Kapitel IV Diskussion


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Die Position der Trenngrenze bei der Thrombozytapherese mit dem Zellseparator FRESENIUS AS 104 wirkt sich auf die Extraktionseffizienz und die Leukozytenkontamination der Thrombozytenkonzentrate aus.

Es ist das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Reinheit der Präparate durch Veränderungen der Trenngrenzen-Einstellung zu verbessern. Dabei sollte die Leukozytenkontamination regelmäßig unter der kritischen Grenze von 1 x 106 Leukozyten pro Konzentrat (cill-Wert) liegen, damit die Alloimmunisierungsrate gegen Null reduziert werden kann [67, 84] bzw. auf die kostenintensive Leukozytendepletion mittels spezieller Filter verzichtet werden kann.

Für zahlreiche Studien am Zellseparator FRESENIUS AS 104 wurde die Trenngrenzenposition bei den Thrombozytapheresen auf die Standardposition 6 : 2 und 7 : 1 eingestellt [5, 31, 33, 35, 46, 58, 81].

In der vorliegenden Arbeit wurde eine modifizierte periodische Trenngrenzen-Einstellung von 4 : 4 / 6 : 2 untersucht und der konstanten Standard-Trenngrenzen-Position von 6 : 2 gegenübergestellt. Dabei wurden 50 Thrombozytapheresen mit konstanter und 50 Thrombozytapheresen mit periodischer Trenngrenzenposition durchgeführt und die Thrombozytenkonzentrate anschließend auf ihren Gehalt an kontaminierenden Leukozyten überprüft.

Das methodische Problem besteht in der Messung von Leukozytenkontaminationen in einem sehr niedrigen Konzentrationsbereich, wie es in der vorliegenden Arbeit der Fall ist. Deshalb wurden in dieser Untersuchung zur genauen Ermittlung der Leukozytenkonzentrationen in den einzelnen Thrombozytenkonzentraten der Nageotte-Zählkammer als "Gold-Standard" zwei weitere alternative Meßmethoden, das Durchflußzytometer FACScan und ein neuartiger Blutbildautomat, Abbott CD 3500, gegenübergestellt.

Anhand der Ergebnisse dieser drei Meßmethoden erfolgte die Einschätzung des genauesten Zählverfahrens zur Bestimmung der Leukozytenkonzentrationen in Plättchenkonzentraten.
Auf der Basis des entsprechenden Zählverfahrens wurde der Vergleich der beiden Trenngrenzenpositionen am Zellseparator FRESENIUS AS 104 vorgenommen.

Neben dem Vergleich der Leukozytenkontaminationen in den Thrombozytenkonzentraten wurden die Effektivitätsparameter Separationseffizienz und Thrombozytenausbeute für beide Trenngrenzenpositionen ermittelt und einander gegenübergestellt.

1. Methodenvergleich Leukozytenzählung

In der vorliegenden Arbeit wurde mit der modifizierten Nageotte-Kammer für das Separations-verfahren mit konstanter Trenngrenze Leukozytenkonzentrationen von 17,2 ± 19,5 pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat bzw. für die periodische Trenngrenze 7,3 ± 13,6 Leukozyten pro Mikroliter Plättchenkonzentrat gezählt.


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Im Vergleich dazu lagen die Werte, die mit dem Blutbildautomaten Abbott CD 3500 gemessen wurden, erheblich höher. Für die konstante Trenngrenze wurden Leukozytenkonzentrationen von 58,8 ± 43,1 pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat gemessen, für die Separation mit periodischer Trenngrenzeneinstellung 18,9 ± 17,9 Leukozyten pro Mikroliter Plättchenkonzentrat.

Abbildung 8 (siehe Ergebnisteil) zeigt den grafischen Vergleich der Leukozytenkonzentrationen in Thrombozytenkonzentraten, die mit der Nageotte-Kammer gezählt bzw. mit dem Blutbildautomaten Abbott CD 3500 gemessen wurden.

Der Blutbildautomat zeigt bereits eine unzureichende Genauigkeit bei Leukozytenkonzentrationen unter 50 - 80 pro Mikroliter Plättchenkonzentrat, was auch durch den sehr schlechten Korrelationskoeffizienten von 0,546 zum Ausdruck kommt.

Nach KRETSCHMER [33] sind Blutbildautomaten für die Bestimmung der Leukozyten-konzentration in Plättchenkonzentraten nicht sensitiv genug, da ihre Meßgenauigkeit abnimmt, wenn die Thrombozytenkonzentration unter 5 x 108 /l bzw. über 700 x 109 /l liegt.

Diese untere Grenze wird in Thrombozytenkonzentraten überschritten und der automatische Zellzähler kann nicht mehr zwischen den oft vorliegenden Plättchenaggregaten und Leukozyten unterscheiden. Deshalb werden zu hohe Leukozytenkonzentrationen gemessen [33].

ZINGSEM et al. [92] verglichen Messungen der Leukozytenkontaminationen in Thrombozyten-konzentraten am automatischen Zellzähler Sysmex 180, der Neubauer-Zählkammer und der Nageotte-Zählkammer (allerdings hier mit einem Volumen von 10 Mikroliter).

Aus den Ergebnissen des automatischen Zellzählers ergaben sich ungefähr 100fach höhere Leukozytenkonzentrationen als in der Nageotte-Kammer.

ZINGSEM et al. [92] schlossen daraus, daß Zellzähler nicht relevant sind für Messungen der Leukozytenkonzentrationen in Plättchenkonzentraten.

