Kapitel II
Material und Methoden


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1.  Charakterisierung der Probanden

Als Probanden dienten 100 regelmäßige Zytapheresespender der Blutspendezentrale der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität Berlin. Alle Spender entsprachen den "Richtlinien zur Blutgruppenbestimmung und Bluttransfusion" [89] sowie den "Empfehlungen der Hämapheresekommission der Deutschen Gesellschaft für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie"[20].

Tabelle 1 informiert über allgemeine Daten des Probandenkollektivs, Tabelle 2 über hämatologische Parameter.

Tabelle 1: Allgemeine Daten der Thrombozytapheresespender

Geschlecht :

[ m/w]

94

/

6

Größe:

[ cm]

180

±

6

Gewicht:

[ kg]

77

±

9

Tabelle 2: Hämatologische Daten der Thrombozytapheresespender

Hämatokrit:

[ l/l]

0,43

±

0,03

Leukozyten:

[ 109 /l]

6,1

±

1,6

Thrombozyten:

[ 109 /l]

247

±

46

Bei je 50 Thrombozytapheresen wurde das Standardprogramm mit konstanter Trenngrenze bzw. die Programm-Modifikation mit periodischer Trenngrenze eingesetzt.
Die Thrombozytenspenden erfolgten im Zeitraum Mai 1995 bis November 1995.


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2.  Charakterisierung der Thrombozytaphereseverfahren

2.1. Grundprinzipien und Aufbau der zweistufigen Thrombozytenseparationskammer des Blutzellseparators FRESENIUS AS 104

Die Blutkomponentenspende am Blutzellseparator FRESENIUS AS 104 erfolgt nach dem Prinzip der kontinuierlichen Separation des Spenderblutes.

Während der ständigen Entnahme von Spenderblut über eine periphere venöse Punktionsstelle und der Rückgabe der nicht benötigten Blutbestandteile über eine zweite periphere venöse Punktionsstelle erfolgt die Blutkomponentengewinnung. Spezielle Apherese-Sets existieren für die jeweiligen Blutkomponenten. Dabei handelt es sich um Kunststoffeinsätze im Sinne geschlossener Systeme.

Für die hier vorgestellte Untersuchung wurde der Blutzellseparator FRESENIUS AS 104, Softwareversion 4.7 mit dem Set C4L und der Separationskammer C4 eingesetzt. Die Separationskammer C4 ist zweistufig und starr (Abbildung 1). Sie verfügt über verschiedene Abflusskanäle für die aufgetrennten Blutkomponenten.

Abbildung 1: zweistufige Thrombozytenseparationskammer des Blutzellseparators Fresenius AS 104


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Über den Vollblutschlauch wird das Spenderblut zusammen mit dem Antikoagulans ACD-A (Aqua-Citrat-Dextrose-A) in die äußere Kammer gepumpt. Die Blutkomponenten werden dort nach ihrer Dichte und Größe durch Zentrifugation aufgetrennt. Die Erythrozyten kommen so durch den leukozytenreichen buffy coat getrennt vom Plasma zu liegen, welches sich wiederum in plättchenreiches Plasma (PRP) und plättchenarmes Plasma (PPP) gliedert.

Die sedimentierten Erythrozyten und ein Teil des buffy coats fließen über den Erythrozyten-rückgabeschlauch passiv aus der ersten Kammer zum Spender zurück. Gleichzeitig befördert die Plasmapumpe das plättchenreiche Plasma (PRP) und das plättchenarme Plasma (PPP) aktiv von der ersten äußeren in die zweite innere Separationskammer. Hier werden dann die Thrombozyten als erwünschte Zellfraktion durch erneute Zentrifugation des PRP/PPP-Gemisches separiert und aktiv in einen externen Sammelbeutel gefördert. Die gleichzeitige Sammlung einer vorgegebenen Menge an Plasma ist prinzipiell möglich.

Tabelle 3 stellt die wichtigsten Variablen des Blutzellseparators und die Parametereinstellungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit vor.

