Kapitel I
Einleitung


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1.  ALLGEMEINE EINLEITUNG

1910 berichtete DUKE [19] erstmalig über den blutstillenden Effekt von Bluttransfusionen bei Blutungsleiden, die thrombozytopenisch bedingt waren. Seine frühen Beobachtungen bildeten die Basis für den therapeutischen Einsatz von Thrombozytenkonzentraten.

In den 50er Jahren wurde die Wirksamkeit von Thrombozytentransfusionen an bestrahlten thrombozytopenischen Tieren experimentell gezeigt [18]. Das konnte wenig später bei Patienten mit plättchenbedingten Blutungsleiden bestätigt werden [27, 75].

Ab 1960 standen Thrombozytenhochkonzentrate für thrombozytopenische Patienten zur Verfügung [37].

Seitdem hat die Transfusion von Thrombozyten ständig an Bedeutung zugenommen und ist heute - neben der Transfusion von Erythrozyten - die wichtigste transfusionsmedizinische Maßnahme.

Vor allem die moderne internistisch-onkologische Therapie ist durch den Einsatz von Thrombozytenkonzentraten überhaupt erst möglich geworden.

Dementsprechend ist der Bedarf an Plättchenkonzentraten sprunghaft gestiegen.

Die Herstellung von Thrombozytenkonzentraten aus Vollblut kann grundsätzlich aus plättchenreichem Plasma (PRP-Methode) oder aus buffy coat (BC-Methode) erfolgen. Bei der PRP-Methode [51] wird Blut von randomisierten Spendern bei niedriger Umdrehungszahl zentrifugiert, um plättchenreiches Plasma herzustellen. Dieses wird dann bei hoher Umdrehungszahl zentrifugiert, um die Plättchen zu sedimentieren. Nach einer Ruhephase werden die Plättchen in 50 ml Spenderplasma aufgenommen.

Bei der BC-Methode [51] wird das Blut von randomisierten Spendern bei hoher Umdrehungszahl zentrifugiert, wobei ein zellfreier Plasmaüberstand über den sedimentierten Erythrozyten und dem dazwischenliegenden buffy coat verbleibt. Der buffy coat kann gewonnen werden und wird danach für die Präparation des Thrombozytenkonzentrates einer zweiten, langsamen Zentrifugation unterworfen. Der Nachteil der BC-Methode liegt in einer niedrigeren Plättchenausbeute, die Vorteile in einer höheren Plasmaausbeute sowie einer niedrigeren Erythrozyten- und Leukozyten-kontamination [51].

Die selektive Gewinnung größerer Mengen an Thrombozyten wurde in den 70er Jahren mit der Einführung von Zellseparatoren möglich, wobei zunächst mit manuellen Verfahren gearbeitet wurde.

Heute stehen für die Thrombozytapherese Zellseparatoren zur Verfügung, die mit einem kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Separationsverfahren arbeiten.


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Beide Trenntechniken basieren auf der Separation von Blutkomponenten nach Größe und Dichte. Der Spender ist dabei direkt mit der laufenden Zentrifuge verbunden [38].

Zellseparatoren mit diskontinuierlichem Wirkprinzip entnehmen und verarbeiten kleine Mengen Blut und retransfundieren die nicht benötigten zellulären Elemente, bevor eine neue Menge Blut entnommen und separiert wird [38].

Kontinuierlich arbeitende Zellseparatoren extrahieren die zellulären Elemente aus dem ununterbrochen durchfließenden Blut [55]. Die nicht benötigten Zellkomponenten werden bereits während der Extraktion fortlaufend an den Spender zurückgegeben.

Thrombozytenkonzentrate, die in der automatischen Thrombozytapherese gewonnen werden, sind Einzelspender-Konzentrate.

Nach den "Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie)“ [2] muß das Thrombozytapheresekonzentrat wie auch das leukozytendepletierte Thrombozytapheresekonzentrat mindestens 2 x 1011 Thrombozyten pro Transfusionseinheit enthalten. Demgegenüber besitzt ein Thrombozytenkonzentrat aus einer Vollblutkonserve lediglich 0,5 x 1011 Thrombozyten pro Transfusionseinheit.