Früher enthielten leukozytenarme Blutprodukte 500 -1500 Leukozyten pro Mikroliter [92]. Diese Zellkonzentrationen konnten ausgesprochen einfach mit Blutbildautomaten, deren untere Meßgrenze bei etwa 100 Leukozyten pro Mikroliter Blut liegt, gemessen werden [4, 86, 87].

Mit der Entwicklung effizienter Verfahren der Leukozytendepletion in den letzten Jahren wurde der Gehalt kontaminierender Leukozyten in Blutprodukten immer geringer und die Nachweisbarkeit in der Routine schwieriger.

Die Leukozytenkontamination oberhalb der für eine Alloimmunisierung der Empfänger im HLA-System angenommenen Grenze beträgt 1 x 106 pro Plättchenkonzentrat, was dem cill-Wert, d.h. der "critical immunological load of leucocytes" entspricht [43] . Wird von einem cill-Wert von etwa 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit aus-gegangen, entspricht das in etwa der geringen Kontaminationsrate von 3 bis 5 Leukozyten pro Mikroliter Plättchenkonzentrat.


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Der neuartige Zellzähler Abbott CD 3500 gestattet zwei Möglichkeiten der Vollblutentnahme, die Probenentnahme aus offenen bzw. aus geschlossenen Probenröhrchen. Für die vorliegende Arbeit wurden offene Probenröhrchen benutzt, wobei das Ansaugvolumen 130 Mikroliter ± 5% beträgt. Entsprechend der Gerätebeschreibung teilt ein Scherventil die angesaugte Probe in drei Teile:

20 Mikroliter der Probe für die Bestimmung der Leukozytenkonzentration über das Prinzip der Widerstandsmessung, 32 Mikroliter der Probe für die Analyse der Leukozytenkonzentration mittels optischer Zählung und 0,64 Mikroliter der Probe für die Bestimmung von Erythrozyten und Blutplättchen.

Die 20-Mikroliter-Probe für die Bestimmung der Leukozytenkonzentration im Widerstandskanal werden bei einer Verdünnung von 1 : 301 auf 0,066 Mikroliter der ursprünglichen Probe verdünnt.
Für die Messung der Leukozytenkonzentration im optischen Kanal, d.h. mittels Laserlichtstreuung, wird die 32 - Mikroliter - Probe 1 : 51 verdünnt.
Aus diesem Grund bleiben für die eigentliche Messung nur 0,63 Mikroliter Probe übrig. Bei Leukozytenkonzentrationen im Bereich des cill-Wertes sind dann bei dieser Verdünnung und diesem geringen Probevolumen nur noch 1-2 Leukozyten pro Probe zu erwarten.

Der neuartige Zellzähler Abbott CD 3500 besitzt zwar mit seinem Meßbereich von 50 bis 80 Leukozyten pro Mikroliter eine bessere Präzision als ältere Blutbildautomaten, ist aber für die vorliegende Untersuchung der Analyse geringster Leukozytenkonzentrationen auf der Ebene des cill-Wertes unzureichend.
Hauptgrund für die Ungenauigkeit dieses Blutbildautomaten ist das zu geringe Meßvolumen.

Das Standardverfahren zur Quantifizierung von niedrigen Leukozytenkonzentrationen ist die mikroskopische Zählung dieser Zellen in der modifizierten Nageotte-Kammer. Es handelt sich dabei um eine Zählkammer mit einem größeren Volumen von 50 Mikrolitern [39, 40, 50].

Abbildung 9 (siehe Ergebnisteil) zeigt den grafischen Vergleich der Leukozytenkontaminationen, die mit Hilfe der Nageotte-Kammer und der FACScan-Methode gemessen wurden.

Es fand sich eine hohe Übereinstimmung beider Methoden, repräsentiert durch den hohen Korrelationskoeffizienten von 0,930. Die Abbildung veranschaulicht allerdings auch, daß bei Leukozytenkonzentrationen von weniger als 10 pro Mikroliter Plättchenkonzentrat die Messung am FACScan niedrigere Werte als die Nageotte-Kammerzählung ermittelte.

Bei konstanter Trenngrenzenposition beträgt die Leukozytenkontamination 4,9 ± 6,3 x 106 pro Thrombozytenkonzentrat (FACScan). Im Vergleich dazu ist die Leukozytenkontamination bei periodischer Trenngrenzeneinstellung mit Werten von 1,2 +/- 5,7 x 106 pro Plättchenkonzentrat signifikant niedriger.

Dabei ist zu erwähnen, daß sich die Spenderausgangswerte bezüglich der Leukozyten-konzentration im Spenderblut nicht signifikant unterschieden (6,2 +/- 1,7 x 109 /l für die konstante Trenngrenze vs. 6,0 ± 1,6 x 109 /l für die periodische Trenngrenzenposition).


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Auch die Ergebnisse der Nageotte-Kammerzählung ergaben signifikant niedrigere Leukozyten-kontaminationen in den Plättchenkonzentraten bei den Thrombozytapheresen mit periodischer Trenngrenzeneinstellung.

Es wurden für die konstante Trenngrenzenposition 4,9 ± 5,6 x 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit bzw. bei periodischer Trenngrenze 2,1 ± 3,9 x 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit gezählt.