Tabelle 3 : Parameter und Parametereinstellungen am Zellseparator

Software-Version

4.7

Programm

Thrombozyten-Set (5 Tage Lagerung)

Apherese-Set

C4L (komplett mit Separationskammer und Beutelsystem)

Basislösung

NaCl 0.9%

Antikoagulans

ACD-A (750ml-Beutel)

Formula:

A: Aqua ad injectabile

C: Natriumcitrat-Monohydrat 2.2g

Natriumcitrat-Dihydrat 0.8g

D: Dextrose-Monohydrat 2.45g

Antikoagulation

ACD-A : Vollblut = 1 : 10

Zentrifugendrehzahl

≤ 2000U/min

Trenngrenzenposition

konstant: 6 : 2

periodisch: 4 : 4 / 6 : 2


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2.2.  Die Trenngrenzenposition

Die Position der durch die Zentrifugation erhaltenen Phasengrenze zwischen Zellsediment (Erythrozyten und leukozytenhaltiger buffy coat) und dem Plättchen-/ Plasmagemisch wird in der ersten Separationskammer optoelektronisch ermittelt.

Eine Lichtquelle mit acht spiralförmig angeordneten Lichtsignalen befindet sich im Bereich des Zellabzugs. Das Licht aus den einzelnen Lichtsignalen gelangt durch das lichtdurchlässige Plättchen-/Plasmagemisch zu dem sich senkrecht über der Separationskammer befindenden Detektor. Befinden sich nun aber Zellen (Erythrozyten oder Leukozyten) im Bereich der einzelnen Lichtsignale, wird das emittierte Licht von diesen Zellen absorbiert und gelangt nicht bis zum Detektor.

Die Position der Phasengrenze ergibt sich so aus der Verteilung von erkannten bzw. nicht erkannten Lichtsignalen. Die Einstellung der Trenngrenzenposition am Zellseparator gibt nun vor, wo sich die Phasengrenze in der Separationskammer befinden muß, damit die Plasmapumpe mit dem aktiven Abzug des Plättchen-/ Plasmagemisches beginnt. Während das Plasma-/Plättchen-gemisch abgepumpt wird, wird die aktuelle Phasengrenze in der Separationskammer ständig mit der durch die Trenngrenzenposition festgelegten Vorgabe verglichen. Wird der Anteil an Zellen zu hoch, bleibt die Plasmapumpe stehen, bis die Phasengrenze wieder im geforderten Bereich liegt.

Die Position der Trenngrenze bei der Thrombozytapherese mit dem Zellseparator FRESENIUS AS 104 wirkt sich auf die Extraktionseffizienz und die Kontamination der Thrombozytenkonzentrate aus [45].

Es ist das Ziel dieser Untersuchungen, die Reinheit der Thrombozytenkonzentrate bezüglich der Verunreinigungen mit Leukozyten, durch Veränderung der Trenngrenzeneinstellung zu verbessern.

2.2.1. Konstante und periodische Trenngrenzenposition

Konstante Trenngrenze bedeutet, daß während der gesamten Thrombozytapherese die Position der Phasengrenze auf 6 : 2 (Erythrozyten : Plasma) fest eingestellt bleibt.

Durch die weniger periphere Lage der Plasma-Zellgrenze bzw. die schmale Schicht des plättchenreichen Plasma wird ein hoher Zellgehalt an Thrombozyten und folglich auch eine hohe Separationseffizienz erreicht. Allerdings ist die Folge der schmalen Plasmaschicht eine größere Leukozytenkontamination im Thrombozytapheresekonzentrat.


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In der Programm-Modifikation mit periodischer Trenngrenze soll versucht werden, die Leukozytenkontamination im Thrombozytenkonzentrat zu minimieren, jedoch eine möglichst hohe Separationseffizienz beizubehalten. Um das erreichen zu können, wird die Phasengrenze nicht konstant gehalten, sondern es werden Sammel- und Transferphasen unterschieden.
In der Sammelphase liegt die Phasengrenze bei der Einstellung 4 : 4 (Erythrozyten : Plasma), in der sich anschließenden Transferphase bei 6 : 2 (Erythrozyten : Plasma).

