorbereitung der Expressionszellen und Bindung der Targetzellen
      • 3.7.2.4 Fluoreszenzmikroskopie
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Isolierung des Sendaivirus-F-Proteins und Aufklärung seiner 3D-Struktur
    • 4.1.1 Isolierung und Charakterisierung des SeV-F-Proteins
    • 4.1.2  Überprüfung der Fusionsaktivität des isolierten SeV-F-Proteins
    • 4.1.3 Optimierung der SeV-F-Virosomen für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur
    • 4.1.4  Aufklärung der 3D-Struktur des SeV-F-Proteins
  • 4.2 Isolierung und Identifizierung des Fusionsproteins des Simianvirus 5
  • 4.3  Charakterisierung der Fusionsaktivität von Sendaivirus und Simianvirus 5
  • 4.4 Einfluß von Lysolipiden auf die Fusion von Sendaiviren
  • 4.5 Wechselwirkung von Lysolipiden mit Influenzavirus
    • 4.5.1 Inhibierung der Influenzavirus-Fusion durch SL-LPC
    • 4.5.2 Wechselwirkung von SL-LPC mit der HA-Ektodomäne
    • 4.5.3 Wechselwirkung von SL-LPC mit Influenzaviren
  • 4.6  Fluoreszenzmikroskopische Studien am exprimierten Sendaivirus-F-Protein und dessen Chimären
    • 4.6.1 Notwendigkeit der Co-Expression von HN
    • 4.6.2 Einfluß der Substitution der F-Domänen auf die Zell-Zell-Fusion
    • 4.6.3 Untersuchung der Vakziniavirus-infizierten Zellen
• 5  Diskussion
  • 5.1 Die 3D-Struktur des Sendaivirus-Fusionsproteins
  • 5.2  Das Fusionsprotein des Simianvirus 5
  • 5.3  pH- und Temperaturabhängigkeit der Fusionsaktivität von Paramyxoviren
  • 5.4 Wechselwirkung von LPC mit Myxoviren
    • 5.4.1 Einfluß von LPC auf die Fusion von Sendai- und Influenzaviren
    • 5.4.2 LPC wechselwirkt mit der Virushülle und nicht mit der HA-Ektodomäne
  • 5.5  Die Rolle der transmembranalen und zytoplasmatischen Domäne des Sendaivirus-F bei der Membranfusion
  • 5.6 Die Funktion der Hämagglutinin-Neuraminidase bei der F-proteinvermittelten Membranfusion
• Abkürzungen
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Publikationen
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 1. 2 :Charakterisierung der Proteine des Sendaivirus, Stamm Z (SeV) und Simianvirus 5, Stamm W3 (SV5). Die Angaben zum Molekulargewicht wurden aus der Datenbank Swiss-Prot entnommen. (-) - das Protein ist beim entsprechen Virus nicht vorhanden.
• Tab. 3.1:Zusammensetzung und Bezeichnung der untersuchten Proteine. Fwt (F-Wildtyp) entspricht dem Fusionsprotein eines nativen Sendaivirus (SeV-F). Bei den Chimeren FFH, FHF, FHH, F4F und F44 wurden transmembranale und/oder zytoplasmatische Domänen durch die äquivalenten Domänen des Influenzavirus A Hämagglutinins (HA) oder des membranständigen Proteins CD4 ersetzt.
• Tab. 4.1Beeinflussung der Virosomenform durch Zusatz von Lipiden
• Tab. 4.2:Solubilisierung der Virushülle und Isolierung der Spikeproteine des SV5 mittels unterschiedlichen Detergenzien in unterschiedlicher Konzentration. Die erste Zentrifugation wurde nach Zugabe der Detergenzien zu den Viren und nach einer 30minütigen Inkubation bei RT durchgeführt. Die zweite Zentrifugation wurde durchgeführt, nachdem der Überstand aus der ersten Zentrifugation gegen ein Puffer mit niedriger Salzkonzentration dialysiert wurde. (- - nicht erfolgreich; + - erfolgreich)
• Tab. 4.3:Qualitativer Vergleich des Ausmaßes der Bindung von Targetzellen (RBC) an CV1-Zellen und des durch die Fusion bedingten R18- bzw. Calcein-Übergangs auf CV1-Zellen, die F-Protein bzw. Chimären exprimieren. (+++ - viele Zellen, ++ - einige Zellen, + - einzelne Zellen, - - keine Zellen)

Bilder

• Abb. 1 .1.1:Schematische Darstellung des Vermehrungszyklus von Ortho- und Paramyxoviren. Weitere Details siehe Text. Mit freundlicher Genehmigung von K.Ludwig.