Tabelle 9 faßt noch einmal die Leukozytenkontaminationen in den Thrombozyt-apheresekonzentraten (Nageotte-Kammer und FACS) für beide Trenngrenzenpositionen zusammen.

Tabelle 9: Leukozytenkontaminationen (WBC) in den Thrombozytapheresekonzentraten (Nageotte-Kammer und FACScan) für die konstante und periodische Trenngrenzenposition

Trenngrenzenposition

WBC x 106 /TE

(Nageotte)

WBC x 106 /TE

(FACScan)

konstant

periodisch

4,9

2,1

4,9

1,2

Bemerkenswert ist, daß sowohl mit der Nageotte-Kammer als auch mit Hilfe der Durchflußzytometrie identische Werte für die Leukozytenkontamination bei konstanter Trenngrenzeneinstellung (4,9 ± 5,6 x 106 Leukozyten pro Thrombozytenkonzentrat) ermittelt wurde.
D.h., im Bereich von 10 Leukozyten pro Mikroliter reicht die Präzision der Nageotte-Kammer an die der durchflußzytometrischen Methode durchaus heran.

Dieses Ergebnis entspricht den Arbeiten von BODENSTEINER [4] wie auch MASSE et al. [40]. Beide Autoren betonten aber auch, daß mit Hilfe von Zählkammern Leukozytenkonzentrationen unter 10 pro Mikroliter Plättchenkonzentrat nicht präzise genug zu erfassen sind.

Standardisierte Methoden für die Leukozytenzählung in der Nageotte-Kammer wurden von MASSE et al. [40], von LUTZ und DZIK [39] und MOROFF et al. [50] entwickelt.


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Die Zellzählung ist nicht nur zeitaufwendig und schwierig durchzuführen. Mit einem Variationskoeffizienten von 39% bei Leukozytenkontaminationen unter 2 pro Mikroliter [39] bzw. einem Variationskoeffizienten von 50% bei Leukozytenkontaminationen zwischen 0,1 und 1 pro Mikroliter (allerdings in Erythrozytenkonzentraten) - in der Arbeit von REBULLA und DZIK [66] - weisen sie nur eine geringe Präzision auf.

SADOFF et al. [69], TAKAHASHI et al. [76], KAO und SCORNIK [30] sowie KAO et al. [29] entwickelten verschiedene Methoden für eine mögliche Vereinfachung der Leukozytenzählung im Plättchenkonzentrat in der Zählkammer. MASSE et al. [40] haben verschiedene Techniken zur Messung sehr niedriger Leukozytenkonzentrationen in gefilterten Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentraten mit Hilfe der Nageotte-Kammer verglichen. MASSE et al. [40] konnten schlußfolgern, daß in dem Konzentrationsbereich von 10 bis 500 Leukozyten pro Mikroliter Konzentrat die Nageotte-Kammer eine gute Linearität zeigte [40]. Das untere Limit einer exakten Präzision lag bei 2 Leukozyten pro Mikroliter mit einem Variationskoeffizienten von 25%, allerdings mit noch aufwendigeren Schritten der Probeneinengung und zusätzlicher Zentrifugation des Konzentrats.

In der vorliegenden Untersuchung wurde in Anlehnung an die Arbeit von MOROFF et al. [50] das Plättchenkonzentrat mit Essigsäure verdünnt und ohne vorherige Zentrifugation der Probe wurde die Zählkammer präpariert. Ein weiteres Problem liegt darin, daß die Kammerzählung eine ausgesprochen subjektive Methode darstellt. Die exakte Diskriminierung der Leukozyten setzt die lange Erfahrung der zählenden Person bezüglich der Zählkammern voraus. Den Beweis dafür bieten in der vorliegenden Arbeit die Abbildungen 10 und 11.

Abbildung 10: Vergleich von Nageotte-Kammer und FACScan-Methode: Messung 1 bis 50


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Abbildung 11: Vergleich von Nageotte-Kammer und FACScan-Methode: Messung 51 bis 100

Bei den ersten 50 Messungen (Abb.10) besteht mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,83 eine geringere Übereinstimmung der beiden Meßmethoden Nageotte und FACScan als bei den Messungen 51 bis 100 (Abb.11), wo ein Korrelationskoeffizient von 0,966 ermittelt wurde (hier ohne Beachtung der beiden Trenngrenzenpositionen). Dieses Ergebnis bezieht sich eindeutig auf die durch die Einarbeitung in das Gebiet der Kammerzählung erworbenen Fähigkeiten.

Zusammenfassend kann mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit bestätigt werden, daß die Nageotte-Kammerzählung bis zu einem Konzentrationsbereich von 10 Leukozyten pro Mikroliter Plättchenkonzentrat eine gute Linearität besitzt [40]. Im für diese Arbeit relevanten Meßbereich von bis zu 1 Leukozyten pro Mikroliter Plättchenkonzentrat resultiert aus den vorliegenden Meßergebnissen, daß die Präzision der Durchflußzytometrie derjenigen der Nageotte-Kammer überlegen ist (Abb. 10 und 11).

Das entspricht den Ergebnissen von RADTKE et al. [64], die mit der Methode der Durchflußzytometrie einen Variationskoeffizienten von 20% bei unter 1 Leukozyten pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat eine deutlich bessere Präzision erzielten, als mit der mikroskopischen Zählung mit Hilfe der Nageotte-Kammer [39, 66, 40].

Der entscheidende Grund für die bessere Präzision der Durchflußzytometrie ist das größere Probenvolumen, das zur Zellanalyse zur Verfügung steht.