Hinter dem periodischen Wechsel der Trenngrenze steckt folgende Überlegung:

Das Verschieben der Trenngrenze in der Sammelphase auf die Position 4 : 4 bewirkt eine stärkere Sedimentation der Zellen, also der Erythrozyten und Leukozyten. Gleichzeitig findet eine bessere Trennung zwischen Thrombozyten und Leukozyten statt. Das Gemisch aus plättchenarmem Plasma (PPP) und plättchenreichem Plasma (PRP), das von der ersten in die zweite Separationskammer abgezogen wird, enthält weniger Leukozyten, aber auch weniger Thrombozyten. Mit der passageren Verschmälerung der Plasmaschicht in der Transferphase auf 6 : 2 (Erythrozyten : Plasma) wird vor allem die Thrombozytenschicht in die zweite Kammer überführt.

Die Dauer der Transferphase ist auf das Transfervolumen von 200 ml begrenzt. Drei Zyklen aus Sammel- und Transferphasen werden während der Thrombozytapheresen mit periodischer Trenngrenze durchlaufen.

2.3. Durchführung der Thrombozytapherese

Das Apherese-Set C4L, das komplett mit Separationskammer, Beutel- und Schlauch-systemen geliefert wird, wird in den Zellseparator FRESENIUS AS 104 eingelegt. Der Blutzellseparator wird danach mit der Antikoagulanzlösung ACD-A sowie 0,9%iger Natriumchloridlösung gefüllt. Für die Herstellung der 100 Thrombozytenkonzentrate wurden über das Spendermenü zwei verschiedene Voreinstellungen an der Fresenius AS 104 gewählt:

Für die ersten 50 Thrombozytenkonzentrate der Plättchen-Zielertrag von 3,3 x 1011 pro Transfusionseinheit, für die restlichen 50 Plättchenkonzentrate die maximale Separationsdauer von 80 Minuten.

Das Gerät wird dafür über die Folientastatur bedient. Über einen Änderungsmodus erfolgen durchzuführende Parameteränderungen. Zuerst muß die Taste "Änderung", dann die Taste für den gewünschten Parameter bedient werden. Durch die Betätigung entsprechender Pfeiltasten kann der Sollwert erhöht oder erniedrigt werden. Das Gerät errechnet nach den eingegebenen Parametern die Änderungen des Blutflusses. Infolge der Parameterkopplung ändern sich alle anderen Flüsse und die Zentrifugendrehzahl mit, bis die Höchstdrehzahl erreicht ist.


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Die Position der Trenngrenze, konstant oder periodisch, wird außen auf der Folientastatur des Zellseparators eingegeben. Das Separationsprogramm wird mit der Taste < Start > gestartet, die Pumpeneinstellung und die Steuerung der Zellkomponenten-Entnahme geschehen automatisch durch das Programm.
In der Einlaufphase ist zunächst die automatische Separation immer so lange ausgeschaltet, bis die Zellgrenze eine bestimmte Position erreicht hat.
Die Regelung der Trenngrenze erfolgt durch die Plasmapumpe.

Danach folgt der Programmstart.

Bei eingeschaltetem Drucker wird der Programmablauf automatisch ausgedruckt.

3. Probengewinnung

3.1. Gewinnung von Spenderblut vor der Thrombozytapherese

Nachdem der Zellseparator vorbereitet war, erfolgte die beidseitige periphere Venenpunktion. Zuerst wird die Vene an der Rückgabeseite punktiert. Es werden Blutproben für die Bestimmung von Hämatokrit und Thrombozytenzahl (Thrombozyten-Präwert) des Spenders vor Beginn der Thrombozytapherese abgenommen.

Danach erfolgt die Punktion der Vene an der Entnahmeseite mit der am System konnektierten Nadel.

3.2. Gewinnung von Spenderblut nach der Thrombozytapherese

Nach Beendigung der Thrombozytapherese wird das Schlauchsegment an der Rückgabeseite vom übrigen System abgetrennt. Das sich in diesem Segment befindliche Blut wird verworfen, um eine Verfälschung der Meßergebnisse durch das im System befindliche Antikoagulans zu verhindern. Danach werden Blutproben zur Ermittlung der Thrombozytenkonzentration (Thrombozyten-Postwert) im Spender entnommen.