Vier bis acht Thrombozytenkonzentrate aus Vollblut sind also erforderlich, um den therapeutischen Effekt von einem Thrombozytapheresekonzentrat zu erzielen.

KRETSCHMER [34] faßte in einer Arbeit von 1996 die in Europa geübte Praxis der Thrombozytentransfusionen dahingehend zusammen, daß der überwiegende Teil der transfusionsmedizinischen Zentren randomisierte, gepoolte Plättchenkonzentrate bereitstellt. Apheresekonzentrate, die teurer sind, werden mehrheitlich für chronisch thrombozytopenische Patienten verwendet. Human leucocyte antigen (HLA)- kompatible Plättchen werden vor allem für immunisierte oder therapierefraktäre Patienten eingesetzt.

Alle Thrombozytenkonzentrate, ob durch Vollblutkonserven oder mittels Thrombozytapherese am Zellseparator gewonnen, enthalten unterschiedlich große Mengen an kontaminierenden Leukozyten, die im Empfänger für negative immunologische wie infektiöse Folgen verantwortlich sein können.

Da Thrombozytenkonzentrate ein fester Bestandteil der modernen Medizin geworden sind, haben sich in den letzten Jahren viele Arbeitsgruppen mit den durch kontaminierende Spenderleukozyten verursachten Risiken von Thrombozytentransfusionen beschäftigt.

Von besonderer Bedeutung ist hier die Alloimmunisierung. Sie entsteht durch Bildung von Antikörpern des Empfängers gegen Antigene des Spenders, vor allem des HLA-Systems.


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HLA-Antigene werden vom Haupthistokompatibilitätskomplex (major histo-compatibility-complex, MHC) kodiert. Sie sind unterteilt in Klasse-I-Antigene , die auf allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten nachzuweisen sind, und in Klasse-II-Antigene , die nur von Antigen-präsentierenden Zellen (Monozyten, B-Lymphozyten, aktivierte T-Lymphozyten) exprimiert werden.

Für die Entstehung einer Alloimmunisierung müssen sowohl Klasse-I-Antigene und Klasse-II-Antigene auf einer Zelle vorhanden sein, was nur bei bestimmten Leukozyten der Fall ist. Thrombozyten allein sind nur schwach immunogen, weil sie Klasse-I-, jedoch nicht Klasse-II-HLA-AG exprimieren. Das Thrombozytenkonzentrat, das kontaminierende, gleichzeitig Klasse I- und Klasse II-HLA-AG tragende Spenderleukozyten enthält, kann im Empfänger eine Allo-Antikörperbildung gegen HLA-Klasse I-AG auf Spenderplättchen auslösen.

Eine besonders gravierende klinische Folge der Alloimmunisierung ist die Thrombozyten-refraktärität. Durch Plättchenrefraktärität des Empfängers wächst das Risiko thrombozytopenisch bedingter, schwer therapierbarer Blutungen. Die Alloimmunisierungs- und Refraktäritätsrate von chronisch transfundierten Patienten wird in der Literatur mit 17 – 100% angegeben [10,15,21, 36,52,60, 70, 72].

Eine weitere immunologisch bedingte Folge nach Transfusion von Thrombozytenkonzentraten können febrile nichthämolytische Transfusionsreaktionen (FNHTR) sein, mit deren Auftreten in über 1% der Fälle zu rechnen ist [41].

Bei einer Körpertemperaturerhöhung um mindestens 1 Grad, mit oder ohne Schüttelfrost und in zeitlicher Verbindung zu einer Transfusion, wird von einer FNHTR gesprochen. Der Zusammen-hang zwischen FNHTR und Spenderleukozyten ist seit mehr als 30 Jahren bekannt [11, 61].

Neueste Forschungsergebnisse bezüglich der Ursache von FNHTR zeigen, daß während der Lagerung der Thrombozytenkonzentrate aus den kontaminierenden Leukozyten Zytokine freigesetzt werden und akkumulieren. MYELLE et al. [53] haben festgestellt, daß FNHTR mit der Höhe der Konzentration dieser Zytokine korrelieren.

Aber auch HLA-Antikörper [16, 17], die von BRUBAKER [12] untersuchten Granulozyten-Antikörper und Plättchen-Antigene [9] scheinen an der Auslösung der FNHTR beteiligt zu sein.