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In der vorliegenden Arbeit betrug das Probenvolumen für die Zählung in der modifizierten Nageotte-Kammer jeweils 10 Mikroliter.

Für die Messung am Durchflußzytometer standen bei einer Messung von drei Minuten und einem Probenfluß von etwa 60 Mikrolitern pro Minute jeweils 15 Mikroliter Probe zur Analyse. D.h., es stand das 1,5 fache des Probenvolumens bei der durchflußzytometrischen Messung im Vergleich zum analysierten Probenvolumen der Nageotte-Kammer zur Verfügung, womit weitestgehend die bessere Präzision des FACScan zu erklären ist.

Der Gegenüberstellung der beiden Trenngrenzenpositionen am Blutzellseparator FRESENIUS AS 104 werden die als präziser geltenden Meßergebnisse der durchflußzytometrischen Methode zugrunde gelegt.

2. Vergleich der Apherese-Methoden

Der Zellseparator AS 104 ist ein modernes Gerät zur Gewinnung von Plasma und Blutzellen. Die Trenngrenzeneinstellung bei der Thrombozytapherese regelt die Grenze zwischen den Erythrozyten und Leukozyten einerseits und dem plättchenreichen Plasma andererseits.
Die Einstellung der Trenngrenzenposition am Blutzellseparator FRESENIUS AS 104 beeinflußt nicht nur entscheidend die Anzahl kontaminierender Leukozyten im Plättchenkonzentrat, sondern auch die Effektivitätsparameter Plättchenausbeute und Separationseffizienz [5, 31, 33, 35, 46, 58, 81], die im folgenden für den Vergleich der beiden Trenngrenzenpositionen mit heran gezogen werden.

Bei Anwendung der konstanten Trenngrenze lag der Absolutertrag an Thrombozyten im Mittel bei 3,6 x 1011 pro Plättchenkonzentrat, im Separationsverfahren mit periodischer Trenngrenze bei 3,3 x 1011 Thrombozyten pro Konzentrat.

Es handelt sich um einen signifikanten Unterschied zugunsten der konstanten Trenngrenze (t-Test: p = 0,017), bei vergleichbaren Ausgangswerten der Spender bezüglich ihrer Thrombozyten-konzentration im Blut (251 x 109 Thrombozyten pro Liter Spenderblut für die konstante Trenngrenze vs. 243 x 109 Thrombozyten pro Liter Blut bei Anwendung der periodischen Trenngrenzenposition; U-Test: p = 0,171).

Der nach den neuen „Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten“ [2] geforderte Gehalt von über 2 x 1011 Thrombozyten pro Plättchenkonzentrat wurde in beiden Separationsverfahren eingehalten.


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Bei Anwendung der konstanten Trenngrenze betrug das Minimum der Plättchenausbeute 2,4 x 1011 pro Thrombozytenkonzentrat und das Maximum des Thrombozytenertrags 7,3 x 1011 pro Plättchenkonzentrat.

Im Separationsverfahren mit periodischer Trenngrenzenposition lag das Minimum des Absolutertrags an Thrombozyten bei 2,0 x 1011 Thrombozyten pro Plättchenkonzentrat und das Maximum bei 5,6 x 1011 Plättchen pro Thrombozytenkonzentrat. Trotz der signifikanten Unterschiede des Plättchengehaltes in den Thrombozytenkonzentraten wurde der geforderte Gehalt an Thrombozyten je Plättchenkonzentrat in beiden Separationsverfahren eingehalten.

Der Effektivitätsparameter Separationseffizienz der Thrombozytapherese errechnet sich aus dem Verhältnis von Plättchenausbeute zum Produkt von Separationsvolumen und mittlerer Thrombozytenkonzentration im Spenderblut vor und nach der Apherese.

Für das Separationsverfahren mit konstanter Trenngrenze wurde eine Separationseffizienz von 48%, für die periodische Trenngrenzenposition von 43,4% ermittelt. Der statistische Vergleich zeigt, daß beim Separationsverfahren mit periodischer Trenngrenze eine signifikant erniedrigte Separationseffizienz (t-Test: p = 0,005) erzielt wird.

Durch den signifikanten Unterschied des Parameters Plättchenausbeute zugunsten des Separationsverfahrens mit konstanter Trenngrenze erklärt sich auch die signifikant höhere Separationseffizienz bei konstanter Trenngrenzenposition.

Werden die jeweiligen Separationseffizienzen für die einzelnen Thrombozytapheresen detailliert betrachtet, ergibt sich bei konstanter Trenngrenze eine minimale Separationseffizienz von 35,3% und eine maximale Separationseffizienz von 81,7%. Allerdings scheint die maximale Separationseffizienz von 81,7% sehr hoch, was eventuell eine Ungenauigkeit in der Bestimmung der Spenderwerte vermuten lassen dürfte.

Im Separationsverfahren mit periodischer Trenngrenze liegt die kleinste Separationseffizienz bei 26,8% und die größte bei 68,2%, also deutlich geringer im Vergleich zur konstanten Trenngrenzenposition.

Weder das Separationsvolumen noch die mittlere Plättchenkonzentration im Spenderblut unterscheiden sich in den beiden Separationssystemen jeweils signifikant voneinander und beeinflussen daher die Berechnung der Separationseffizienzen kaum.