3.3. Gewinnung von Thrombozytenkonzentrat nach der Thrombozytapherese

Nach gründlichem Durchmischen des Plättchenkonzentrats wird ein repräsentatives Schlauchsegment von 10 Zentimeter Länge vom Beutelsystem steril abgeschweißt.
Das Thrombozytapheresekonzentrat im entsprechenden Schlauchsegment kann nun in eine Sarstedt Monovette mit EDTA als Antikoagulans entleert werden. Kommt es zu einer Aggregatbildung von Thrombozyten im Thrombozytapheresekonzentrat, werden diese mit Hilfe des Flachbettagitators zur Auflösung gebracht.


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4.  Messmethoden

4.1. Durchflußzytometer FACScan

Prinzip

Die Durchflußzytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension. Sie basiert auf der Messung von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften der Zellen [63]. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmikroskopie erlaubt ein Durchflußzytometer die simultane Messung der relativen Zellgröße, der Granularität und maximal drei verschiedener Fluoreszenzfarben mehrerer tausend Einzelzellen in wenigen Sekunden.

Über einen angeschlossenen Computer werden die erhobenen Daten verarbeitet und gespeichert. Dafür werden die während der Messung auftretenden Lichtemissionen in numerische Signale umgesetzt.

Die Analyse der Zellen erfolgt in einem konstanten Flüssigkeitsstrom. Durch die umgebende Trägerflüssigkeit werden die Zellen beschleunigt, Zellaggregate aufgetrennt und die Zellen erreichen nacheinander den Analysepunkt. Dieser Vorgang wird hydro-dynamische Fokussierung genannt.

Am Analysepunkt trifft der monochromatische Laserstrahl auf die durchströmende Zelle. Die entstehenden Streulicht- und Fluoreszenzsignale werden mit Hilfe von Spiegel- und Filtersystemen erfaßt und können logarithmisch wie linear verstärkt werden.

Messung der Lichtstreuung

Die Lichtstreuung kommt durch die Wechselwirkung einer Zelle mit dem einfallenden Lichtstrahl zustande. Der größte Lichtanteil wird in Vorwärtsrichtung gestreut. Dieses Licht wird als Vorwärtsstreulicht [forward light scatter (FSC)] bezeichnet und ist ein Maß für die Zellgröße (d.h. kleine Zellen streuen weniger). Das im rechten Winkel zum einfallenden Laserstrahl gestreute Licht ist abhängig von der intrazellulären Granularität und von Oberflächeneigenschaften der Zellen; es wird Seitwärtsstreulicht [side scatter (SSC)] genannt.

Messung der Fluoreszenz

In der analytischen Durchflußzytometrie werden luftgekühlte Argon-Ionenlaser verwendet, die Licht einer Wellenlänge von 488 nm generieren. Deshalb werden in der Durchflußzytometrie vor allem Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die sich bei dieser Wellenlänge anregen lassen, jedoch verschiedene Emissionsmaxima besitzen.


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Durch das Koppeln von Fluoreszenzfarbstoffen an monoklonale Antikörper, die gegen spezielle Antigene auf den zu analysierenden Zellen gerichtet sind, erfolgt die Zellidentifikation. Da hierbei Antigen-Antikörper-Reaktionen sichtbar werden, wird auch von Immunfluoreszenz als immunologische Nachweismethode gesprochen.

Antikörper

In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe des Durchflußzytometers die Größe der Leukozytenkontamination in Thrombozytenkonzentraten bestimmt.

Alle Leukozyten exprimieren das CD 45-Antigen, jedoch je nach Zellpopulation in verschiedenen Expressionsstärken. Das CD 14-Antigen ist überwiegend auf Monozyten und zum Teil auf neutrophilen Granulozyten nachweisbar.

Das jeweilige Thrombozytenkonzentrat wird in einem kleinen Aliquot mit monoklonalen Antikörpern gefärbt, die gegen diese Leukozyten-Antigene gerichtet sind. Zum Markieren der monoklonalen Antikörper wird die gebräuchliche Kombination der beiden Fluoreszenzfarbstoffe Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE) verwendet. D.h. zur Bestimmung der Leukozyten-Kontamination in den Thrombozytenkonzentraten werden FITC-markierte CD 45-Antikörper und PE-konjugierte CD 14-Antikörper eingesetzt.