• Abb. 1.3.1:Schematische Darstellung der Monomere des SeV-F und des SV5-F. FP: Fusionspeptid, HRN: "heptad repeat" N-terminal, HRC: "heptad repeat" C-terminal, TM: transmembranale Domäne, -S-S-: Disulfidbrücke zwischen F1 und F2. Die Numerierung entspricht der Aminosäuresequenz der Vorläuferproteine.
• Abb. 1.4.1: Schritte der HA-vermittelten Membranfusion. Zur besseren Übersicht wurden nur zwei Monomere gezeigt. Weitere Details siehe Text. Mit freundlicher Genehmigung von A. Herrmann.
• Abb. 1.4.2: Modelle für die SeV-F-vermittelte Membranfusion. (a-c) nach Ben-Efraim et al., 1999. Die Wechselwirkung mit der Targetmembran bzw. mit zellulären Rezeptoren induziert eine Strukturänderung des F-Proteins (a). Dabei taucht das N-terminale Fusionspeptid in die Targetmembran ein, und aus HRN und HRC entsteht die antiparallele "coiled-coil"-Struktur (b). Durch die Wechselwirkung mit dem Lipidbilayer öffnet sich die "coiled-coil"-Struktur (c). (a, d-f) basiert auf der Annahme, daß außer dem N-terminalen Fusionspeptid auch ein internes Fusionspeptid existiert. Nach dem Eintauchen des N-terminalen Fusionspeptides in die Targetmembran und der Bildung der "coiled-coil"-Struktur (d) interagiert das interne Fusionspeptid mit der Targetmembran und induziert die Öffnung der "coiled-coil"-Struktur (f). Oder das N-terminale Fusionspeptid taucht in die Virushülle ein, und den ersten Kontakt mit der Targetmembran stellt das interne Fusionspeptid her (e). Die Abbildung wurde aus Peisajovich et al., 2000 entnommen.
• Abb. 4.1.1SDS-PAGE-Bilder des Sendaivirus (SeV) und der Triton-Extraktion der Virushülle ohne (Env) bzw. mit Vorbehandlung der Viren mit DTT (F) unter nicht reduzierenden (A) und reduzierenden (B) Bedingungen (siehe "Material und Methoden" und Text). Die 1. Bahn der Gele sind Markerproteine (MM) mit bekanntem Molekulargewicht (MW). Die Proteinbanden wurden anhand des Molekulargewichts identifiziert und mit den jeweiligen Proteinnamen gekennzeichnet. Das 10%ige Acrylamid-Gel wurde mittels Coomassieblau gefärbt.
• Abb. 4.1.2Analyse des isolierten F-Proteins mittels 7.5 %igen Acrylamidgels unter nicht reduzierenden Bedingungen. (A) Zur Untersuchung der Oligomerisation wurde das SeV-F unterschiedlich lange mit 0.3 mM bifunktionalen Crosslinker DSP bei 4°C inkubiert. Die Monomer-, Dimer- und Trimer-Banden des F sind jeweils mit (*), (**) bzw. (***) gekennzeichnet. Die Endkonzentration von SDS in den Proben betrug 1 %. (B) Die F-Proteinbanden nach Zugabe von unterschiedlichen SDS-Mengen. Die Gele wurden mit Coomassieblau gefärbt. An der linken Seite der Gele sind die Molekulargewichtsmarker dargestellt.