Für das Unterschreiten der für eine Alloimmunisierung der Empfänger im HLA-System kritischen Grenze (cill-Wertes von 1 bis 5 x 106 Leukozyten pro Plättchenkonzentrat) ergibt sich aus den mit Hilfe der durchflusszytometrischen Methode im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Resultate folgendes: Die Ergebnisse der Thrombozytapherese mit konstanter Trenngrenzenposition unterscheiden sich in deutlich von denen mit periodischer Trenngrenzeneinstellung.


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Bei konstanter Trenngrenzenposition lag das durch den FACScan ermittelte Meßergebnis nur neun Mal unter 1 x 106 Leukozyten pro Thrombozytenkonzentrat, während bei 17 Messungen die Leukozytenkonzentration den Wert von 5 x 106 pro Plättchenkonzentrat überschritt, neben einem Ausreißer mit deutlich höherer Kontamination.

Bei periodischer Trenngrenzenposition lag die mittels FACScan gemessene Leukozyten-kontamination bei 46 von 50 Proben unter dem angestrebten Wert von 1 x 106 pro Thrombozytenkonzentrat, lediglich bei zwei Thrombozytapheresen überschritten die Leukozytenkontaminationen den Wert von 5 x 106 pro Plättchenkonzentrat.

Für die beiden Ausreißer gilt folgendes: Ein Wert liegt mit 17,2 Leukozyten pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat knapp über der oberen Grenze des cill-Wertes von 5 x 106 Leukozyten pro Plättchenkonzentrat.

Der zweite Wert ist mit 139,4 Leukozyten pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat (40,2 x 106 Leukozyten pro Plättchenkonzentrat) extrem hoch und fällt völlig aus dem Rahmen der anderen, bei periodischer Trenngrenze gemessenen Leukozytenkonzentrationen.

Für die Analyse der Ausreißer wurden erstens eventuelle Fehlermöglichkeiten bei der Bestimmung der Leukozytenkontamination in den Thrombozytapheresekonzentraten und zweitens die Spenderwerte untersucht.

Die sehr hohe und völlig aus dem Rahmen fallende Leukozytenkontamination im Plättchenkonzentrat nach Thrombozytapherese mit periodischer Trenngrenzenposition wurde im FACScan mit 139,4 Leukozyten pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat ermittelt. Parallel dazu wurden in der modifizierten Nageotte-Kammer 93,2 Leukozyten pro Mikroliter Plättchenkonzentrat gezählt.

Der extrem hohe Ausreißer bei periodischer Trenngrenzenposition wurde sofort nach Erhalt des Ergebnisses überprüft, in dem die Messungen am Durchflußzytometer bzw. die Zählung der entsprechenden Probe in der Nageotte-Kammer mehrfach wiederholt wurde. Das Ergebnis blieb unverändert.

Als möglicher Fehler käme auch der Zeitpunkt der Messung in Betracht. Allerdings fanden die durchflußzytometrischen Messungen sofort nach Inkubation der Proben mit beads und Antikörpern bzw. die Zählung der Leukozyten in der Nageotte-Kammer unmittelbar nach Sedimentation der Zellen in der Zählkammer statt.

Um Überlagerungen der Leukozyten oder eine ungleichmäßige Verteilung der Leukozyten (bei höheren Zellzahlen) auszuschließen, hätte eine stärkere Verdünnung für die Probenanalyse gewählt werden können.

Diese Möglichkeit wurde für die vorliegende Arbeit nicht genutzt. Es gilt auch zu bedenken, daß mit steigender Verdünnung sich auch der methodische Fehler vergrößert hätte.


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Prinzipiell zeigten sich am Blutzellseparator FRESENIUS AS 104 während der Apheresen mit periodischer und konstanter Trenngrenzenposition keine wesentlichen auf eine Fehlfunktion hinweisenden Alarmmeldungen, so daß der hohe Ausreißer mit der Apherese an sich nicht erklärbar wird.

Auf der Ebene der Spender ließ sich nur ermitteln, daß für einige Thrombozytapheresekonzentrate mit hoher Leukozytenkontamination (konstante Trenngrenzenposition) bereits die entsprechenden Leukozytenwerte im Spenderblut an der oberen Grenze (10,1 bis 10,5 x 109 pro Liter Blut) [74] der Bedingungen für Zytapherese-Spender lagen.

ZEILER et al. [91] berichteten allerdings in ihrer Studie, daß keinerlei Korrelation zwischen dem Leukozytenwert im Spenderblut und der Leukozytenkonzentration im Thrombozytenkonzentrat nachgewiesen werden konnte.

In der vorliegenden Arbeit gibt es weiterhin einige Thrombozytapheresekonzentrate (bei konstanter Trenngrenzenposition) mit hoher Leukozytenkontamination, die mit einer im Vergleich relativ kurzen Apheresedauer von 52 Minuten bis 60 Minuten hergestellt wurden. Während ZEILER et al. [91] den Zusammenhang zwischen einer Steigerung der Separationsgeschwindigkeit und einer damit verbundenen Erhöhung der Leukozytenkontamination in den Thrombozytenkonzentraten verneinen, sehen PACHMANN et al. [59] sehr wohl einen Zusammenhang zwischen einer längeren Apheresedauer und einer Senkung der Leukozytenkontamination in den Plättchenkonzentraten.