Eichpartikel

Neben den Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften, die an den einzelnen Zellen analysiert werden, wird die genaue Bestimmung des Volumens, das durch die Meßkapillare während des Meßzeitraums geflossen ist, für die Errechnung der Leukozytenkontamination benötigt. Da es sich bei der Leukozytenkontamination im Thombozytenkonzentrat um eine sehr niedrige Zellkonzentration handelt, ist eine längere Meßdauer erforderlich.
Der Fluß des Probevolumens, vorgegeben mit ca. 60 Mikroliter pro Minute, kann nicht ausreichend konstant gehalten werden.
Durch den Einsatz von FACSCOUNT - Control - Eichpartikeln (930 beads pro Mikroliter) in vorgegebener Konzentration wird das Probenvolumen exakt bestimmbar [80, 24]. Über die Ermittlung des Verhältnisses der Zellen zu Eichpartikeln im Probenvolumen kann die Zellkonzentration errechnet werden.

Zur Bestimmung der Leukozytenkontamination im Thrombozytenkonzentrat wird die Probe mit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern und beads in vorgegebener Konzentration versetzt.
Nach Inkubation der Probe und Erythrozytenlyse sowie erneuter Inkubation erfolgt ohne vorherige Zentrifugation die Messung am Durchflußzytometer. Die Geräteeinstellung erfolgt mit CaliBRITE beads (BDIS) und der Software FACSComp.


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4.1.1.  Präparation des Thrombozytapheresekonzentrates vor der durchfluß-zytometrischen Messung

50 Mikroliter des jeweiligen Thrombozytapheresekonzentrates werden aus der Sarstedt-Monovette in ein Falconröhrchen pipettiert.
In das Falconröhrchen werden weiterhin 50 Mikroliter beads ( FACSCOUNT-Control-Eichpartikel (BDIS), 930 beads/m l) und 5 Mikroliter Antikörper Anti-CD-45-FITC/Anti-CD-14-PE (Simultest-Leucogate, BDIS) gegeben. Diese Zellsuspension wird gründlich durchmischt und 20 Minuten inkubiert.

0,5 Milliliter Ortho-mune-lysing reagent (Ortho-Diagnostic Systems, Neckargemünd, Deutschland), je Ampulle aufgelöst in 100 ml Aqua dest., werden hinzugefügt, um die vorhandenen Erythrozyten in der Zellsuspension zu lysieren.

Die Messung am FACScan wird unmittelbar nach einer weiteren Inkubationszeit von 10 Minuten durchgeführt.

Für die Bestimmung der Leukozytenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat wird eine Modifikation der Grundeinstellung des Durchflußzytometers FACScan (Becton Dickenson Immunocytometry (BDIS)) vorgenommen.
Ziel ist es, daß alle Zellen, die kein CD 45-Antigen exprimieren (alle Zellen außer Leukozyten), aus der Messung herausfallen.
Aus diesem Grund wird der Schwellenwert des Fluoreszenzkanals FL1 auf 300 eingestellt, so daß Ereignisse mit einer Fluoreszenz unterhalb des eingestellten Schwellenwertes nicht mehr erfaßt werden.
Im Programm Cellquest erfolgt die Datenerfassung. Bei jeder Messung werden entweder 10000 Ereignisse ermittelt oder die Messung bricht nach einer Meßdauer von 3 Minuten automatisch ab, um Sedimentationsvorgänge zu vermeiden.

Die Kalkulation der Leukozytenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat erfolgt nach folgender Formel:

C Leuko =

E Leuko x V Eich x C Eich

E Eich x V Leuko

CEich, CLeuko : Partikelkonzentration

EEich, ELeuko : Anzahl der Ereignisse

VEich, VLeuko : Probenvolumen


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In die Formel werden die Eichpartikelkonzentration von 930 pro Mikroliter sowie die Probenvolumina von je 50 Mikroliter eingesetzt.
Aus der Gesamtzahl der 10000 Ereignisse (beads und Leukozyten) werden die jeweiligen Ereignisse in den entsprechenden Populationen am Durchflußzytometer ermittelt und die Berechnung der Zellkonzentration kann erfolgen.