• Abb. 4.1.3Fusion der rekonstituierten SeV-F-Virosomen (SeV-F) oder des Sendaivirus (SeV) mit HepG2-Zellen bei 37°C und pH 7.4. Rh-PE markierte Virosomen oder R18 markierte Viren wurden an HepG2-Zellen bei 4°C für 30 min gebunden. Die Fusion wurde durch Überführung der jeweiligen Suspension in vorgewärmten PBS+ (37°C) induziert. Es wurde keine Fusion beobachtet, wenn Viren (Daten nicht gezeigt) oder Virosomen (SeV-F, Kontrolle) 20 min bei 56°C vorinkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensität der Marker in Anwesenheit von 0.5 % Triton wurde als 100 % Dequenching gesetzt. Für weitere Details und zur Berechnung der FDQ siehe „Material und Methoden“.
• Abb. 4.1.4Hämolyseaktivität von Sendaiviren (●) und SeV-F-Virosomen (○). Die Viren bzw. Virosomen wurden an Erythrozyten bei 4°C gebunden und unterschiedlich lange bei 37°C inkubiert (siehe „Material und Methoden“). Die dargestellten Werte sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Messungen. Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung.
• Abb. 4.1.5Elektronenmikroskopische Aufnahme des isolierten SeV-F nach der Rekonstitution mit 131 µM Ei-PC/55.6 µM Rh-PE. Der Balken entspricht 50 nm.
• Abb. 4.1.63D-Struktur des Sendaivirus-F. (A) Ansicht von oben. (B) Ansicht von der Seite. Die zur Virushülle proximale Seite ist das untere Ende des Stiels. (C) Ansicht von oben auf einen horizontalen Schnitt (die Schnittebene ist durch die rote horizontale Linie im Bild B gekennzeichnet.) (D) Ansicht auf das axial angeschnittene Protein aus dem Bild B (die Schnittebene ist durch die roten vertikalen Linien markiert (45°)). Die verschiedenen Strukturdetails sind angegeben, weitere Details sind im Text erläutert. Mit freundlicher Genehmigung von K. Ludwig.
• Abb. 4.2.1SDS-PAGE des SV5 und der einzelnen Produkte während der Isolierung des F-Proteins unter reduzierenden Bedingungen: (P1) Pellet nach der ersten Zentrifugation, (P2) Pellet nach der zweiten Zentrifugation, (HN) isoliertes SV5-HN-Protein nach der Elution der Affinitätssäule, (F) isoliertes und aufkonzentriertes SV5-F-Protein. Das 10%ige Acrylamidgel wurde mit Coomassieblau gefärbt. Die Bahnen HN und F wurden zusätzlich einer Silberfärbung unterzogen. Links vom Gel sind die Molekulargewichtsmarker (MM) dargestellt.
• Abb. 4.2.2Hämolyseaktivität des SV5 (●) oder des isolierten SV5-F (○). Nach dem Binden der Viren bzw. F-Virosomen (durch Zugabe von WGA) an Erythrozyten wurden die Proben bei 37°C inkubiert. Nach unterschiedlicher Zeit wurden Alliquots entnommen und die Hämolyse gemessen. Zur Berechnung des prozentualen Anteils der Hämolyse siehe „Material und Methoden“.
• Abb. 4.2.3Elektronenmikroskopische Aufnahme des isolierten SV5-F. Der Balken entspricht 25 nm.
• Abb. 4.3.2 pH-Abhängigkeit des Fusionsausmasses von Sendaivirus (schwarze Balken) oder Simianvirus 5 (graue Balken) mit Ghosts. Die Messungen erfolgten über einen Zeitraum von 1h bei 37°C. Das Fusionsausmaß bei pH 7.4 wurde als Kontrollwert auf 100 % angesetzt. Die dargestellten Werte entsprechen dem jeweiligen Mittelwert, und die Fehlerbalken der Standardabweichung (n≥3).