Für den bei periodischer Trenngrenze im FACScan ermittelten extrem hohen Leukozytenwert von 139,4 pro Mikroliter Thrombozytenkonzentrat läßt sich nur die Besonderheit ermitteln, daß der Hämatokrit-Wert im entsprechenden Spenderblut mit 38% an der unteren Grenze der Kriterien zur Spendertauglichkeit lag [74].

ZEILER et al. [91] schlußfolgerten in ihrer Studie allerdings, daß der Spender-Hämatokritwert keinerlei Einfluß auf die Separationsqualität des Plättchenkonzentrates hat.

Auch in der vorliegenden Arbeit ließ sich kein Zusammenhang zwischen hohen Leukozytenkontaminationen in den Thrombozytapheresekonzentraten und einem eher niedrigen Hämatokrit-Wert des Spenders nachweisen.

Zusammenfassend bleibt es unklar, warum nach Anwendung der periodischen Trenngrenze ein Wert der Leukozytenkontamination im Thrombozytenkonzentrat die obere Grenze des cill-Wertes so weit überschreitet.

Tabelle 10 zeigt zusammenfassend die wesentlichen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit.

Tabelle 10: Auswirkungen der Trenngrenzenposition(TG) auf die Plättchenausbeute (PLT), die Separationseffizienz (SE) und die Leukozytenkontamination (WBC) in den Thrombozytapheresekonzentraten (TE)

Konstante TG

Periodische TG

PLT x 1011 /TE

3,6

3,3

SE in %

48,0

43,3

WBC x 106 /TE (FACScan)

4,9

1,2

Es wird deutlich, daß die Trenngrenzenposition während der Thrombozytapherese am Zellseparator FRESENIUS AS 104 eine entscheidende Bedeutung für die Anzahl kontaminierender Leukozyten in den Thrombozytenkonzentraten sowie für die Größe der Plättchenausbeute und der Separationseffizienz besitzt.

Mit periodischer Trenngrenzenposition konnten signifikant niedrigere Leukozytenkontaminationen im Plättchenkonzentrat (1,2 x 106 Leukozyten pro Thrombozytenkonzentrat) als mit konstanter Trenngrenzeneinstellung (4,9 x 106 pro Plättchenkonzentrat) erzielt werden (Ergebnisse am FACScan).

Dagegen waren bei konstanter Trenngrenzenposition Plättchenausbeute und Separationseffizienz signifikant höher (3,6 x 1011 pro Thrombozytenkonzentrat und 48% Separationseffizienz vs. 3,3 x 1011 pro Plättchenkonzentrat und 43,3% Separationseffizienz bei periodischer Trenngrenzen-position).

Auch MOOG [45] untersuchte den Einfluß der Trenngrenzenposition während der Thrombozytapherese mit dem Zellseparator AS 104. In dieser Studie von MOOG [45] wurden anhand von sieben Protokollen verschiedene Trenngrenzeneinstellungen bei Thrombozyt-apheresen mit dem Zellseparator AS 104 bezüglich ihrer Zellkontamination, Thrombozyten-ausbeute und Extraktionseffizienzen untersucht.
Fünf von sieben Protokollen wurden mit verschiedenen, aber konstanten Trenngrenzen, zwei Protokolle mit periodischer Trenngrenzenposition (6 : 2 / >8 : 0 bzw. 5 : 3 / 8 : 0) durchgeführt.


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Bei peripheren Trenngrenzenpositionen (4 : 4 bzw. 5 : 3) wurden geringe Extraktionseffizienzen (28,8% bzw. 32,6%) und geringe Leukozytenkontaminationen (0,9 ± 1,9 x 106 WBC pro Konzentrat bzw. 0,3 ± 0,9 x 106 pro Plättchenkonzentrat) erzielt.
In der Arbeit von MOOG [45] stieg die Extraktionseffizienz auf 42,7% bei weniger peripherer Lage der Trenngrenzenposition (> 8 : 0), allerdings nahm die Leukozytenkontamination beträchtlich zu (117,9 ± 97,6 WBC pro Konzentrat).
In der beschriebenen Studie [45] waren die Leukozytenkontaminationen in den Thrombozytenkonzentraten bei periodischer Trenngrenzenposition am Zellseparator signifikant niedriger als bei konstanter Trenngrenze.
Bei periodischer Trenngrenzenposition von 6 : 2 / > 8 : 0 lagen sie im Mittel bei 0,3 ± 0,9 x 106 pro Thrombozytenkonzentrat, bei periodischer Trenngrenzeneinstellung von 5 : 3 / 8 : 0 sogar bei 0 x 106 Leukozyten pro Plättchenkonzentrat. Das ist ein Ergebnis, das deutlich unter der Leukozyten-kontamination bei periodischer Trenngrenzenposition in der vorliegenden Arbeit liegt (1,2 ± 5,7 x 106 Leukozyten pro Thrombozytenkonzentrat). Dabei ist anzumerken, daß in der Arbeit von MOOG [45] die Leukozytenkontaminationen in den Thrombozytenkonzentraten durch mikroskopisches Auszählen in der Neubauer-Kammer ermittelt wurden.

Da sich die Arbeit von MOOG [45] von der vorliegenden Untersuchung bezüglich Softwareversion, periodischer Trenngrenzenposition und Zählkammer unterscheidet, ist der exakte Vergleich beider Arbeiten nur schwer möglich.

Allerdings wird deutlich, daß die Trenngrenzenposition am Zellseparator Fresenius AS 104 einen Einfluß auf Leukozytenkontamination im Thrombozytenkonzentrat, Separationseffizienz und Plättchenausbeute besitzt.