4.1.2. Messung und Datenerfassung am Durchflußzytometer

Die Datenanalyse wird mit der Software Attractors (BDIS) durchgeführt. Die Daten für jede Zelle und jeden Parameter sind einzeln gespeichert ("list mode data"). Dies erlaubt die freie Korrelierbarkeit bei der Datenauswertung. Das ist die Voraussetzung für die prägnante Trennung der Leukozytenpopulationen bezüglich ihrer Streulichtparameter und der Antigenexpressionen.

Die Eigenfluoreszenz der beads ist sehr stark, so daß sie von fluoreszenzmarkierten Leukozyten gut zu unterscheiden sind.

Die Auswertung am FACScan erfolgt hierarchisch über die Prüfung und Zuordnung der einzelnen Zellpopulationen (beads, debris, Leukozyten).

Mit Ausnahme des Vorwärtsstreulicht werden alle Streulicht- und Fluoreszenzsignale logarithmisch verstärkt.

Mit der Software Attractors kann die Analyse von mehreren Parametern gleichzeitig bezüglich ihrer Korrelierbarkeit erfolgen. Die sogenannten Attractors sind ovale Populationsregionen, die um die einzelnen Leukozytengruppen gezogen werden, um diese zu definieren.

Bei der Auswertung der Meßergebnisse wird für jedes Ereignis geprüft, welcher Population das Ereignis angehört. Der Vorteil dieser Software liegt in der Möglichkeit der Unterscheidung von Zellpopulationen mit ähnlichen Eigenschaften (beispielsweise Monozyten und Lymphozyten), vorausgesetzt, sie differieren in mindestens einem erfaßten Parameter voneinander.

Die beiden folgenden Abbildungen zeigen die grafische Darstellung der Leukozytenpopulationen in Vollblut (Abbildung 2a) sowie in der Vollblut-Verdünnung von 1 : 1000 (Abbildung 2b).


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Abbildung 2 a: grafische Darstellung der Leukozytenpopulationen in Abhängigkeit von Streulichtparametern und Antigen-Expression im Vollblut

Abbildung 2b: grafische Darstellung der Leukozytenpopulationen in Abhängigkeit von Streulichtparametern und Antigenexpression im verdünnten Vollblut (1 : 1000)


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4.2.  Blutbildautomat Abbott Cell-Dyn 3500

Prinzip

Der Cell-Dyn 3500 (Abbott-Diagnostics) ist ein automatisch arbeitendes Mehrkanalgerät, das sowohl mit Laser-Lichtstreuung als auch mit Impedanztechnik arbeitet.

Das Hämoglobin wird mit einer Cyanmethämoglobin-Methode bestimmt, die Anzahl der Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten werden durch Impedanzmessungen ermittelt.
Wenn durch die Meßöffnung ein elektrischer Strom und ein Partikelstrom fließen, erhöht sich der elektrische Widerstand bei Durchtritt von Blutzellen, da sie Nichtleiter sind.
Diese Widerstandsänderung löst einen meßbaren elektrischen Impuls aus. Die Anzahl der Impulse entspricht der Anzahl der Zellen, die die Meßöffnung passiert haben. Die Amplitude des Impulses ist abhängig vom Volumen des Partikels.

Weiterhin wird die Leukozytenzahl im optischen Kanal (Laser) bestimmt und ein fünfteiliges Differentialblutbild erstellt. Wenn die Zellen mit dem Laserstrahl in Wechselwirkung treten, streuen sie das Laserlicht in alle Raumwinkel. Dabei verhalten sich die einzelnen Zellklassen in bezug auf die Streulicht-Intensität in einzelnen Winkelbereichen unterschiedlich.
Die Vorwärtsstreuung dient vorrangig zur Messung der Zellgröße. Mit Hilfe der Seitwärtsstreuung werden Informationen über die Zelloberfläche und den inneren Aufbau der Zellen gesammelt. Die von den Zellen ausgehenden optischen Signale werden gemessen und in elektrische Impulse umgewandelt, die dann im Computer gespeichert und ausgewertet werden können.