Weiterhin kann die Transfusion von kontaminierenden Leukozyten in Thrombozytenkonzentraten eine Immunsuppression beim Empfänger verursachen. Erstmalig beschrieben OPELZ et al. [57] den immunsuppressiven Effekt von allogenen Bluttransfusionen. Sie beobachteten, daß präoperative Transfusionen eine positive Wirkung auf die Überlebensrate eines Nierentransplantats haben. Eine weitere günstige Folge der Immunsuppression ist eine erniedrigte Rezidivrate von entzündlichen Darmerkrankungen nach allogenen Transfusionen [62, 88].

Ferner wurde in retrospektiven Studien dieser immunsuppressive Effekt sowohl für eine höhere perioperative Infektionsrate als auch für ein erhöhtes Rezidivrisiko nach Vollblut-transfusionen bei Karzinompatienten verantwortlich gemacht [23, 26, 14].


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Die genauen Mechanismen der Immunsuppression beim Empfänger durch allogene Transfusionen bleiben weiterhin aufzuklären. Bereits bekannt ist, das Spenderleukozyten, die HLA-Klasse-II-Antigene tragen, zur Down-Regulation des Immunsystems (Abnahme der Antigenrepräsentation, verringerte Killerzellaktivität etc.) führen können [6].

Ein ernstes Risiko für den Empfänger stellt die Virustransmission durch Transfusion von Spenderleukozyten dar. Die Gefahr postransfusioneller viraler Infektionen durch intrazellulär persistierende Viren (CMV, EBV) können durch eine Leukozytenreduktion vermindert werden [7].

Das ist vor allem für die klinisch relevante CMV-Infektion von Belang, die bei Immunsupprimierten dramatisch verlaufen kann [7]. Zwei Studien an Patienten nach Herztransplantationen zeigen, daß sich die Gefahr einer latenten CMV-Infektion reduzieren läßt, wenn kontaminierende Leukozyten aus den Thrombozytenkonzentraten entfernt werden [77, 8].

Bei HIV-infizierten Patienten konnte nachgewiesen werden, daß das Fortschreiten der Erkrankung nach Transfusionen beschleunigt war [71, 82, 85].

Alloantikörperbildung, Thrombozytenrefraktärität, FNHTR, die Übertragung und Reaktivierung viraler Infektionen und eine mögliche Immunsuppression können nach Transfusion kontaminierender Spenderleukozyten entscheidende klinische Bedeutung erlangen.
Die Kosten einer adäquaten Versorgung HLA-immunisierter und im besonderen refraktärer Patienten mit HLA-kompatiblen Thrombozytenpräparaten sind enorm hoch, und die Verfügbarkeit von passenden Spendern kann ein limitierender Faktor der Therapie sein. Klinische Studien konnten zeigen, daß bei einer Leukozytenkontamination der Blutpräparate von weniger als 1 bis 5 x 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit Alloimmunisierungen weitgehend vermieden werden [71, 42, 22].

Die Produktmonografie des BGA [3] von 1989 hat in Thrombozytenkonzentraten eine Leukozyten-Obergrenze von 5 x 108 pro Transfusionseinheit festgelegt.
Die „critical immunologic load of leukocytes“ (cill), d.h. die kritische Schwelle der Anzahl kontaminierender Leukozyten für die Entstehung der Alloimmunisierung, liegt demgegenüber mit 1 x 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit erheblich niedriger [44].
Bei diesem cill-Wert handelt es sich um eine Risikoabschätzung, da die genaue Leukozytenzahl für eine Sensibilisierung im Einzelfall nicht bekannt ist und die jeweilige Sensibilisierungsbereitschaft des Empfängers beachtet werden muß.

In den letzten Jahren wurde belegt, daß durch die Entfernung der Leukozyten unter die kritische Grenze von 1 bis 5 x 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit die Alloimmunisierungsrate auf gegen Null reduziert werden kann [54, 67, 84].


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SAARINEN et al. [67], sowie OKSANEN und ELONEN [56] beschreiben dabei eine Leukozytenreduktion unter 1 x 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit als klinisch erforderlich und therapeutisch höchst effizient.