Bei periodischer Trenngrenze werden die niedrigsten kontaminierenden Leukozyten-konzentrationen erreicht, wobei Separationseffizienz und Plättchenausbeute im Vergleich zu konstanter Trenngrenzenposition niedriger sind. Die sehr geringe und unterhalb des cill-Wertes liegende Anzahl kontaminierender Leukozyten bei periodischer Trenngrenzenposition in der Arbeit von MOOG [45] geht allerdings auf Kosten einer reduzierten Plättchenausbeute von im Mittel 3,0 ± 0,7 x 1011 pro Thrombozytenkonzentrat (vorliegende Arbeit: 3,3 ± 0,7 x 1011 Plättchen pro Konzentrat) und den bereits besprochenen, im Vergleich geringen, Separationseffizienzen von 36% bzw. 39%.

MOOG et al. [48] veröffentlichten auch ein Abstract zum Einfluß der Trenngrenzenposition am Blutzellseparator Fresenius AS 104 auf Separationseffizienz und Zellkontamination in Thrombozytenkonzentraten. Unter Standardbedingungen (Blutfluß 50ml/min; 3500 ml Blutvolumen; 1900 U/min) wurden drei verschiedene Separationsprotokolle mit konstanter Trenngrenze und ein Separationsprotokoll mit alternierender Trenngrenzenposition durchgeführt. Die genaue Lage der alternierenden Trenngrenze wurde von den Autoren nicht angegeben.


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Die Autoren [48] konnten die niedrigsten Leukozytenkontaminationen ebenfalls in Plättchenkonzentraten bei alternierender (und nicht genannter) Trenngrenzenposition am Zellseparator Fresenius AS 104 erreichen. Die Leukozytenkontamination lag bei 0,3 x 106 pro Plättchenkonzentrat.

Im Vergleich zu den Protokollen mit der konstanten Trenngrenzenposition von 6 : 2 bzw. 7 : 1 reduzierte sich die Leukozytenkontamination bei alternierender Trenngrenze um den Faktor > 10.

In dieser Studie von MOOG et al. [48] ist es dabei gelungen, bei alternierender Trenngrenzen-position Separationseffizienzen zu erreichen, die auf der Höhe derer mit konstanter Trenngrenzen-position liegen (37,8% bzw. 39,4% bei konstanter Trenngrenzenposition vs. 39,1% bei periodischer Trenngrenzenposition).

Im Vergleich zur vorliegenden Arbeit (48,8% bei konstanter und 43,3% bei periodischer Trenngrenzenposition) liegen die Separationseffizienzen in der Studie von MOOG et al. [48] deutlich niedriger.

Der Vergleich von Separationseffizienzen ist allerdings problematisch. So geht aus einer Studie von KAUTZ et al. [32] hervor, daß sich auch die Verwendung unterschiedlicher Software auf die Separationseffizienz auswirken kann (bei MOOG [45] Software-Version 4.416 vs. 4.7. für die vorliegende Arbeit).

KRETSCHMER und ROSSA [35] zeigten, daß die Separationseffizienz auch von der Zentrifugengeschwindigkeit abhängig ist. Sie bezeichneten die Zentrifugengeschwindigkeit als die wichtigste Variable bei Optimierung der Thrombozytapherese mit dem Zellseparator AS 104. KRETSCHMER und ROSSA [35] beobachteten bei einer Zentrifugengeschwindigkeit von 1900 UpM und einem Blutfluß von 50 ml/min Extraktionseffizienzen von ca. 60%, bei einer Thrombozytenausbeute von 3,5 bis 3,8 x 1011 Thrombozyten pro Plättchenkonzentrat und Leukozytenkontaminationen um 1 x 107 pro Thrombozytenkonzentrat.

PACHMANN et al. [59] hingegen sehen den Blutfluß als eigentliche entscheidende Größe für die Separationseffizienz.

Schließlich zeigt die Studie von KRETSCHMER und ROSSA [35], daß auch interapparative Unterschiede auftreten können, selbst bei Verwendung von Thrombozytapheresegeräten identischen Typs und gleichen Separationsprotokollen.

Für die vorliegende Arbeit ist zu berücksichtigen, daß hierbei der Einfluß der Trenngrenzen-positionen auf Leukozytenkontamination in Plättchenkonzentraten, Plättchenausbeute und Separationseffizienz untersucht wurde.


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HARTH et al. [25] haben am Blutzellseparator Fresenius AS 104 insgesamt 25 Thrombozytapheresen mit periodischer Trenngrenzenposition (nicht genauer bezeichnet) durchgeführt und ermittelten Leukozytenkontaminationen zwischen 1 x 106 und 5 x 106 pro Thrombozytenkonzentrat in der modifizierten Nageotte-Kammer.

Dieses Ergebnis, das im Rahmen des cill-Wertes liegt, ist - abgesehen von dem einen Ausreißer bei periodischer Trenngrenzenposition - vergleichbar mit den in der vorliegenden Arbeit gewonnen.

ULRICH und KALB [78] untersuchten Einflüsse von periodischem Wechsel der Trenngrenzen-position nicht nur während der Sammelphase, sondern auch während der Transferphase (Sammelphase: 3 : 5 / 5 : 3 ; Transferphase: 5 : 3 / 6 : 2).