• Abb. 4.3.3Fusionskinetiken von Sendaivirus (SeV) und Simianvirus 5 (SV5) mit Erythrozytenghosts bei unterschiedlichen Temperaturen und pH 7.4. Zum Zeitpunkt t=0 wurde die Virus-Ghost-Suspension in 2 ml PBS mit entsprechender Temperatur zugegeben. Am Ende jeder Messung wurde 0.5 % Triton zugegeben, um ein maximales FDQ zu erreichen. Bei der Normierung der Kurven wurde dieser Wert als 100 % angesetzt. Weitere Details siehe „Material und Methoden“ und Text.
• Abb. 4.3.4Temperaturabhängigkeit der Fusion von Sendaivirus (schwarze Balken) oder Simianvirus 5 (graue Balken) mit Erythrozytenghosts. Alle Messungen wurden bei pH 7.4 durchgeführt. Das Fusionsausmaß bei 37°C wurde als Kontrollwert auf 100 % angesetzt. Gezeigt ist der Mittelwert, und die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung (n≥3) gezeigt. Weitere Einzelheiten der Messungen siehe Text und Legende zur Abb. 4.1.1.
• Abb. 4.4.1:Fusion von Sendaiviren mit Erythrozyten-Ghosts in Anwesenheit von 17 µM LPC (14:0) bei 37°C und pH 7.4. Die Kontrolle wurde ohne Lysolipidzugabe gemessen. Weitere Details siehe Text und "Material und "Methoden".
• Abb. 4.4.2:Inhibierung der Sendaivirus-Ghost-Fusion durch Zugabe von LPC (14:0). Die Menge der zugegebenen Lysolipide bezieht sich auf endogene Lipide der Ghots und Viren. Die Virus-Ghost-Fusion wurde mittels R18-FDQ-Assay bei 37°C und pH 7.4 gemessen. Das Fusionsausmaß in Abwesenheit von LPC wurde als Kontrollwert auf 100 % angesetzt. Weitere Einzelheiten siehe Text und "Material und Methoden".
• Abb. 4.5.2Einfluß von Lysolipiden mit unterschiedlichen Fettsäurekettenlängen und spinmarkierten LPC (18:0) (SL-LPC) auf die Fusion von Influenzaviren mit Ghosts bei 37°C. Das Fusionsausmaß ohne Zugabe von Lysolipiden wurde auf 100% angesetzt, und die dargestellten Fusionswerte darauf bezogen. Die Lysolipidkonzentration entsprach 10 mol% der endogenen Lipide von Virus und Ghost. Es wurden der Mittelwert und die Standardabweichung (n≥3) angegeben.
• Abb. 4.5.3Erhöhung der Fluoreszenzintensität von bis-ANS in Anwesenheit von intaktem Virus oder BHA bei pH 5.0 und 37°C. BHA (5 µg/ml) oder Influenzavirus (5 µg HA/ml unter Annahme der Verhältnisse 2.5 x 1012 Viruspartikel/mg Virusprotein sowie 500 Trimere/Virion und eines Molekulargewichts des HA von 75-80 kDa) wurde zu 2 ml NaAc-Puffer mit 1 nmol bis-ANS/ml bei pH 7.4 und 37°C zugegeben. Bei t=0 wurde der pH-Wert durch Zugabe von Zitronensäure erniedrigt. Weitere Details siehe „Material und Methoden“.