Die neuen „Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie)“ vom Jahr 2000 [2] tragen den aktuellen Studienergebnissen Rechnung. In leukozytendepletierten Thrombozytapheresekonzentraten muß demnach der Restleukozytengehalt unter 1 x 106 pro Transfusionseinheit eingehalten werden.

Mit der Bekanntmachung des Paul Ehrlich Institutes vom 18.09.2000 [1] dürfen seit

01. Oktober 2001 ausschließlich Vollblute, Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentrate in den Verkehr gebracht werden, deren Leukozytengehalt weniger als 1 x 10 6 pro Transfusionseinheit beträgt.

Für die Unterschreitung des cill-Wertes werden in praxi 2 Wege der Leukozytendepletion, der Entfernung der weißen Blutzellen, gegangen:

Die Methode der Wahl bestand bisher im Einsatz von Leukozytenfiltern. Die Leukozytenreduktion beträgt dabei mehr als 3 log Stufen [40, 50]. Nachteile dieser Art der Leukozytendepletion sind zusätzliche Kosten und zeitlicher Aufwand sowie der Thrombozytenverlust.

Eine Alternative zur Leukozytendepletion mittels Filter ist die Modifikation des Zellseparators und damit der Thrombozytapherese.

Diese Möglichkeit hat den Vorteil, daß die Leukozytenzahl in den Präparaten bereits im Ansatz, während der Konzentratherstellung, gesenkt wird und auf den Einsatz von Leukozytenfiltern verzichtet werden kann.

Die vorliegenden Arbeit untersucht, ob mit einer Modifikation des Blutzellseparators FRESENIUS AS 104 die Leukozytenzahl im Thrombozytapheresekonzentrat regelmäßig unter den cill-Wert gesenkt werden kann.


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2.  HERLEITUNG EINER AUFGABENSTELLUNG

Die vorliegende Arbeit möchte einen Beitrag zur Thematik der Leukozytendepletion in Thrombozytapheresekonzentraten liefern. Die verwendeten Apherese-Verfahren und Meßmethoden dienen der Beantwortung folgender Fragen:

  1. Resultiert aus der Modifikation der Trenngrenzenposition am Zellseparator FRESENIUS AS 104 eine geringere Leukozytenkonzentration und somit geringere Leukozytenkontamination in den Thrombozytapheresekonzentraten?
  2. Läßt sich die Leukozytenkontamination in den Thrombozytapheresekonzentraten mit Hilfe der modifizierten Trenngrenzenposition regelmäßig unter den cill-Wert senken?
  3. Ist es möglich, mit dem Blutbildautomat Abbott CD 3500 Leukozytenkontaminationen in den niedrigen Konzentrationen im Bereich des cill-Wertes zu messen?
  4. Gibt es Unterschiede in den Messergebnissen zwischen der durchflußzytometrischen Messung am FACScan und dem „Gold-Standard“, der modifizierten Nageotte-Kammer bezüglich der Leukozytenkontaminationen in den Thrombozytapheresekonzentraten?

Um die Reinheit der Thrombozytapheresekonzentrate zu verbessern, wurde am Blutzellseparator FRESENIUS AS 104 die Trenngrenzenposition verändert.
Der konstanten Trenngrenzenposition wurde die Modifikation mit periodischer Trenngrenzenposition gegenübergestellt.

Für die Analyse der niedrigen Leukozytenkonzentrationen in den Thrombozytapherese-konzentraten wurden drei Meßmethoden verwendet:
Als „Gold-Standard“ die modifizierte Nageotte-Zählkammer, weiterhin der Blutbildautomat Abbott CD 3500 und schließlich eine durchflußzytometrische Methode am FACScan.
Mit Hilfe des präzisesten Messverfahrens wurden die konstante und periodische Trenn-grenzenposition am Blutzellseparator in Bezug auf die Leukozytenkonzentration in den Thrombozytapheresekonzentraten verglichen. Neben der Leukozytenkontamination wurden die Qualitätsparameter Plättchenausbeute und Separationseffizienz für beide Trenngrenzenpositionen ebenfalls ermittelt und vergleichend beurteilt.


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22.10.2003