Mit diesem Protokoll konnten äußerst geringe Leukozytenkontaminationen von 0,09 ± 0,15 x 106 pro Plättchenkonzentrat, eine sehr hohe Separationseffizienz von 48,9 ± 4,6% und eine ansehnliche Plättchenausbeute von 5,31 ± 0,45 x 1011 pro Konzentrat erzielt werden.

Aus dieser Arbeit wird deutlich, daß mit Hilfe von Veränderungen der Trenngrenzenposition nicht nur minimale Leukozytenkontaminationen erreicht werden können, sondern daß auch bei Minimierung der Leukozytenkontamination in Plättchenkonzentraten unterhalb des cill-Wertes nicht mehr auf gleichzeitig hohen Plättchengehalt im Konzentrat und eine hohe Separationseffizienz verzichtet werden muß.

ULRICH und KALB [79] veröffentlichten ein weiteres Abstract über ihre Untersuchungen zur Beeinflussung der Sammelphase bei Thrombozytapherese mit periodischer Trenngrenzenposition (4 : 4 / 6 : 2) am Blutzellseparator FRESENIUS AS 104. Sie entwickelten eine spezielle Software, um den Einfluß einer verkürzten wie auch verlängerten Sammelphase auf Plättchenertrag und Leukozytenkontamination in Thrombozytapheresekonzentraten zu ermitteln.

ZINGSEM et al. [93] arbeiteten mit dem neuen Zellseparator Fresenius AS TEC 204, der seit 1995 im Einsatz ist. Das Gerät, daß mit dem vom Zellseparator AS 104 bekannten Sets und einer auf der Softwareversion 4.7. (wie in der vorliegenden Arbeit) vorliegenden Steuerung arbeitet, wurde von ZINGSEM et al. [93] mit verschiedenen Trenngrenzeneinstellungen erprobt. Die niedrigste mediane Leukozytenkontamination konnte unter Nutzung der variablen Trenngrenze erreicht werden (0,1 x 106 Leukozyten pro Plättchenkonzentrat). Eine sogenannte Sammeleffektivität im Median von 49% wurde von den Autoren angegeben.

Auch MOOG und MÜLLER kamen in ihrer Studie [49] zu dem Ergebnis, daß sich mit dem Zellseparator AS TEC 204 bei Verwendung des Programms mit alternierender Trenngrenze (nicht genau bezeichnet) die Leukozytenkontamination in den Thrombozytenkonzentraten deutlich reduzieren läßt (0,03 ± 0 x 106 Leukozyten pro Plättchenkonzentrat).


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In den acht Separationen mit dem Programm mit alternierender Trenngrenzenposition konnte eine Plättchenausbeute von 3,2 ± 0,7 x 1011 pro Konzentrat erreicht werden, bei einer Separationseffizienz von 40,4% ± 6,0%.

Werden die Thrombozytenkonzentrate zum Zweck der Leukozytendepletion nach ihrer Herstellung gefiltert, reduzieren Leukozytenfilter der dritten Generation den Leukozytengehalt in Plättchenkonzentraten um zwei bis vier log-Stufen (> 99 - 99,99 % der Leukozyten werden entfernt). Der Thrombozytenverlust nach Filterung beträgt etwa 5 bis 20% [83, 28].

Bei MOOG et al. [47], die einen integrierten Filter für den FRESENIUS-AS-104-Blut-zellseparator testeten, um leukozytendepletierte Thrombozytapheresepräparate mittels geschlossener Einmalsysteme herstellen zu können, betrug der Thrombozytenverlust nach Filterung auch ungefähr 15%.

Auch ZEILER und KRETSCHMER [90] untersuchten in ihrer Studie den integriertem Leukozyten- bzw. Adhäsionsfilter BIOFIL P plus, Fresenius, für den Zellseparator FRESENIUS AS 104. Sie kamen zu dem Ergebnis, daß neben einer Leukozytenreduktion durch Filtration von durchschnittlich 98,5%, der Thrombozytenverlust nur 8,5% betrug, also niedriger als vielfach beschrieben wurde.

In der vorliegenden Arbeit wurde bei der Modifikation der Thrombozytapherese mit periodischer Trenngrenze der Thrombozytenertrag und die Separationseffizienz um etwa 10% gegenüber dem Standardverfahren mit konstanter Trenngrenze gesenkt. Dieser Thrombozytenverlust relativiert sich allerdings angesichts der Tatsache, daß die notwendige Filterung zur Leukozytendepletion des Standard-Thrombozytapheresekonzentrats mit konstanter Trenngrenze ebenfalls zu einem Thrombozytenverlust in dieser Größenordnung führt.

Die Einstellung der Trenngrenzenposition bei der Thrombozytapherese mit dem Zellseparator FRESENIUS AS 104 wirkt sich in der Praxis also vor allem auf die Leukozytenkontamination der Thrombozytenkonzentrate und die Separationseffizienz aus.

Sollte sich durch weitere Modifikationen am Zellseparator die Leukozytenkontamination regelmäßig unter 1 x 106 pro Transfusionseinheit senken lassen, kann auf eine zusätzliche Leukozytendepletion der Thrombozytenkonzentrate vollständig verzichtet werden.

Am Universitätsklinikum Charité gibt es mittlerweile eine komplette Einführung des Programms mit periodischer Trenngrenzenposition am Zellseparator FRESENIUS AS 104, um die Leukozytenkontamination in den Thrombozytapheresekonzentraten regelmäßig unter 1 x 106 pro Transfusionseinheit zu senken.


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22.10.2003