• Abb. 4.5.4Wechselwirkung von SL-LPC mit BHA. A: das obere (A1) und das mittlere (A2) Spektrum wurden in Anwesenheit von BHA bei pH 7.4 bzw. bei pH 5.0 aufgenommen (molares Verhältnis von BHA-Monomer : SL-LPC = 1:1.5). Das untere Spektrum (A3) entspricht SL-LPC in einer wäßrigen Umgebung (ohne Zugabe von BHA). Die Skala der Spektren A1 und A2 entspricht der zweifachen (pH 7.4) bzw. vierfachen (pH 5.0) des Spektrums A3. B: Das obere und das mittlere Spektrum wurden durch Subtraktion des Spektrums A3 vom Spektrum A1 bzw. A2 mittels ESR Softwares ermittelt. Es entspricht den an BHA gebundenem SL-LPC bei pH 7.4 (B1) bzw. pH 5.0 (B2). Bei saurem pH ist der Anteil der gebundenen SL-LPC (Pfeile) größer als bei neutralem pH. C: Das Spektrum von SL-LPC in Anwesenheit von BSA (molares Verhältnis von BSA:SL-LPC = 1:1.8). Das ESR-Spektrum zeigt eine starke Bindung (Pfeile) der SL-LPC-Analoga. Alle Spektren wurden bei 37°C mit einer Modulationsamplitude von 4 G und einer Scanbreite von 100 G aufgenommen. Der pH-Wert der entsprechenden BHA-Suspension wurden in Anwesenheit von SL-LPC auf 5.0 erniedrigt.
• Abb. 4.5.5Wechselwirkung von SL-LPC mit intaktem (A und B) oder Bromelain-behandeltem Influenzavirus (C und D) bei pH 7.4 (A und C) bzw. pH 5.0 (B und D). Die Gesamtmenge von SL-LPC entspricht 10 mol% der endogenen Lipide in der Virushülle. Das molare Verhältnis von HA-Monomeren zu SL-LPC beträgt 1:5. Pfeile bezeichnen immobilisierte Komponenten. Für weitere Details siehe „Material und Methoden“ und Text. Die Spektren wurden bei 37°C mit einer Modulationsamplitude von 4 G und einer Scanbreite von 100 G aufgenommen.
• Abb. 4.6.1Ausmaß der Bindung der Targetzellen (schwarze Balken) und der Fusion (graue Balken) an CV1-Zellen, die mit unterschiedlichen Mengen an cDNA von SeV-HN und SeV-F transfiziert wurden. Nach der Transfektion der CV1-Zellen wurden fluoreszenzmarkierte Erythrozyten zugegeben und bei 4°C gebunden. Die Zellen wurden bei 37°C inkubiert, um die Fusion zu induzieren. Die Bindung der Targetzellen und die Fusion wurde anhand der Fluoreszenzmarker mittels Fluoreszenzmikroskopie ermittelt. Für weitere Details siehe „Material und Methoden“ und Text. Es wurden die Mittelwerte und die Standardabweichungen dargestellt (n≥3).
• Abb. 4.6.2 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Markerverteilung während der proteinvermittelten Zell-Zell-Fusion. An Fwt-, F4F-, F44-, FFH-, FHF- und FHH-exprimierende CV1-Zellen waren doppelmarkierte (R18 und Calcein) Erythrozyten gebunden und die Fusion wurde nachfolgend durch eine Inkubation bei 37°C ausgelöst. Die Bilder des R18- (1. und 3. Reihe) und Calcein-Übergangs (2. und 4. Reihe) auf die CV1-Zellen wurden bei RT 1 h nach dem Auslösen der Fusion aufgenommen. Für weitere Details siehe "Material und Methoden" und im Text.
• Abb. 5.1.1: Vergleich der 3D-Struktur des NDV-F und des SeV-F. Die obere Reihe zeigt die seitliche Ansicht der Proteine, die untere Reihe die Ansicht von oben. (A) Die Röntgenkristallstruktur des NDV-F mit einer verringerten Auflösung von 16 Å (fliederfarbene Darstellung). (B) Anpassung der Röntgenstruktur des NDV-F an die kryoelektronenmikroskopisch ermittelte 3D-Struktur des SeV-F (blaue Darstellung). (C) Anpassung der SeV-F-Struktur (Netzgitter) an die "low-pass"-gefilterte NDV-F-Struktur (fliederfarbene Darstellung). Weitere Details siehe Text. Mit freundlicher Genehmigung von K. Ludwig.
• Abb. 5.5.1Hydrophobizitätsplots der zytoplasmatischen Domänen des Influenza-A-Virus-HA, des Sendavirus-F und des CD4-Proteins. Mit freundlicher Genehmigung von Ch. Kozerski.