Die Bestimmung der Leukozytenzahl mit Hilfe zweier Methoden ermöglicht eine interne Qualitätskontrolle.
Die Leukozytenzahl, die im Impedanzkanal ermittelt wird, ist bei Anwesenheit von kernhaltigen Erythrozyten fälschlicherweise erhöht.

Bei der Messung der Leukozyten im optischen Kanal wird dagegen durch die Einführung eines mobilen Schwellenwertes diese Zellart vernachlässigt.
Da aber der optische Kanal schwächere lytische Lösungen verwendet, sind die Leukozytenzahlen bei Anwesenheit von osmotisch resistenten Erythrozyten (z.B. in neonaten Blutproben) fälschlicherweise erhöht.

Grundsätzlich vergleicht der Cell-Dyn die bei jeder Leukozyten-Messung ermittelten Werte aus den beiden Leukozyten-Kanälen und korrigiert gegebenenfalls die Ergebnisse.

Die Kombination der beiden verschiedenen Meßverfahren speziell für die Leukozyten-Bestimmung reduziert Störungen bei atypischen oder pathologisch veränderten Proben.


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In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Messungen am Cell-Dyn durchgeführt:

  1. der Hämatokrit-Wert des Spenders vor der Konzentrat-Spende
  2. der Thrombozyten-Präwert (vor der Spende) und der Thrombozyten-Postwert (nach der Spende) des Spenders
  3. die Thrombozytenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat
  4. die Leukozytenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat.

4.2.1. Präparation des Thrombozytapheresekonzentrates vor der Messung

Nachdem die Thrombozytapherese abgeschlossen ist, wird von dem Konzentratbeutel ein repräsentatives Schlauchsegment abgeschweißt und das darin enthaltene Thrombozytapheresekonzentrat in eine Sarstedt Monovette (Antikoagulans: EDTA) gefüllt. Aus der Sarstedt Monovette erfolgt die Probenentnahme für die Bestimmung des Thrombozytenwertes und der Leukozytenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat.

4.3. Nageotte-Zählkammer

Prinzip

Die Ermittlung von Leukozytenkonzentrationen in leukozytendepletierten Thrombozytapherese-konzentraten ist mit Standard-Zählkammern (Neubauer, Bürker) nicht möglich, da Leukozytenkonzentrationen unter 10 pro Mikroliter nicht mit ausreichender Genauigkeit bestimmt werden können [40, 4].

Deshalb ist in dieser Arbeit die large-volume-Nageotte Counting chamber (COBE BCT Nageotte modified BRIGHT-Line (metalized) counting chamber ) benutzt worden [39, 40, 50].

Die Kammertiefe der Nageotte-Kammer beträgt 0,5 mm, während Standard-Zählkammern für Blutzellen nur 0,1 mm tief sind. Bei der Nageotte-Kammer handelt es sich um eine modifizierte Zählkammer, die einen metallischen Überzug besitzt und über zwei Zählnetze verfügt. Jedes Zählnetz besitzt 40 Reihen, was einem Volumen von 50 Mikrolitern entspricht.

Das Thrombozytapheresekonzentrat wird zur Hämolyse eventuell noch vorhandener einzelner Erythrozyten mit Essigsäure versetzt und gleichzeitig verdünnt, so daß die Leukozyten in der Zählkammer mikroskopisch als solche zu erkennen sind.


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4.3.1.  Präparation des Thrombozytapheresekonzentrates vor der Zellzählung in der Zählkammer

In ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (2,0 ml mit Deckel) werden 100 Mikroliter Thrombozytenkonzentrat pipettiert, um danach 400 Mikroliter 0,5 M Essigsäure hinzuzufügen. Danach erfolgt ein sorgfältiges Mischen der Lösung.

Die Zählkammer, insbesondere die Seitenstege und das Gebiet der beiden Zählnetze sowie das Deckglas werden mit einem trockenen Lappen sorgfältig von Fett und Staub befreit. Dann wird das Deckglas vorsichtig auf die Stege geschoben. Durch leichtes Hin- und Herschieben entstehen Newtonsche Farbringe auf den beiden Stegen im Bereich der Deckglasauflage

Die Haftfähigkeit des Deckglases auf der Kammer ist bei gutem Sitz so groß, daß es nur durch Kippen um eine seiner Kanten wieder entfernt werden kann.

Nun wird die Lösung erneut gemischt.

Für das vorsichtige Einfüllen der Probe in die beiden Zählnetze ( je 50 Mikroliter) der Nageotte-Kammer wird eine 100 Mikroliter Pipette (Eppendorf) verwendet. Nach zehnminütiger Wartezeit für die Sedimentation der Leukozyten in der Kammer erfolgt die vorsichtige Plazierung der Nageotte-Kammer unter einem Mikroskop LEITZ DM IL (Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar).

4.3.2. Auszählung der Leukozyten in der Nageotte-Zählkammer; Berechnung


Bei 20er Vergrößerung erfolgt die Auszählung der Leukozyten unter dem Mikroskop.

Ein Zählnetz besitzt 40 Reihen, was einem Volumen von 50 Mikroliter entspricht.

Befindet sich das Zählergebnis zwischen 0 und 10 Leukozyten, werden die Leukozyten des zweiten Zählnetzes ermittelt.

Berechnung:

Leukozyten pro Mikroliter =

gezählte Zellen x Verdünnung

Volumen d. Zählkammer


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5.  Auswertung

Die Auswertung umfaßt folgende Kriterien:

  1. den Absolutertrag an Thrombozyten (Ausbeute)
  2. die Separationseffizienz
  3. die Separationsleistung
  4. die Leukozytenkontamination

5.1. Parameterermittlung und Berechnungen

Um die obenstehende Größen berechnen zu können, müssen folgende Parameter ermittelt werden:

Separationsdauer und Separationsvolumen werden aus dem jeweiligen Apherese-Protokoll des Blutzellseparators abgelesen. Das Volumen des Thrombozytapheresekonzentrates wird mittels Wiegen und Division durch die Dichte (1,026g/cm ) errechnet.

Die Leukozyten- und Thrombozytenkonzentration im Spenderblut wie auch im Thrombozyt-apheresekonzentrat ist am Ausdruck des Blutbild-Automaten Abbott CD 3500 zu erkennen.

Die Leukozytenkonzentration im Thrombozytapheresekonzentrat wird mit Hilfe der Nageotte-Kammer gezählt bzw. mittels Durchflußzytometer bestimmt.

Die Berechnungen werden im folgenden dargestellt:

1. Absolutertrag an Thrombozyten (TE)

TE =

Konzentratvolumen x Thrombozytenkonzentration im Konzentrat


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2. Separationseffizienz (SE)

SE =

Absolutertrag an Thrombozyten

(Separationsvolumen x mittlere Thrombozytenkonzentration im Spenderblut)

3. Separationsleistung (SL)

SL =

Absolutertrag an Thrombozyten

Separationsdauer

4. Leukozytenkontamination (LK)

LK =

Konzentratvolumen x Leukozytenkonzentration im Konzentrat

6. Statistik

Die Statistik-Software SPSS für Windows, Version 6.0., wurde für die statistische Auswertung angewandt.

In beiden Separationsverfahren wurden die einzelnen Meßgrößen auf Normalverteilung mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft.

Mit dem nächsten Schritt erfolgte der statistische Vergleich der Mittelwerte der Meßgrößen für beide Separationsverfahren.
Konnten mit dem oben beschriebenen Verfahren normalverteilte Meßgrößen angenommen werden, wurde der t-Test für unabhängige Stichproben genutzt.

Mußte eine Normalverteilung der jeweiligen Meßgröße in einer der beiden Gruppen abgelehnt werden, wurde der Mann-Whitney U-Test angewandt.


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Folgende Nullhypothese wurde für den statistischen Vergleich der beiden Separationsverfahren aufgestellt: In den gemessenen Stichproben finden sich Grundgesamtheiten mit gleichem Mittelwert, d.h. es gibt bezüglich der Meßgrößen in beiden Separationsverfahren keinen Unterschied.

Die Nullhypothese wird bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 verworfen.


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22.10.2003